광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰

이 실험의 전체적인 목표는 광학 단층 촬영(optical coherence tomography, OCT)을 사용하여 망막 두께를 신속하고 정확하게 평가하는 것입니다. OCT는 시신경 병증과 같이 안과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마우스 망막 신경절 세포의 구조적 변화를 감지할 수 있는 비침습적 방법이라는 점입니다.

이 기술은 시신경 병증에서 치료 효과를 테스트할 수 있는 비침습적이고 안전하며 정평이 난 방법이기 때문에 매우 흥미롭습니다. 우선, 렌즈에 적합하게 기준 팔(reference arm) 설정을 조정하십시오. 그다음, 전원 공급 장치와 컴퓨터를 켭니다.

컴퓨터 준비가 완료되면 이미징 프로그램을 실행하십시오. 새로운 임상 연구를 생성하고 원하는 프로토콜을 추가하십시오. 환자 검사 섹션으로 이동하여 검사 기본값을 설정하십시오.

환자 검사 섹션에서 환자 추가를 클릭하여 새 환자를 추가하고 관련 환자 정보를 입력합니다. 그런 다음 검사 추가, 검사 시작을 클릭하고 리스트에서 프리셋 스캔을 추가하여 먼저 측정할 안구를 시작으로 원하는 프로토콜을 선택합니다. 데이터 획득 최소 15분 전에 테스트 예정인 모든 마우스의 각 눈에 상온의 10% phenylephrine 점안액을 투여합니다.

그다음 과잉 시약을 제거하고 상온의 0.5% tropicamide를 점안합니다. 이미지 획득 약 5분 전에 전신 마취를 유도합니다. 직후에 각 눈에 0.4% oxybuprocaine hydrochloride를 투여하고, 안구를 마취시키고 고정하기 위해 용액을 3초 동안 그대로 둡니다.

그 다음, 점안액을 제거하고 10% phenylephrine과 0.5% tropicamide 점안을 반복합니다. 영상 촬영을 위해 눈이 충분히 확장되면, 각막 수분 공급을 위해 점성 글리콜 기반의 안약을 사용하여 눈을 윤활시키고, 마우스의 체온을 유지하기 위해 수술용 거즈 한 장으로 감쌉니다. 스펀지나 면심을 사용하여 0.3% hypromellose가 첨가된 안과용 겔을 각 눈에 얇게 도포합니다.

그동안 속눈썹과 수염을 옆으로 치워 둡니다. 머리를 곧게 펴고 앞을 향하도록 하여 마우스를 카세트에 배치하고, 바이트 바(bite bar)를 입안에 조심스럽게 고정합니다. 검사 중인 눈 쪽의 동물 측면에 코튼 롤을 받쳐 줍니다.

그런 다음, 클립이 달린 조준 팁을 마우스 전용 렌즈에 맞춘 상태에서 z축 이동 나사를 시계 반대 방향으로 돌려 렌즈를 눈 쪽으로 가져옵니다. 카세트를 회전 및 스위블링하고 바이트 바와 x축 이동 나사를 돌려, 실험 대상인 눈이 렌즈를 정면으로 바라보도록 마우스의 위치를 미리 설정합니다. 눈의 광축과 렌즈가 일치하면, 검사 내의 첫 번째 스캔을 선택합니다.

'Start aiming'을 클릭하고 z-translator 나사를 사용하여 왼쪽 패널에서는 망막을 수직으로, 오른쪽 패널에서는 수평으로 이동시킵니다. 카세트를 회전시켜 시신경 유두를 위아래로 움직여 오른쪽 패널의 중앙에 위치시킵니다. 바이트 바(bite bar) 나사를 사용하여 오른쪽 패널 내의 망막을 곧게 펴고, 카세트를 회전시켜 시신경 유두가 왼쪽 패널의 중앙에 오도록 배치합니다.

그 다음 x-축 변환 나사를 사용하여 왼쪽 패널 내에서 망막의 수평을 맞추고, 각 모듈레이터의 주요 기능을 고려하여 시신경 유두가 완벽하게 중앙에 오도록 망막의 위치를 추가로 조정합니다. 망막이 적절한 위치에 놓이면, 스냅샷 시작을 클릭하여 스펙트럼 영역 광학 단층 촬영 스캔을 시작하십시오. 스캔 결과와 보고서를 저장하는 것을 잊지 마십시오.

필요한 경우 중심 정렬을 조정하십시오. 스캔이 완료되면 렌즈를 후퇴시키고 앞서 시연한 것과 같이 두 번째 눈을 배치하십시오. 두 번째 눈의 스캔이 끝나면 카세트에서 마우스를 꺼내고, 양쪽 눈에 0.3% hypromellose 성분의 안과용 겔을 도포한 후 완전히 회복될 때까지 모니터링하며 가열판 위에 마우스를 두십시오.

망막 신경절 세포에 집중하기 위해 Image J용으로 제작된 MRI retina tool 매크로를 사용하십시오. MRI retina tool을 열고 polygon selection tool을 수정한 후 해당 이미지를 로드하십시오. M을 클릭하여 측정을 시작하고, E를 클릭하여 수평 위치를 조정하십시오. 새로 열린 region of interest manager 창에서 첫 번째 카세트를 선택하십시오.

파란색 다각형을 클릭하고 사진 속 측정 레이어의 경계선을 클릭하여 첫 번째 카세트의 위치를 조정하십시오. 관심 영역 관리자 창에서 두 번째 카세트를 선택하고 두 번째 카세트를 조정하십시오. 그런 다음 R을 클릭하여 망막을 재측정하고 측정 창에서 결과를 확인하십시오.

스펙트럼 도메인 OCT 스캔의 품질이 망막 단면 이미지만큼 좋지는 않지만, OCT를 통해 더 많은 층을 시각화할 수 있습니다. OCT 스캔에서는 망막 층을 쉽게 측정할 수 있으며, 여기에는 신경절 세포층의 망막 신경 섬유, 내핵층, 외망상층, 외핵층, 내절 및 외절층, 망막 색소 상피, 그리고 맥락초가 포함되어 망막 전체에 대한 복합적인 연구가 가능합니다. 방금 시연한 망막 두께의 OCT 측정 결과에 따르면, 시각 장애가 있는 유전자 변이 OPA1 암컷 마우스는 신경절 세포 복합체와 유두 주변 망막 신경 섬유층이 점진적으로 두꺼워지는 양상을 보입니다.

표준 캘리퍼스와 수제 캘리퍼스를 사용하여 신경절 세포층의 망막 신경 섬유 두께를 비교한 결과, 표준 캘리퍼스는 훨씬 더 두껍고 얇은 층 경계에 배치하기 어렵기 때문에 수제 캘리퍼스보다 두께를 유의하게 낮게 측정하는 것으로 나타났습니다. 숙련된 후, 이 기술은 정확하게 수행될 경우 15분 이내에 완료할 수 있습니다. OCT의 개발 이후, 안과학 분야의 연구자들이 생쥐 망막의 구조적 변화를 분석할 수 있는 길이 열렸습니다.

이 영상을 시청한 후, 마우스의 망막 신경절 세포에 대한 OCT 영상 촬영 및 분석 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.