Name: 신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 배우세요 신생아 생쥐 척수 신경 세포 분리 및 배양 기법으로 신경 생물학 연구에 활용 가능한 건강한 뉴런을 얻는 방법을 익히세요. 이 기술은 기계적 및 효소적 분리를 통해 반복 가능한 결과를 제공합니다.

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이 절차에서 동물의 보살핌과 치료는 콜로라도 대학의 동물 동물 관리 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)의 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 솔루션 준비 <ol><li> 표 1 에서와 같이 적절한 온도에서 모든 용액을 준비하고 보관하십시오. </li></ol> 2. 코팅 웰 및 슬라이드 참고 : 뉴런은 플라스틱이나 유리 표면에 잘 부착되지 않습니다. <ol><li> 뉴런을 분리하기 하루 전에 0.5 ML의 폴리 -D- 리신 (PDL; 표 2 )으로 멸균 된 24- 웰 배양 플레이트의 웰을 코팅하고 층류 후드 O / N에 남겨 둡니다. 참고 : 선호하는 방법은 24 웰 플레이트를 사용하고 주변 웰에서의 증발이 더 가속화되어 일치하지 않는 결과를 초래하는 경향이 있으므로 중앙 웰만 코팅하는 것입니다. 또한 유리 슬라이드는 이전에 우물 안쪽에 놓을 수 있습니다.o 코팅. 뉴런은 코팅 된 유리 슬라이드에 부착되며 나중에 추가 현미경 이미징을 위해 제거 할 수 있습니다 . </li><li> 격리 당일에 우물에서 PDL을 제거하십시오. 남아있는 물을 제거하기 전에 몇 분 동안 멸균 수로 씻어서 1 시간 동안 건조시킵니다 (아래 참조). </li><li> 건조 후 슬라이드를 라미닌으로 코팅하십시오 ( 표 2 ). 참고 : 약 10 μL의 laminin (10 μg / μL)로 멸균 된 24-well plate의 각 well을 코팅 할 수 있습니다. 이것은 전체 웰을 덮기 위해 340 μL의 배지 (총 부피 : 350 μL)와 혼합됩니다. 이것을 문화 후드에서 실온에서 2 시간 동안 놓은 다음 세포를 코팅하기 전에 대기음을 둡니다. </li></ol> 3. 척추 수확 참고 : 모든기구는 멸균을 위해 고압 증기 멸균해야합니다 (135 ° C 및 30 psi에서 4 x 7 분주기). <ol><li> 이소 플루 란 (isoflurane)이있는 챔버에서 1-3 일 된 C57BL / 6 마우스를 안락사하십시오. 기다림30 초 후에 움직이지 않고 다리를 꼬집고 응답이 없음을 확인합니다. </li><li> 머리를 몸체에서 분리하려면 가위를 사용하십시오. </li><li> 등받이가 사용자를 향하도록 절차 테이블에서 뒷다리 또는 꼬리와 팔을 안정시킵니다. </li><li> 구부러진 홍채 가위로 피부를 자릅니다. </li><li> 엉덩이 위의 요추 부위에서 척수를 잘라 내고 흉부의 양측을 절단하여 몸에서 분리하십시오. 참고 : 이것은 다른 장기에 대한 부주의 한 손상을 피하기 위해 내장 기관에서 척수를주의 깊게 절개해야합니다 ( 그림 1a ). </li><li> 과량의 조직을 제거하는 0.2 μm의 필터 멸균 인산염 - 버퍼 식염수 (PBS) 5 ML을 포함하는 3 X 10cm 페트리 접시 10 초 동안 연속적으로 씻으십시오. </li><li> 척주의 꼬리 끝에 5 ML의 필터 멸균 PBS로 가득 22 G 바늘과 주사기를 삽입하고 cranially 플러시, 코드를 허용 to 네 번째 배양 접시로 빠져 나간다 ( 그림 1b ). </li><li> 얼음 위에서 HABG ( 표 1 ) 5 ML과 15 ML 관에서 척수를 수집합니다. 척수가 부러지지 않도록주의하십시오. </li><li> 깔개에있는 각 강아지에 대해 3.1-3.8 단계를 반복합니다. 참고 : 이상적으로이 과정은 건강한 신경 세포의 분리를 보장하기 위해 척수 당 30 분 미만이 소요됩니다. </li></ol> 4. 고립 뉴런 참고 : 다음 단계는 층류 후드에서 수행해야합니다. 기본적인 멸균 기술에 익숙해야합니다. <ol><li> 조직 채집 <ol><li> 척수가 들어있는 튜브를 가볍게 흔드는 다. </li><li> 튜브에서 조직을 60mm 유리 페트리 접시에 넣고 면도날로 주사위를 굴려 ~ 0.5mm 크기의 미세 조각을 만듭니다. </li><li> HABG 5 ML가 들어있는 15 ML 튜브에 와이드 보어 피펫으로 조직을 전송하십시오. </li><li> 그것을세포가이 온도에서 평형을 유지하도록 30 분 동안 30 ℃의 수조에서. 세포를 쉐이커에 방치하여 유체에 부유되도록하십시오. 참고 :이 단계는 얼음에서 소화 매개체로 세포가 옮겨지는 것을 막기 위해 수행됩니다. 세포를 30 ° C로 유지하면 37 ° C에서 신진 대사가 증가하는 것과 관련된 세포 사멸을 감소시키는 데 도움이됩니다. </li></ol></li><li> 소화 매체를 준비하십시오 ( 표 1 ). </li><li> 밀도 구배를 준비하십시오 (표 1). <ol><li> 표 1에 나와있는 것처럼 4 개의 개별 15 mL 튜브에 4 개의 각 층을 준비하십시오. </li><li> 새로운 15 mL 튜브에 각 층의 1 mL를 넣으십시오. 하단의 레이어 1부터 시작하여 상단의 레이어 4에 도달 할 때까지 순차적으로 추가합니다. 추가하는 동안 레이어를 방해하지 마십시오. </li></ol></li><li> 2.2 단계에서 PDL 코팅 판을 씻으십시오. 남아있는 물을 제거하기 전에 몇 분 동안 멸균 수로 씻으십시오.1 시간 동안 건조시킨다. </li><li> 조직을 소화 배지에 옮기십시오. <ol><li> 30 ° C의 쉐이커 수조에서 조직 함유 튜브를 제거하고 몇 분 동안 침전되도록하십시오. </li><li> 37 ° C 수조에서 소화 매체 튜브를 제거하고 leur-lock 주사기에 대기음을 내십시오. </li><li> 조직 함유 튜브에서 과량의 HABG를 기음합니다. </li><li> 시린지에 leur-lock 0.2 μm 필터를 사용하여 조직 함유 튜브에 소화 물질을 첨가하십시오. </li><li> 튜브를 30 ° C의 수 욕조에 30 분간 놓습니다. 세포가 유체에 매달려있을만큼 충분히 흔들 리도록하십시오. 참고 : 소화제에 세포를 너무 오랫동안 보관하지 않거나 온도가 너무 높아져 과도한 소화로 이어져 조직이 젤라틴 혼합물에 부유하게 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 이 기간 동안 단계 2.3에서와 같이 라미닌을 코팅하십시오. </li> &lt;trituration을 수행하십시오 ( 즉 , 세포를 조직에서 분리하는 것). <ol><li> 흔들어서 30 ° C 수 욕조에서 튜브를 제거하고 몇 분 동안 침전되도록하십시오. </li><li> 과량의 소화 매질을 대기음. </li><li> HABG 2 ML에 휴지를 일시 중지합니다. </li><li> 좁은 구경 피펫을 사용하여 45 초 동안 10 배로 씹습니다. 참고 : 이것은 아마도 가장 중요한 단일 단계 일 수 있으며 제대로 수행되지 않으면 생산량을 크게 줄일 수 있습니다. <ol><li> 피펫으로 조직을 대기음 즉시 내용을 다시 비우십시오. </li><li> 실용적인 생산량을 현저히 감소 시키므로 공기 주입을 피하십시오. 참고 : 이상적인 피펫은 9 &quot;유리 피펫입니다 피펫의 끝 부분은 거친 표면을 부드럽게하기 위해 폴리싱해야합니다. 그런 다음 클로로포름에 디클로로 디메틸 실란 (DMDCS)의 1:20 용액에 넣고 실리콘 처리해야합니다. / N 피펫을 꺼내어 공기를 건조시킨 다음,살균을 위해 고압 증기 멸균해야합니다. 주의 사항 : DMDCS와 클로로포름은 매우 인화성이 있으므로 실리콘 연소는 흄 후드에서 수행해야합니다. </li></ol></li><li> 상층 액 2 mL를 기증하고 &quot;collection&quot;이라고 표시된 새 15 mL 튜브에 넣으십시오. </li><li> 4.7.3-4.7.5 단계를 두 번 더 반복하십시오 (세포 수집 튜브 끝에 6 mL가 있어야합니다). </li><li> 수집 튜브 내용물을 4.2 단계에서 준비한 그래디언트 튜브로 천천히 옮겨 그라데이션 중단을 피하십시오. </li></ol></li><li> 이 시점에서, 냉장고에서 이전에 준비 neurobasal 매체 ( 표 1 )를 제거하고 37 ° C 목욕에서 따뜻하게 수 있습니다. </li><li> 뉴런을 정화하십시오. <ol><li> 800 xg 및 22 ° C에서 15 분 동안 그라디언트 튜브를 원심 분리하십시오. </li><li> 피펫으로 원하는 층을 채취하고 ( 그림 2 ) 새로운 15 mL 튜브에 넣으십시오. 가장 높은 순도의 신경( 즉 &gt; 90 %), 층 3을 수집하십시오.보다 적은 순도 ( 즉, &gt; 70-80 %)로 더 많은 수율을 얻으려면 2 층과 3 층을 수집하십시오. </li><li> 새로 수집 된 층에 HABG 5 ML을 추가하여 밀도 기울기를 희석. </li><li> 22 ° C에서 2 분 동안 200 XG에서 원심 분리하십시오. </li><li> 뜨는 물을 버리고 HABG 5 mL에 다시 부어 넣고 펠렛을 가볍게 쳐서 세포를 부순다. </li><li> 22 ° C에서 2 분 200 XG로 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 버리고, neurobasal 매체의 3 ML에 resuspend, 그리고 세포를 resuspend에 펠렛을 가볍게 두드리십시오. </li></ol></li><li> 세포를 센다. <ol><li> neurobasal 매체의 세포와 솔루션의 10 μL을 가지고, Trypan 블루 10 μL와 섞는다. </li><li> 이 혼합물의 10 μL를 유리 세면기에 넣으십시오. </li><li> 표준 유리 계수 챔버를 사용하여 네 4 x 4 사분면 각각의 셀 수를 계산합니다. 카운트 된 셀 (n), 멀티 셀 모두 추가(희석 인자)를 곱하고, 4로 나눈 값 (4 분면의 수), 3 (신경 매체의 부피)을 곱하고, 10 4 를 곱하여 세포 / mL의 세포 농도를 구한다. <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55856/55856eq0.jpg" /></li></ol></li><li> 배양 판에 세포를 뿌린다. <ol><li> neurobasal 매체 1 ML 300,000 세포로 세포 현탁액을 희석. 참고 : 위의 단계에서 얻은 세포의 농도를 기반으로 추가 neurobasal 매체는 3 * 10 5 세포 / ML의 최종 농도를 얻기 위해 추가됩니다. 방정식은 C 1 V 1 = C 2 V 2 이고, 여기서 C 1 은 수확에서 얻은 세포의 초기 농도이다. V1은 3 mL; C 2 는 상기 논의 된 바와 같이 3 * 105 세포 / mL이다. 방정식은 V 2에 대해 풀립니다. 솔루션에 세포의 총 볼륨을 만드는 데 필요한 neurobasal 매체의 볼륨을 추가V 2 . </li><li> 부드럽게 흔들어 용액에 세포를 분배하고 코팅 24 잘 접시에 각 잘 1 ML을 추가합니다. </li></ol></li></ol>

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이 기술은 척수 신경 세포의 안정적인 배양을 가능하게합니다. 기술 숙달이 완료되면 완료하는 데 약 3.5 시간이 걸립니다. 우리는 약 4 시간 동안 2 마리의 분리 된 새끼 (총 16 마리의 마우스)로부터 뉴런의 분리를 수행 할 수있었습니다. 실행 가능성의 핵심 단계는 쥐에게서 능숙하게 척수를 추출 할 수 있다는 것입니다. 항복은 여러 개의 웰을 플레이 팅하고 다양한 조건 하에서 뉴런을 테스트하는 능력을 허용합니다. 우리는 성숙 후 뉴런을 치료하고 웨스턴 블랏 분석을 사용하여 단백질 발현을 신뢰할 수있게 평가할 수있었습니다. 또한, 뉴런 첨부 파일에 대한 우물 내부에 유리 슬라이드를 사용하면 뉴런의 더 얼룩 분석을 허용합니다. 이 절차는 배아 조직 및 관련 노동 강도를 필요로하지 않는다는 점에서 유리하다. 또한, 적절한 척추 조직을 얻기 위해 성인 척수를 사용할 필요가 없습니다.e 신경 세포 격리. 이것은 성인 생쥐에서 볼 수 있듯이 뉴런 생리학에서 나이 합성의 요인을 방지합...

<html> 척수 병리학을 이해하기 위해서는 거시적 인 수준과 미세한 수준 모두에서 다양한 모델을 사용해야합니다. 대형 및 소형 동물 모델 1 , 2 , 3 은 척수 질환 및 상해에 대한 생체 내 조사에 사용됩니다. 생체 내 에서 이러한 문제 를 연구하는 것은 장점이 있지만, 척수 분석은 전체 척수 균질 또는 조직 섹션 4 로 제한됩니다. 이것은 상주 뉴런과 주변 glia 사이의 척수에서 특정 반응과 표적을 격리하려고 할 때 약간의 모호성을 만듭니다. 유 전적으로 조작 된 생쥐가 증가함에 따라 세포 및 분자 수준에서 생물학에 대한보다 상세한 조사가 가능 해졌다. 따라서 신생아 마우스 모델이 여기에 사용 되어 시험 관내에서 척수 뉴런의 독특한 성질과 생물학적 특성을 연구 할 수 있습니다. 엔트 &quot;&gt; 체외에서 뉴런의 분리 및 유지 보수는 특히 간단하지 않습니다. 성인 설치류의 피질 조직에서 뉴런을 분리하기위한 기술이 상대적으로 풍부하여 고립 된 뉴런 ( 즉, 수백만 개 ) 대조적으로, 척수 조직으로부터의 뉴런의 수율은 부분적으로 조직의 질량이 더 적기 때문에 8 , 9 , 10 보다 낮다. 또한, 생쥐에서 신생아의 분리를위한 기술이 상대적으로 부족하다 척수 뉴런 및 기존 방법은 낮은 뉴런 수율 (수백) 또는 배아 마우스 10 의 고립을 요구 힘든 및 자원 무거운 기술에 의해 제한됩니다. 이 프로토콜에서 우리는신생아 생쥐의 척수에서 상당한 수의 뉴런을 비용 효율적이고 자원 효율적으로 격리 할 수있는 기술을 사용하십시오. 이전에 발표 된 기술에서 흔히 볼 수 있듯이 우리는 파파인을 효소 적 프로테아제로 사용하여 척수 조직에서 뉴런의 방출을 허용합니다 5 , 6 . 또한, 우리는 정제 된 세포 분리를 위해 밀도 구배를 사용하는데, 이는 이전에 효과가 6 , 10 인 것으로 나타났습니다. 세포가 배양되는 배지는 다를 수 있지만, 우리의 경험 및 이전에 발표 된 11에서 , 신선한 B27 배양 배지 보충 물은 뉴런 수명에 결정적인 것으로 입증되었다. 뉴런은 일반적으로 치료를 수행 할 수 있도록 최대 10 일 동안 실행 가능합니다.

<table><tbody><tr><td>Hibernate A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A1247501</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501</td></tr><tr><td>Hibernate A 마이너스 칼슘 - 500 mL</td><td>Brainbits</td><td>HA-Ca</td><td>http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/</td></tr> <tr><td>Glutamax 100X - 100 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>35050061</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079</td></tr><tr><td>B27 보충제 50X - 10 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 Papain, 동결건조 - 100 mg</td><td>Worthington</td><td>LS003119</td><td>http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html</td></tr><tr><td>Neurobasal A 매체 - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10888022</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td>15140122</td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 폴리-D-라이신(PDL) 하이드로브롬화물 - 5mg</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&region=US 마우스 라미닌 - 1mg</td><td>Thermo-Fisher</td><td>23017015</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015</td></tr><tr><td>Trypan Blue - 20mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>OptiPrep 밀도 그라디언트 매체 - 250mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>디클로로디메틸실란( DMDCS, 시그마 실리코트)</td><td>시그마-알드리치</td><td>440272-100ML</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&region=US 클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>288306-1L</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>유리 피펫 - 9"</td><td>시그마-알드리치</td><td>13-678-20C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>피펫 전구 - 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z186678-3EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&region=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1</td></tr><tr><td>BRAND&reg; &nbsp; 페트리 접시, 유리 - 60 x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455717-10EA</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&region=US 멸균 24-Well Cell Culture Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8812-100EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometer (glass counting chamber)</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-671-6</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716</td></tr><tr><td>유리 슬라이드 - 12mm 멸균 커버 유리 - 코팅되지 않은</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-1.5-Pre</td><td></td></tr><tr><td>http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm NeuN Rabbit 단클론 항체 - 100 &micro; L</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>파라포름알데히드(PFA)에 고정하고 5% BSA로 차단한 후, 12mm 커버슬립의 세포를 4°°C에서 18시간 동안 1:200으로 희석한 항체에서 배양했습니다. C</td></tr><tr><td>MAP-2 Mouse Monoclonal 항체 - 50 &micro; L</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td>파라포름알데히드에 고정하고 5% BSA로 차단한 후, 12mm 커버슬립의 세포를 4°C에서 18시간 동안 1:500으로 희석한 항체에서 배양했습니다. 씨</td></tr></tbody></table>

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

우리는 척수 신경 세포의 분리 및 배양에 대한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런은 신생아 C57BL / 6 생쥐에서 얻은 있으며 출생 후의 하루 1-3에 격리되어 있습니다. 일반적으로 하나의 번식 쌍에서 태어난 4-10 마리의 강아지가 한 실험을 위해 모여지고, 척수는 isoflurane으로 안락사 한 후에 각 마우스에서 개별적으로 수집됩니다. 척수가 해부 된 다음 척수가 기둥에서 빠져 나옵니다. 척수는 조직에서 방출되는 뉴런 및 다른 세포를 허용 효소 프로 테아 제에 대한 배달의 표면적을 증가시키기 위해 다음 minched 있습니다. 이어서 분쇄를 사용하여 세포를 용액으로 방출한다. 이 용액을이어서 농도 구배로 분획하여 용액 중의 여러 세포를 분리하여 뉴런을 분리시킨다. 하나의 깔짚 그룹에서 약 1-2.5 x 106 개의 뉴런을 분리 할 수 ​​있습니다. 그런 다음 뉴런을 접착제로 코팅 한 우물에 뿌린다적절한 성장과 성숙을 허용하는 rs. 뉴런은 성장 및 배양 배지에서 성숙에 도달하기까지 약 7 일이 걸리고 이후 치료 및 분석을 위해 사용될 수 있습니다.

이 기술을 사용하여, 단일 쓰레기 (4-10 새끼) 문화 플레이트에 시딩에 적합한 1-2.5 10 6 뉴런의 고립 수 있습니다. 일반적으로, 4-8 우물은 위에서 언급 한 농도 ( 즉 300,000 세포 / ML)에 뿌렸다. 그림 3 은 낮은 ( a ) 및 높은 ( b ) 배율 광학 현미경에서 문화에서 일주일 후이 농도에서 뉴런의 모습을 보여줍니다. 그러나, 우리는 또한 50 만 세포 / 웰 및 100,000 세포 / 웰만큼 낮은 농도로 세포를 배양 할 수 있었다. 높은 농도를 사용하면 영양 상태가 빨리 고갈되어 세포에 독성이있는 산성 환경으로 이끄면서 환경 조건에보다주의 깊게주의를 기울일 필요가 있습니다. 농도가 낮을수록 세포는 완전한 성숙에 이르지 못하며지지 세포의 과증식 (oligodendrocytes, microg...

이 연구는 WT 신생아 마우스에서 뉴런을 분리하는 기술을 제시합니다. 신생아 마우스에서 척수를주의 깊게 절개 한 다음 기계적 및 효소 적 절단을 통해 척수 조직에서 뉴런을 분리해야합니다.

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 실험에 사용할 수 있는 척수 뉴런을 반복적이고 일관되게 분리하는 것입니다. 이 방법을 통해 척수 뉴런의 생물학적 특성에 대해 더 깊은 통찰을 얻고, 다양한 스트레스 요인에 대한 뉴런의 반응을 이해할 수 있을 것으로 기대됩니다. 이 기술의 주요 장점은 상당한 수의 뉴런을 분리할 수 있어, 해당 뉴런들을 매우 다양한 실험에 활용할 수 있다는 점입니다.뉴런을 사멸시키지 않고 건강하게 분리하기 위해서는 뉴런을 조직으로부터 기계적으로 분리하는 trituration 단계에 숙달되는 시간이 필요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 가위를 사용하여 안락사시킨 생쥐 새끼의 머리를 몸통에서 분리하십시오. 그다음, 등 쪽이 위를 향하도록 하여 절차대 위에 꼬리와 팔을 고정하십시오.그 다음, 곡선형 아이리스 가위를 사용하여 피부를 제거합니다. 그 후, 엉덩이 바로 윗부분인 요추 부위에서 척수를 절단하고, 흉부의 양측을 절단하여 신체에서 분리합니다. 과잉 조직을 제거하기 위해 5 mL의 멸균 PBS가 담긴 10 cm 페트리 접시 3개에서 샘플을 각각 10초씩 순차적으로 세척합니다.그 후, 5 mL의 멸균된 PBS가 채워진 22 gauge 바늘과 주사기를 척추의 미측(caudal end)에 삽입하고 두측(cranially) 방향으로 세척하여, 척수가 네 번째 페트리 접시로 나오게 합니다. 척수를 얼음 위에 놓인 5 mL의 HABG가 담긴 15 mL 튜브로 옮깁니다. 척수가 눌리지 않도록 주의하며, 나머지 새끼 쥐들에 대해서도 동일한 절차를 반복합니다.뉴런 분리를 보장하기 위해, 이상적으로는 새끼 쥐 한 그룹당 이 과정이 30분 이내에 완료되어야 합니다. 밀도 구배를 만들기 위해, 네 개의 15 milliliter 튜브에 각각 네 가지 층을 준비하십시오. 그런 다음, 새로운 15 milliliter 튜브에 각 층을 1 milliliter씩 추가하십시오.가장 아래에 첫 번째 층을 먼저 배치하고, 맨 위의 네 번째 층에 도달할 때까지 순차적으로 추가하십시오. 층을 추가하는 동안 층이 흐트러지지 않도록 주의하고, 층이 섞일 수 있는 격렬한 움직임을 피하십시오. 다음으로, 다진 조직에 소화 배지를 추가하십시오.샘플을 30 °C의 항온수조 내 쉐이커에 넣습니다. 그 후, 조직을 항온수조에서 꺼내어 몇 분 동안 가만히 둡니다. 분쇄를 수행하기 위해, 과잉의 소화 배지를 흡입하여 제거합니다.좁은 구경의 피펫을 사용하여 조직을 2 mL의 HABG에 현탁시킨 후, 공기가 유입되지 않도록 주의하며 45초 동안 10회 trituration 합니다. 공기가 유입되면 생존 수율이 크게 감소할 수 있습니다. Trituration은 이 절차에서 가장 중요한 단계 중 하나이며, 조직을 화염 연마된 피펫으로 조심스럽게 흡입하고 배출해야 합니다. 이때 뉴런의 사멸을 초래할 수 있는 과도한 힘을 가하거나, 수율 저하의 원인이 되는 너무 약한 조작을 피해야 합니다. 그 후, 상층액의 상단 2 mL를 흡입하여 'collection'이라고 표시된 새로운 15 mL 튜브로 옮깁니다.상층액 6 mL를 얻기 위해 수집 절차를 두 번 더 반복합니다. 그다음, 농도 구배가 깨지지 않도록 주의하며 수집 튜브의 내용물을 이전에 준비한 구배 튜브로 천천히 옮깁니다.뉴런을 정제하기 위해, 밀도 구배 튜브를 22 °C에서 800 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 원하는 층을 수집하여 새로운 15 mL 튜브로 옮깁니다. 가장 순도 높은 뉴런 분리를 위해서는 세 번째 층을 수집하십시오.순도보다 수득량을 높이려면 2~3번째 층을 수집하십시오. 다음으로, 새로 수집한 층에 5 mL의 HABG를 추가하여 밀도 구배를 희석합니다. 이를 22 °C에서 200 ×g로 2분 동안 원심분리하십시오.2분 후, 상층액을 제거하고 플레이트를 가볍게 쳐서 세포를 5 mL의 HABG에 다시 현탁합니다. 이어서, 샘플을 22 °C에서 200 ×g로 2분 동안 다시 원심분리합니다. 그다음, 상층액을 제거하고 플레이트를 가볍게 쳐서 세포를 3 mL의 neurobasal medium에 다시 현탁합니다.그 다음, 세포 계수기를 사용하여 세포 밀도를 측정하고, 현탁액을 Neurobasal 배지 1 mL당 300,000 cells가 되도록 희석합니다. 세포와 용액이 고르게 섞이도록 부드럽게 흔들어 준 뒤, 코딩된 24-well 플레이트의 각 웰에 샘플 1 mL를 첨가합니다. 여기 보이는 것은 웰에 파종한 후 배양 중인 뉴런의 시간 경과 과정입니다.세포는 일반적으로 처음 몇 시간 이내에 표면에 부착되기 시작합니다. 축삭은 처음 24~48시간 이내에 뻗어 나오기 시작하며, 다양한 뉴런 간의 연결 및 배양 상태는 보통 7일째에 성숙 단계에 도달하며, 이 시점에 일반적으로 뉴런에 대한 실험이 수행됩니다. 이 그림에서 핵 염색은 파란색으로, 세포질 염색은 녹색으로 표시되었으며, 여기서는 뉴런의 세포골격 단백질인 microtubular associated protein two를 염색하여 배양 일주일 후 뉴런의 외곽선과 축삭 돌기를 보여줍니다.병합된 이미지들은 뉴런의 상대적 풍부도를 보여주기 위해 결합되었습니다. 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행될 경우 3~4시간 이내에 완료될 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 척수 생리학 및 병리학을 연구하는 연구자들이 정상 조건에서의 척수 뉴런의 거동과, 수술 절차를 모방한 산소 및 포도당 결핍과 같은 스트레스 요인 또는 약물제에 반응하는 거동을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.본 절차를 수행할 때는 건강하지 않은 뉴런이 분리되는 것을 방지하기 위해 어떤 단계에서도 지연이나 연장이 일어나지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 무혈청 배지에서 배양 가능한 신생 마우스 척수로부터 건강하고 생존력이 있는 뉴런을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

electrophysiologic 연구 신생아 마우스 척수의 고립의 데모.

척수 전기 생리학

척수에서 마우스 배아 motoneurons를 분리의 대체 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 계정에 렉틴은 낮은 친화 신경 성장 인자 수용체 p75NTR에 바인딩할 수있다는 사실이 걸립니다. 이 렉틴과 기반 preplating는 p75NTR에 대한 특정 항체와 비슷한 정화 수 있습니다.

마우스 배아의 Motoneurons의 렉틴 기반 격리와 문화

이 비디오에서는 체외 연구를 위해 신생아 마우스에서 척수 뉴런을 분리하는 단계별 프로토콜에 대해 설명합니다.

Spinal Cord Neuron Isolation: In Vitro Studies를 위해 신생아 척수 뉴런을 분리하기 위한 밀도 구배 절차

이 비디오는 형질전환 마우스 배아에서 안구 운동, 대구 신경 및 척추 운동 뉴런을 분리하는 것을 보여줍니다. 배아는 쉽게 시각화하고 식별할 수 있도록 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지된 운동 뉴런을 발현합니다. 운동 뉴런은 형광 현미경으로 외과적으로 분리되고 배양 배지에서 유지됩니다.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from a Mouse Embryo(쥐 배아에서 눈동자, 트로클리어, 척추 운동 뉴런의 분리와 배양)

이 비디오는 신생아 쥐의 뇌에서 세포를 분리하고 배양하는 방법을 보여주었습니다. 그것은 뇌의 효소적, 기계적 해리를 포함했으며, 그 다음에는 혼합 신경교세포 집단을 얻기 위해 신경 세포 성장 인자가 결핍된 성장 매체에서 배양하는 것이 포함되었습니다.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain(신생아 마우스 뇌에서 혼합 신경교세포 배양 얻기)

이 비디오는 성체 쥐의 척수 조직에서 1차 혼합 신경교세포를 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다. 이 프로토콜은 조직의 효소 분해를 포함하며, 그 후 단세포 집단을 얻기 위해 부서진 세포막과 미엘린 파편을 제거하는 것입니다. 그런 다음 세포는 혼합 신경교세포 성장에 최적화된 배지에서 배양됩니다.

Establishing Primary Mixed Glial Cell Cultures from a Mouse Spinal Cord

우리는 신생아 대뇌 피질 성인 척수 가능한 미세 아교 세포의 효율적이고 신속한 분리 / 문화 방법을 설명합니다. 대뇌 피질의 미세 아교 세포의 해부 및 도금은 초기 박리 다음 장소 ~ 10 일을 복용 이후 미세 아교 수확으로 90 분 이내에 수행 할 수 있습니다.

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

생체 외에서 가능한 한 적절 하 게 생체 외 조건에서 반영 하는 실험을 실시 하는 것은 쉬운 일이 아니다. 1 차적인 세포 배양물의 사용은 전체 유기체에 있는 세포 생물학을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 제공된 프로토콜은 배아 마우스 소뇌 뉴런을 성공적으로 성장시키고 배양하는 방법을 간략하게 설명한다.

배아 마우스 소뇌에서 분리 된 뉴런의 기본 문화

이 작품은 1 차적인 oculomotor, trochlear 및 척추 운동 뉴런의 동종 세포 배양을 산출하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 배양은 안구 및 척추 운동 뉴런의 형태학적, 세포적, 분자 적 및 전기 생리학적 특성의 비교 분석에 사용될 수 있다.

태아 기 이슬mn에서 Oculomotor, Trochlear 및 척추 모터 뉴런의 격리 및 문화 :GFP 형질전환 마우스

이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 정제된 성상교세포와 미세아교세포를 분리하여 RNA 분석 및 세포 배양과 같은 후속 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에는 분리된 세포의 품질과 수율을 모두 향상시키기 위해 고안된 상세한 세포 해리 방법 및 절차가 포함됩니다.

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

배우세요 신생아 생쥐 척수 신경 세포 분리 및 배양 기법으로 신경 생물학 연구에 활용 가능한 건강한 뉴런을 얻는 방법을 익히세요. 이 기술은 기계적 및 효소적 분리를 통해 반복 가능한 결과를 제공합니다.

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

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