N-glycans 배열 개발 및 HIV 항 체의 항 암 치료 효소 합성 프로 파일링

본 방법론의 전반적인 목표는 산화알루미늄이 코팅된 유리 슬라이드 위에 새로운 글리칸 마이크로어레이를 구축함으로써, HIV 항체의 헤테로그리칸 결합을 검출하기 위한 N-글리칸 합성용 모듈형 화학-효소적 접근법을 개발하는 것입니다. 이 방법은 향후 발전을 위해 세포-바이러스 특이적 글리칸을 식별하는 당생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 약한 결합을 검출하고, HIV 환자 유래 항체와 같은 단백질에 결합하는 당 혼합물을 식별할 수 있다는 점입니다.

이 기술의 함의는 인플루엔자 감염 진단으로 확장되는데, 이는 인간 기도 상피 세포에 시알산 분해 효소가 발현되며 증상과 함께 흔히 나타나기 때문입니다. 따라서 glycoarray는 야생형 서브타입의 특이성을 결정하는 이상적인 도구가 될 것입니다. 이 방법은 HIV 항체의 글리칸 특이성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 표면에 프린팅된 인간 특이적 혈청 항원에 대한 인간 혈청 항체의 결합 패턴에 기반한 다양한 암 진단과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면, 미리 준비한 glycan 2-5 µmol을 5 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣습니다. 플라스크에 자석 교반자를 넣고 고무 격막으로 밀봉합니다. 플라스크에 갓 건조시킨 DMF 400 µL와 phosphonic acid 링커 10-25 µmol을 첨가합니다.

그 다음, 반응 혼합물을 800 rpm으로 5시간 동안 교반합니다. 반응이 완료되면, 5~10 millibar의 진공 압력과 40 °C 조건에서 회전 증발기를 사용하여 용매를 증발시킵니다. 이후, 건조된 반응 혼합물을 0.5 mL의 물에 녹여 폴리아크릴아마이드 겔 베드 상단에 로딩합니다.

물을 사용하여 생성물을 용리시키고 1~2 mL 분획으로 수집합니다. TLC로 수집된 분획을 확인하려면, 각 분획을 TLC 플레이트에 점적하고 플레이트를 0.25 M Cerium Ammonium Molybdate에 담급니다. 염색된 플레이트를 핫플레이트로 가열하여 생성물을 시각화합니다.

분획물이 포함된 생성물을 혼합하고 용액을 동결 건조하여 원하는 생성물을 흰색 분말 형태로 얻습니다. 그다음, 건조된 생성물을 2 mL의 물에 녹이고 수산화 팔라듐(Palladium Hydroxide)을 첨가합니다. 플라스크에 수소가 충전된 풍선을 연결하고 수소 분위기 하에서 반응 혼합물을 800 rpm으로 15시간 동안 교반합니다.

반응이 완료되면, 혼합물을 Celite Bed로 여과하고 2 mL의 메탄올과 2 mL의 탈이온 증류수로 세척합니다. 그다음, 300 mbar의 진공 압력과 40 °C 조건에서 회전 증발기를 사용하여 용매를 증발시킵니다. 이후, 조혼합물을 약 1 mL의 물에 녹여 polyacrylamide gel bed 상단에 로딩합니다.

물로 생성물을 용출하고 1~2 mL 분획을 수집합니다. 생성물이 포함된 분획들을 합친 후, 용액을 동결 건조하여 원하는 생성물을 흰색 분말로 얻습니다. 생성물이 건조되면, Deuterium Oxide를 용매로 사용하여 NMR 및 질량 분석법으로 특성을 분석합니다.

표면 양극산화 처리를 위해, 온도 조절 인큐베이터를 4 °C로 설정하십시오. 그런 다음, 미리 준비한 0.3 M 옥살산 수용액을 마그네틱 바가 들어 있는 500 mL 비커에 옮기십시오. 10 cm 길이의 백금 봉을 음극으로 하여 용액에 넣으십시오.

양극 산화 과정 전반에 걸쳐 옥살산(oxalic acid)을 300 rpm으로 계속 교반하십시오. 실험실 트레이서 소프트웨어에서 설정 버튼을 클릭한 다음, 기능 선택에서 Sweep Voltage를 클릭하십시오. 시작 및 종료 전압을 25.8 volts로 설정하십시오.

포인트 수를 100으로, 컴플라이언스를 1로, 스윕 지연 시간을 1200 milliseconds로 설정하십시오. 그런 다음 확인을 클릭하십시오. 알루미늄 코팅된 유리 슬라이드를 음극 방향으로 향하게 하여 고정하십시오.

테스트 실행 버튼을 클릭하고 현재 측정값을 관찰하십시오. 표면 양극 산화 후, 유리 슬라이드를 2차 증류수로 충분히 세척하고 질소 가스로 건조시키십시오. 유리 슬라이드를 추가로 사용할 때까지 30% 상대 습도 챔버에 보관하십시오.

제작을 위해, 모든 일가 글라이칸(monovalent glycans)을 10 mM 농도로 에탄올 글리콜에 녹여 100 µL 용액으로 준비합니다. 프린팅 버퍼를 사용하여 글라이칸 용액을 희석해 100 µM 용액으로 만듭니다. 헤테로리간드 연구(Heteroligand Study)를 위해, 각 글라이칸 용액 5 µL에 MAN-5 글라이칸 5 µL를 첨가합니다.

준비된 글리칸을 마이크로어레이 프린팅 단계를 위해 384웰 마이크로플레이트로 옮깁니다. 프린터 어레이 테크에 마이크로플레이트를 삽입한 후, 로봇 핀을 사용하여 알루미늄 코팅 유리 슬라이드 각각에 글리칸 용액 0.6 nanoliters를 분사하여 마이크로어레이를 프린팅합니다. 다음으로 3% BSA가 포함된 PTSB 버퍼와 1차 항체 PG-9 70 microliters를 준비합니다.

그런 다음 암실에서 3% BSA가 포함된 PBST 버퍼와 120 µL의 2차 형광 표지 항체 Donkey Anti-human Immunoglobulin G를 준비합니다. PG9와 2차 형광 표지 항체를 1:1 비율로 혼합합니다. 이후 미리 혼합된 항체들을 4 °C에서 30분 동안 배양합니다.

배양 후, 16개의 웰로 나누어진 슬라이드 배양 챔버에 알루미늄 코팅 유리 슬라이드를 장착합니다. 미리 혼합된 항체 100 µL를 글리칸 어레이에 옮깁니다. 4 °C에서 16시간 동안 배양한 후, 피펫을 사용하여 글리칸 어레이에서 혼합 항체를 제거하고 슬라이드 배양 챔버를 제거합니다.

슬라이드 글라스를 PBST 버퍼와 탈이온수로 세척하십시오. 그 다음, 슬라이드 글라스를 2000 ×g에서 원심 분리하여 건조시킵니다. 이어서, 마이크로어레이 이미지 분석 소프트웨어를 실행하십시오.

배열된 특징 부위가 아래로 향하도록 하여 유리 건조 슬라이드를 어레이 스캐너에 삽입하십시오. 설정 메뉴를 클릭하십시오. 이미지 해상도를 픽셀당 5 µm로 설정하십시오.

파장을 635 nm로 설정하고 PMT를 450으로, 출력을 100%로 설정하십시오. 스캔 버튼을 클릭하여 슬라이드 이미징을 시작합니다. 마지막으로 파일 아이콘을 클릭하여 스캔 이미지를 이미지 분석을 위한 TIF 형식으로 저장하십시오. 본 연구에서는 모듈형 화학 효소 전략을 사용하여 광범위한 N-글리칸(N-Glycans)을 합성하였습니다.

해당 전략의 유효성을 입증하기 위해 화학효소적 방법으로 이분지 등척성 구조를 합성하였습니다. 이당류 1에 대해 효소적 갈락토실화를 수행한 후 삼당류 2를 푸코실화하여 목적하는 사당류 3을 얻었습니다. 빌딩 블록 2와 3의 퍼사틸화 및 환원 말단 수정을 통해 목적 분자인 4와 5를 얻었습니다.

삼당류 6의 모듈 4에 대한 입체선택적 3가지 O-당화 반응을 통해 육당류 7을 얻었습니다. 보호기 제거 후 모듈 5와 반응시켜 십당류 9를 생성하였습니다. 전체 보호기 제거를 통해 글리칸 10을 얻었으며, 이는 NMR 및 질량 분석법으로 분석되었습니다.

환원단에 펜틸아민(Pentylamine) 꼬리가 포함된 글리칸을 포스폰산 링커로 수식한 후, 포스피니드 화학을 통해 알루미늄 유리 코팅 표면에 부착하였습니다. HIV-1 광범위 중화 항체 PG9의 글리칸 특이성을 호모 및 헤테로 글리칸 어레이를 사용하여 스크리닝함으로써, HIV1 PG120 표면의 V1/V2 루프에 있는 인접한 헤테로 글리칸과의 상호작용을 최초로 입증하였습니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 글리칸 고정부터 베타 분석까지 24시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, Glycan 10의 경우 새로 양극 산화 처리된 알루미늄 코팅 유리 슬라이드를 사용해야 함을 유념하는 것이 중요합니다. 이 절차의 기반은 임상병리사 슬라이드입니다. 관심 있는 탄수화물과 단백질 사이의 결합 상호작용을 정량화하기 위해 체상수를 결정할 수 있습니다.

이 기술이 개발된 이후, 연구자들은 케냐의 감염성 질환에서 탄수화물의 역할을 더 잘 이해하고 질병에 대응하는 새로운 치료법을 개발하는 기틀을 마련할 수 있었습니다. 독성 물질을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 실험을 수행할 때는 항상 보호복, 보안경 및 마스크 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.