새로운 방식으로 맛보기 코딩 공부하기

이 방법들의 전반적인 목표는 맛 물질의 정밀하게 시간 조절된 펄스를 전달하고 모니터링하는 동시에, 생체 내(in vivo)에서 다수의 수용체 뉴런 활동을 기록함으로써 단순 동물 모델인 mandi-casecsta의 미각 코딩을 연구하는 것입니다. 이러한 방법들은 맛 물질이 미각 수용체 뉴런 집단에 의해 어떻게 인코딩되는지와 같은 미각에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정밀하게 전달된 맛 자극 전, 중, 후에 걸쳐 다수의 미각 뉴런에 대한 생체 내 기록이 가능하다는 점입니다.

해당 방법이 처음인 분들은 박리 절차가 복잡하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 본 방법의 시각적 시연이 도움이 되기를 바랍니다. 이 기술들은 Sam Writer가 제 연구실의 대학원생이었을 때 Alejandra와 함께 개발하였으며, Kui Sun이 이러한 절차들을 시연할 예정입니다.

우화 후 3일이 지나면, 전반적으로 건강한 외형을 가진 암수 구분 없는 나방 한 마리를 선택합니다. 날개는 완전히 펴져 있어야 하며, 빨대모양 입(proboscis)과 더듬이가 잘 형성되어 있고 손상되지 않은 상태여야 합니다. 흄 후드 내에서, 선택한 나방의 머리 부분만 노출될 때까지 구속 튜브(restraining tube)에 넣습니다.

그런 다음, 튜브의 반대쪽 끝에 티슈 페이퍼를 삽입하여 나방을 고정합니다. 이제 시린지로 분사되는 가압 공기를 사용하여 노출된 머리 부분의 털을 제거합니다. 그 후, 페트리 접시 안의 점토 플랫폼 위에 튜브를 놓습니다.

머리의 등쪽이 위를 향하도록 놓습니다. 그다음, 안테나와 구강 구조물(proboscis)을 보호합니다. 먼저, 0.5 cm 길이로 자른 200 µL 피펫 팁을 사용하여 각 구조물을 덮을 커버를 만듭니다.

구기를 조작하기 위해 와이어 조각으로 갈고리를 준비합니다. 구기의 가장 기부 쪽이 보호될 때까지 커버 중 하나 안으로 구기를 확장시킵니다. 단단한 바틱 왁스를 사용하여 튜브를 머리 캡슐의 등쪽에 고정합니다.

다음으로, 촉각을 조심스럽게 펴고 바틱 왁스(batik wax)로 튜브를 고정합니다. 이제 버클 압축근(buckle compressor muscle)을 절단하여 뇌를 안정화합니다. 해부 현미경 하에서 미세 해부 도구를 사용하여 소식관(proboscis) 바로 아래쪽을 작게 절개함으로써 머리 캡슐을 엽니다.

근육이 절단되었는지 확인하기 위해, 구강촉(proboscis)의 원위부 2/3 지점에 자당 용액을 제공하고 5분 동안 구강촉이 신장되지 않는지 확인하십시오. 그 다음, 녹인 바틱 왁스(batik wax) 층을 사용하여 머리 캡슐을 밀봉하십시오. 뇌에 식염수를 관류시키려면 머리의 복측 주변에 왁스 컵을 만드십시오.

전동 왁서(electric waxer)를 사용하여 머리 앞부분부터 뒷부분 방향으로 왁스 컵을 만들기 시작합니다. 이때 구기(proboscis)와 더듬이 튜브는 컵 내부에 둡니다. 눈 높이에 도달할 때까지 컵을 바깥쪽과 위쪽으로 계속해서 쌓아 올립니다.

핀셋을 사용하여 순인두(labial palps)를 집어 녹인 왁스로 왁스 컵에 부착합니다. 그 다음, 이성분 에폭시를 얇게 도포하여 왁스 컵과 튜브의 모든 개구부를 밀봉합니다. 에폭시는 이쑤시개를 사용하여 혼합하십시오.

먼저, 컵의 외부와 내부 표면을 덮습니다. 둘째, 머리가 더 단단히 고정될 수 있도록 목 주변의 구속 튜브 부분을 채웁니다. 20분 후, 컵에 누수가 있는지 확인합니다.

뇌 수술을 시작하려면 먼저 순인절(labial palps)을 절단합니다. 머리 캡슐의 복측을 열기 위해 머리의 후면과 전면, 그리고 눈 주변을 따라 큐티클을 절개합니다. 그다음 머리 후면을 따라 절개하고, 주둥이 근처의 머리 전면을 따라 추가로 절개합니다.

그런 다음, 핀셋으로 큐티클 플랩을 조심스럽게 들어 올려 뇌를 노출시킵니다. 이제 가장 중요한 단계인 SEZ 및 상악 신경 노출을 수행합니다. 지방 조직과 기관을 천천히 주의 깊게 제거하십시오.

신선한 식염수로 뇌를 자주 헹굽니다. 상악신경이 매우 짓눌리기 쉬우므로 각별히 주의하십시오. SEZ와 상악신경이 마침내 보이면, 그것들은 얇은 초로 덮여 있을 것입니다.

이 시스(sheath)를 제거하려면, 과잉 식염수를 배출한 다음 10% collagenase dispase 용액을 처리하여 시스를 약화시킵니다. 5분 동안 담근 후, 식염수로 용액을 여러 번 헹구어 냅니다. 그 다음, 식염수로 여러 번 헹군 뒤 초미세 미세해부 핀셋을 사용하여 시스를 조심스럽게 제거합니다.

마지막으로, 관류 컵에 식염수 점적 라인을 고정합니다. 이 섹션에서는 미각 자극제 전달 시스템의 구축 및 사용 방법을 설명합니다. 이 시스템은 여러 개의 개구부가 있는 테스트 튜브로 구성됩니다.

개구부는 동물의 구기(proboscis), 다양한 미각 자극제, 색상 센서가 들어올 수 있는 입구가 되며, 물이 원활하게 흐르도록 합니다. 이 시스템을 구축하려면, 먼저 구기를 위한 테스트 튜브를 준비하십시오. 인두기를 사용하여 구기 크기의 구멍을 만듭니다.

그 다음, 튜브 내부에 망으로 된 구획을 만들어 구강관(proboscis)을 고정합니다. 구멍에서 5 mm 위쪽을 절단하고, 그 자리에 왁스로 메쉬를 고정시킨 후, 왁스와 에폭시를 사용하여 튜브를 다시 연결합니다. 가압 관류 시스템을 사용하여 미각 자극물을 전달합니다.

필요한 만큼의 미각 자극제 튜브를 매니폴드에 연결합니다. 미각 자극제 출력 튜브를 연결하려면 메쉬 위로 약 1cm 지점에 구멍을 뚫은 다음, 에폭시로 출력 튜브를 고정합니다. 각 미각 자극제에는 컬러 센서로 감지할 수 있는 인공 염료를 포함하십시오.

메쉬 상단 약 0.5 cm 지점의 구멍에 컬러 센서를 장치에 부착하고, 에폭시를 사용하여 고정합니다. 연동 펌프를 사용하여 실리콘 튜브를 통해 시스템 내로 증류수를 공급합니다. 폐수는 대형 용기에 수집합니다.

공압 펌프를 사용하여 공기 분사 방식으로 미각 자극물을 전달합니다. 이제 튜브를 통해 깨끗한 물을 펌핑하기 시작하고, 미각 자극물을 펄스 형태로 전달하여 컬러 센서를 테스트합니다. 이제 나방의 구강관(proboscis) 3분의 2 지점을 테스트 튜브에 넣습니다.

포셉을 사용하여 주둥이를 펴고 구멍 속으로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 그런 다음 연질 치과용 왁스와 에폭시 층을 사용하여 주둥이를 제자리에 고정합니다. 이제 식염수 관류 라인을 연결하고 관류 유량을 설정합니다.

그런 다음, 꼬임 와이어 테트로드(twisted wire tetrode)의 접지 전극을 식염수 욕조에 담급니다. 이어서 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 테트로드를 상악신경 옆에 배치하고, 신경 내부로 천천히 진입시킵니다. 스파이킹 신호가 검출되면, 기록을 시작하기 전 준비물을 최소 10분 동안 안정화하십시오.

설명된 프로토콜을 사용하여 미각 수용체 뉴런으로부터 미각 물질 투여 전, 투여 중 및 투여 후에 기록을 수행하였습니다. 각 미각 물질의 1초 펄스 시작과 종료 시점은 컬러 센서로 모니터링하였습니다. 미각 물질은 4개의 채널 각각에서 검출되는 스파이크를 유도하였습니다.

스파이크 열 내에서 개별 활동 전위를 관찰할 수 있었습니다. 스파이크 분류 소프트웨어를 사용하여 이러한 스파이크를 고유한 뉴런에 할당했습니다. 순차적으로 전달된 6가지 미각 자극제에 대한 세 가지 서로 다른 미각 수용기 뉴런의 반응을 통해, 서로 다른 수준의 기저 활동과 자극제에 대한 선택성을 확인할 수 있습니다.

또한, 반응의 타이밍이 서로 달랐습니다. 일부는 자극 지속 시간과 일치했지만, 다른 일부는 자극이 끝난 후에도 지속되었습니다. 일반적인 sharp glass 전극을 사용하여 미각 수용체 축삭에서 세포 내 기록을 수행할 수도 있었습니다.

세포 내 기록 결과는 앞서 설명한 테트로드(tetrode) 기법을 사용하여 관찰한 반응과 매우 유사했으나, 테트로드 기록 방식이 수행하기 더 쉽고 지속 시간이 길며 더 견고했습니다. 이 영상을 시청한 후에는 mandi-casecsta의 상악 신경과 식도하 구역을 노출시킬 수 있으며, 정밀한 시간 제어가 가능한 미각 자극제 전달 시스템을 구축할 수 있어야 합니다. 본 프로토콜을 수행할 때는 laboratory safety gloves와 안면 마스크를 착용하십시오. mandi-casecsta에서 떨어져 나오는 미세한 가루 형태의 비늘이 알레르기를 유발할 수 있기 때문입니다.

이 절차에 숙련되면 3시간 30분 만에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 통해 여러 뇌 영역에서 동시에 기록을 수행함으로써, 미각 수용체 뉴런의 미각 물질에 대한 반응이 시냅스 후 표적 뉴런으로 전달될 때 어떻게 변환되는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.