단백질 영화 적외선 전기 화학 [NiFe] Hydrogenase에 의해 H2 산화의 연구에 대 한 설명

이 프로토콜의 전반적인 목표는 단백질 필름 적외선 전기화학 또는 PFIRE를 사용하여 비회전율 및 정상 상태 전기촉매 회전율 조건 모두에서 니켈-철 수소효소 산화환원 효소의 활성 측면 화학을 조사하는 것입니다. PFIRE 기술의 주요 장점은 탄소 전극에 고정된 산화 환원 단백질의 정밀한 전기화학적 제어와 적외선 분광 샘플링을 동시에 수행할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 정상 상태 촉매 회전(steady-state catalytic turnover) 동안 어떤 상태의 산화 환원 단백질이 존재하는지에 대한 생물물리학 및 생물전기화학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

절차를 시작하려면 젖은 혐기성 글로브 박스에 1ml의 초순수에 20mg의 높은 표면적 카본 블랙 입자를 매달아 놓습니다. 최소 15분 동안 또는 입자가 균일하게 분산되고 정지 상태에서 1시간 이내에 침전물이 형성되지 않을 때까지 낮은 출력으로 현탁액을 초음파 처리합니다. 그런 다음 15마이크로리터의 밀리리터당 약 7밀리그램의 E.Coli 수소효소 용액을 50킬로달톤 원심 필터 장치에 로드합니다.

용액을 450마이크로리터의 낮은 이온 강도 교환 완충액으로 희석하여 pH가 수소분해효소의 등전점에 가까운 것으로 합니다. 27, 000 시간 g에 분리기분리에 의하여 50 마이크로리터에 혼합물을 집중하십시오. 혼합물을 4회 더 재농축하여 완충액 교환을 완료합니다.

그런 다음 20 milligram per milliliter 카본 블랙 분산액 5 마이크로 리터를 완충액 교환 수소 효소와 결합합니다. 수소 분해 효소가 카본 블랙 입자에 흡수 할 수 있도록 혼합물을 섭씨 0도에서 밤새 보관하십시오. 입자 분산을 유지하기 위해 혼합물을 주기적으로 점검하십시오.

27, 000 시간 g에 변경한 입자를 분리기를 설치하고 상등액이 거의 무색하다는 것을 확인해, 입자에 수소 효소의 좋은 흡수를 나타내. 높은 수준의 흡수를 달성하는 것은 실험의 성공에 매우 중요합니다. 당사는 단백질의 등전점에 가까운 pH에서 낮은 이온 강도의 완충액을 시작점으로 사용하여 흡수 완충액을 최적화합니다.

3-5주기의 원심분리와 재현탁액으로 입자를 세척하고 새 교환 완충액에서 재현탁합니다. 입자 혼합물을 약 5마이크로리터로 농축하여 밀리리터당 20밀리그램의 입자 포집을 달성합니다. PFIRE 측정 준비를 시작하려면 황산에서 저전력 초음파 처리로 실리콘 내부 반사 소자를 15분 동안 청소합니다.

그 후 1시간 동안 질산을 투여합니다. 그런 다음 요소를 초순수로 헹구고 건조 질소 가스 흐름에서 건조시킵니다. 전기 등급 실리콘 실런트를 사용하여 IRE를 5개 반사 ATR 액세서리의 베이스 플레이트에 고정하고 실런트가 IRE의 가장자리에 닿지 않도록 주의합니다.

실런트가 완전히 건조되도록 합니다. 그런 다음 FTIR 분광 광도계 옆에 IR 투명 창이 있는 건조한 혐기성 글로브 박스에 베이스 플레이트를 가져옵니다. ATR 액세서리에 베이스 플레이트를 장착합니다.

빠른 스캔 모드에서 배경 스펙트럼을 획득합니다. 그런 다음 ATR 액세서리 베이스 플레이트를 분리하고 젖은 혐기성 글로브 박스로 옮깁니다. 효소 변형 카본 블랙 입자 1마이크로리터를 IRE 표면 위에 균일하게 떨어뜨려 입자가 완전히 건조되지 않도록 합니다.

효소 변형 입자 혼합물이 가능한 한 밀리리터당 20밀리그램에 가까운 부하로 농축되는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 이 단계에서 입자를 드롭캐스팅할 때 잘 연결된 입자 필름을 얻기 어려울 수 있습니다. 초순수에 적신 카본지 조각을 IRE 표면에 부드럽게 놓고 종이가 실리콘 실런트에 닿지 않도록 입자 필름이 덮여 있는지 확인합니다.

IRE에 맞춤형 분광전기화학 셀을 장착합니다. 용액 주입구를 통해 200마이크로리터의 실험 버퍼를 추가하여 시스템 준비 중에 효소를 수화 상태로 유지합니다. 용액 주입구와 배출구를 연동 펌프 튜브를 통해 실험 완충액의 바이알에 연결합니다.

그런 다음 조립된 셀을 드라이 글로브 박스로 옮깁니다. 셀 어셈블리를 ATR 액세서리에 장착하고 튜브를 연동 펌프에 연결합니다. 이전에 획득한 스펙트럼을 배경으로 사용하여 흡수 스펙트럼을 획득합니다.

MI2 대역이 1, 540 역센티미터에서 강하게 보이는지, 수소분해효소 활성 부위 피크가 1, 850 - 2, 150 영역에서 검출 가능한지 확인합니다. 실험을 준비하기 위해 포화 칼로멜 기준 전극에 비해 음의 0.8볼트의 감소 전위를 입자 필름에 적용합니다. 실험 버퍼를 혐기성 수소 가스로 포화시킵니다.

그런 다음 분당 약 12밀리리터의 속도로 분광 전기화학 셀을 통해 완충액을 흐르게 합니다. 수소 포화 실험 완충액의 흐름 아래에 시료를 밤새 두어 수소 분해 효소를 활성화합니다. 활성화된 샘플의 흡수 스펙트럼을 획득하고 활성 부위의 CO 및 CN 대역이 여러 감소 상태를 나타내는지 확인합니다.

다음으로, 실험 버퍼를 혐기성 질소 가스로 포화시키고 버퍼를 셀을 통해 흐르게 합니다. 포화 칼로멜 기준 전극에 대해 0볼트의 산화 전위를 30분 동안 적용하고 흡수 스펙트럼을 획득합니다. 그런 다음 30분 동안 감소 전위를 적용하고 다른 스펙트럼을 얻습니다.

효소가 완전히 산화된 후 환원되었는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 셀의 전기 연결을 확인하십시오. 혐기성 수소 포화 완충액을 사용하여 증가하는 유속에서 일련의 순환 볼타모그램을 획득하여 실험을 위한 최적의 유속을 결정합니다.

이 유속을 사용하여 다양한 전위 및 용액 조건에서 스펙트럼을 획득합니다. E.coli hydrogenase one의 PFIRE 측정은 불활성 분위기 및 수소 가스의 존재 하에서 다양한 전위에서 얻어졌습니다. 수소 대기에서 획득된 스펙트럼은 촉매 수소 산화 중에 존재하는 활성 부위 상태의 정상 상태 분포를 나타냅니다.

니켈-Si로부터 니켈-B 상태의 형성을 통한 수소효소의 혐기성 산화 및 활성화는 잠재적인 적용 중 다양한 시점에서 스펙트럼을 획득하고 첫 번째 스펙트럼에 비해 다른 스펙트럼을 준비함으로써 조사되었습니다. 니켈-Si에서 니켈-B로의 관찰된 점진적인 전환은 전류의 단조 감소와 일치했습니다. 또한 수소 분해 효소 촉매 주기의 양성자 전달 단계를 조사하기 위해 다양한 용액 pH에서 스펙트럼을 획득했습니다.

낮은 pH에서는 니켈-C 상태가 더 널리 퍼진 반면 니켈-L 상태는 높은 pH에서 더 널리 퍼졌습니다. 니켈-C 및 니켈-L의 상대 농도의 pH 의존성은 실험에서 평가된 각 pH에서 각 피크의 최대 흡수제 값으로부터 결정되었습니다. 이 기술은 생전기화학 분야의 연구자들이 수소 발생에 의한 수소 활성화의 정상 상태 동역학을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.

이 비디오를 시청한 후에는 일반적인 PFIRE 실험에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 단백질 필름 전기 화학으로 연구 할 수있는 모든 산화 환원 단백질에 적합하며 전기 화학 측정에 직접적인 화학적 통찰력을 추가합니다.