Name: PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 배우세요 PIP-on-a-chip 기법을 이용한 라벨 없는 단백질-포스포이노시타이드 상호작용 정량 분석 방법입니다. 이 마이크로유체 플랫폼은 생리학적으로 관련성 높은 막 단백질 연구에 활용됩니다.

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각각의 PIP 변이체는 저농도 임에도 불구하고 특정 세포 소기관의 세포질 표면에 존재하며, 세포막 고유의 물리적 구성과 기능적 특이성의 형성에 기여합니다 1 . PIP를의 가장 중요한 용도 중 하나는 특정 세포 내 현지화 및 / 또는 활성화 6, 7을 필요로하는 단백질의 다수에 대한 특정 도킹 플랫폼이다. 세포 생리학 및 질병에서의 역할로 인해, 생체 관련 분야 에서 in vitro에서 protein-PIP 상호 작용을 연구하는 능력이 중요합니다. 본원에 기재된 분석 포맷은 인지질의 혼합물의 존재 하에서, 극성 머리 그룹 및 자연 길이 지방 아실 사슬의 정상적인 제시와 함께, 유체 지질 이중층의 환경에서 단백질 -PIP 상호 작용을 고려할 수있게한다. 이 분석법을 결합하여pH 시스템을 검출 시스템으로 사용하고, S...

무수한 상호 작용과 생화학 적 과정은 2 차원 유체 막 표면에서 일어난다. 진핵 세포의 멤브레인 - 둘러싸인 세포 기관은 생화학 적 과정과 관련 프로테옴뿐만 아니라 지질 조성에서도 독특합니다. 예외적으로 인지질의 한 종류는 phosphoinositides (PIPs)입니다. 이들이 세포질 리피도미스의 1 %만을 차지한다고 할지라도, 이들은 신호 변환,자가 식욕 (autophagy), 막 인신 매매 (membrane trafficking)에서 중요한 역할을한다. 그 중에서도 1 , 2 , 3 , 4 가 중요하다. 셀룰러 PIP 키나제하여 이노시톨 헤드 그룹의 동적 인산화 일곱 PIP 모노있다 headgroups, 비스 -, 또는 트리스 - (5)의 인산화를 일으킨다. 또한, PIP는 세포막의 세포 내 신원을 정의하고 하나 이상의 포스 포이 노를 함유하는 단백질 / 효소에 대한 특화된 막 도킹 사이트로서 작용한다예를 들어, 도메인을 itide 결합, 플렉스 트린 상 동성 (PH) Phox 동성 (PX)과 epsin N 말단 동성 (ENTH) 6,7. 가장 많이 연구 된 PIP 결합 도메인 중 하나는 특히 높은 나노 몰 낮은 마이크로 몰 범위의 친 화성 8에서 포스파티딜 이노시톨 4,5- 비스 포스페이트 (PI (4,5) P 2)과 상호 작용하는 포스 포 리파제 C (PLC) -δ1의 PH 도메인이고 , 9 , 10 , 11 . 다양한 정성 및 정량 시험관 방법이 개발되어 이러한 상호 작용의 메커니즘, 열역학 및 특이성을 연구합니다. 가장 일반적으로 사용되는 PIP 결합 분석에는 표면 플라스 몬 공명 (SPR), 등온 열량계 (ITC), 핵 자기 공명 (NMR) 분광기, 리포좀 부유 / 침강 분석법 및 지질 블롯 (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . 이것들이 광범위하게 이용 되더라도 그들은 모두 많은 단점을 가지고 있습니다. 예를 들어, SPR, ITC 및 NMR은 많은 양의 시료, 값 비싼 계측 및 / 또는 숙련 된 인원 12 , 13을 필요로 합니다. 항체 기반 lipid-blots와 같은 일부 분석 형식은 PIP의 수용성 형태를 사용하고 비 생리 학적 방식으로 12 , 14 , 15 , 16로 표시 합니다. 또한, 지질 블롯은 신뢰할 수있게 정량 될 수 없으며 종종 가양 성 / 음성 관찰 12 , 17 , 18을 초래합니다. 이러한 어려움을 극복하고 현재 도구 세트를 개선하기 위해 지원되는 지질 이중층 (lipid bilayer, SLB)을 기반으로 새로운 라벨없는 방법이 am<html> ( 그림 1 ) 19 단백질 - PIP 상호 작용의 연구에 성공적으로 적용된 마이크로 유체 플랫폼. 단백질 -PIP 상호 작용을 검출하기 위해 사용 된 전략은 pH 변조 감지에 기초한다. 이것은 phosphatidylethanolamine lipid head group 20에 직접 conjugated ortho -sulforhodamine B ( o SRB)가있는 pH 민감성 염료를 포함합니다. 오의 SRB-POPE 프로브 (도 2a)는 낮은 pH에서 높은 형광 및 7.5 몰 %의 PI (4,5) P (2) 함유 SLB 수 (도 5b)에서 약 6.7의 pKa 높은 pH에서 켄칭된다. PLC-δ1 PH 도메인은 PI (4,5) P 2 ( 도 5A )에 대한 높은 특이성으로 인해 단백질 -IP 결합 방법의 유효성 확인에 광범위하게 사용되어왔다 ( 도 5A ) 21 , 22 ,&quot;&gt; 23, 24, 25 .Hence, 우리는 PLC-δ1의 PH 도메인은 그것의 PI 결합 테스트하는데 사용될 수 있다는 추론 (4,5)가 PIP 온 칩 분석을 통해 P 2. 산도 도메인 구조 본 연구에서 사용은 순 양전하 PI (8.4)을 가지며, 따라서 OH 유치 -.받는 이온 - PI (4,5) P (2) 함유 SLB 수 결합시 이온 (도 5c)를 상기 PH 도메인은 OH를 가져온다 결과적으로 계면 전위를 변조하여 O SRB-POPE (도 5C) 26. 산도 도메인 농도의 함수로서, 형광 켄칭된다 (도 6A)의 양성자 화 된 상태를 시프트 막 표면. 최종적으로, 정규화 된 데이터는 산도 도메인 PI (4,5) P (2)의 상호 작용 (도 6b,도 6c).의 친 화성을 결정하기 위해 결합 등온선에 맞게 &lt;/ p&gt; 이 연구에서는 미세 유체 플랫폼 내에서 PIP를 함유 한 SLB에 단백질 결합을 수행하기위한 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 독자가 microfluidic 장치와 소낭 준비를 SLB 형성과 단백질 바인딩으로 조립하는 것을 필요로합니다. 또한, 데이터 분석을위한 지시는 PLC-δ1의 PH 도메인-PI (4,5) P (2)의 상호 작용이 제공되는 선호도에 대한 정보를 추출한다.

<table><tbody><tr><td>Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips: 직사각형</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544B</td><td>22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; 붕규산 유리</td></tr><tr><td>7X 세척 용액</td><td>MP Biomedicals</td><td>976670</td><td>세제</td></tr><tr><td>PYREX 결정화 접시</td><td>Corning</td><td>3140-190</td><td>바닥이 평평한 붕규산 유리 접시; 직경 x 높이 (190 x 100mm); 유통 업체 : VWR (89090-700)</td></tr> <tr><td>Sentry Xpress 2.0</td><td>Paragon Industries</td><td>SC-2</td><td>Kiln</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호 </td><td>Comments</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>다우 코닝</td><td>4019862</td><td>폴리디메틸실록산(PDMS); 유통 업체 : Ellsworth Adhesives</td></tr><tr><td>PYREX Desiccator</td><td>VWR</td><td>89134-402</td><td>진공 정격</td></tr><tr><td>생검 펀치</td><td>Harris</td><td>15110-10</td><td>Harris Uni-Core; 직경 1.0mm; 플런저가 있는 Miltex 생검 펀치 (Cat. No. 15110-10)은 대안으로 사용할 수 있습니다</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaning System</td><td>PlasmaEtch</td><td>PE25-JW</td><td>2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 서비스(Krytox Charged)</td></tr><tr><td>디지털 핫 플레이트</td><td>벤치마크</td><td>H3760-H</td><td>Denville Scientific을 통해 구매(Cat. 번호 1005640)</td></tr> <tr><td>서리로 덥은 마이크로 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>서리로 덥고, 선택되고, 사전 청소됩니다. 스위스 유리로 제작되었습니다. 두께 : 1mm; 치수: 75 x 25mm; GR 144</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Mold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>v.2016</td><td>Drafting software for the photomask design</td></tr><tr><td>Photomask</td><td>CAD/Art Services</td><td>해당 없음</td><td>검은 색 배경과 명확한 기능을 가진 디자인은 CAD / 아트 서비스</td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>대학 웨이퍼</td><td>1575</td><td>프라임 그레이드, 단면 광택; 100mm (4 인치) 직경; 525 um 두께</td></tr><tr><td>SU-8 50</td><td>MicroChem Corp.</td>에 의해 투명 마스크 (5 x 7 인치)에 20k dpi 해상도로 인쇄되었습니다.<td>N/A</td><td>네거티브 톤 포토레지스트; 펜실베이니아 주립 나노 가공 시설 자산</td></tr><tr><td>SU-8 개발자</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>Penn State Nanofabrication Facility Property</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>SUV</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>L-&알파;-포스파티딜이노시톨-4-포스페이</td>트 <td>Avanti 극성 지질</td><td>840045X</td><td>PI4P</td></tr><tr><td>L-&알파;-포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이</td>트 <td>Avanti 극성 지질</td><td>840046X</td><td>PI(4,5)P2</td></tr><tr><td>1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850757C</td><td>POPE; oSRB-POPE</td></tr><tr><td>Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride(혼합 이성질체)</td> 합성에 필요<td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-20</td><td>oSRB-POPE</td></tr><tr><td>pH 민감성 형광 지질 프로브(oSRB-POPE)</td> <td>합성</td>에 필요사내 <td>N/A</td><td>사내 합성(Huang D. et al., 2013)</td></tr><tr><td>유리 섬광 바이알</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td>20mL 용량</td></tr><tr><td>Aquasonic 250D</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>초음파 수조</td></tr><tr><td>핵기공 트랙 에칭 멤브레인</td><td>Whatman</td><td>110605</td><td>폴리카보네이트 멤브레인; 직경 : 25mm; 숨구멍 크기: 0.1um; 유통 업체 : Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>CX1054-6</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>LIPEX Extruder</td><td>Transferra Nanosciences</td><td>T.001</td><td>LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder</td></tr><tr><td>Viscotek 802 DLS</td><td>Malvern Instruments</td><td>N / A</td><td>Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Data Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>v.6</td><td>데이터 분석을 위한 곡선 맞춤 소프트웨어</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Optics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M Epifluorescence microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>AxioCam MRm Camera</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>N/A</td><td>카메라</td></tr><tr><td>X-Cite 120</td><td>Excelitas Technologies</td><td>N/A</td><td>광원</td></tr><tr><td>Alexa 568 필터 세트</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>N/A</td><td>Ex/EM 576/603 nm</td></tr><tr><td>AxioVision LE64 v.4.9.1.0 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>N/A</td><td>이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td> 카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tips</td><td>VWR</td><td>10034-132</td><td>200 uL 피펫 팁; 단백질 용액을 미세유체 채널 팁에 적용하기 위한 얇고 매끄러운 팁</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>53509-070</td><td>10 uL 피펫 팁; 소포 용액을 미세유체 채널에 적용하기 위한 얇고 매끄러운 팁</td></tr><tr><td>Orion Star A321 pH 측정기</td><td>Thermo Scientific</td><td>STARA3210</td><td>pH</td></tr><tr><td>측정기 Orion 마이크로 pH 프로브</td><td>Thermo Scientific</td><td>8220BNWP</td><td>마이크로 pH 프로브</td></tr><tr><td>N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid)</td><td>VWR</td><td>VWRB30487</td><td>HEPES, Free</td></tr><tr><td>Acid Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>BDH8014-2.5KGR</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>튜브</td><td>연합 와이어 및 케이블</td><td>TFT-200-24 N</td><td>내경: 0.020-0.026인치(0.051-0.066cm); 벽 두께: 0.010인치(0.025cm); 유연한 폴리테트라플루오로에틸렌 박벽 튜브; 천연 색소</td></tr><tr><td>질소 가스 - Industrial</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>현지 공급업체</td></tr><tr><td>산소 가스 - Industrial</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>로컬 공급업체</td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>로컬 공급업체</td></tr></tbody></table>

pip-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

수많은 세포 단백질이 막 표면과 상호 작용하여 필수 세포 과정에 영향을줍니다. 이러한 상호 작용은 phosphoinositides (PIPs)의 경우처럼 특정 세포 내 지방화 및 / 또는 활성화를 보장하기 위해 멤브레인 내의 특정 지질 성분을 향하게 할 수 있습니다. PIP와 세포질 PIP 결합 도메인은 세포 생리학에서 그들의 역할을 더 잘 이해하기 위해 광범위하게 연구되어 왔습니다. 우리는 protein-PIP 상호 작용을 연구하기위한 도구로서지지 된 지질 이중층 (SLBs)에 pH 조절 분석을 적용했습니다. 이 연구에서, pH 민감성 ortho- sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine은 protein-PIP 상호 작용을 검출하는 데 사용됩니다. 단백질이 PIP 함유 멤브레인 표면에 결합하면, 계면 전위가 조절되어 ( 즉 , 국소 pH 변화), 프로브의 양성자 화 상태가 변하게됩니다. pH 조절 분석의 성공적인 사용에 대한 사례 연구는 phospholipase C delta1 Pleckstr상동 (PLC-δ1의 PH) 도메인 및 예로서, 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트 (PI (4,5) P 2)의 상호 작용이다. 이 상호 작용에 대한 겉보기 해리 상수 ( K d, app )는 0.39 ± 0.05 μM이었고 , 다른 것들에 의해 얻어진 K d 값과 유사했다. 이전에 관찰 된 바와 같이, PLC-δ1 PH 도메인은 PI (4,5) P 2 특이 적이며, 포스파티딜 이노시톨 4- 인산염에 대한 약한 결합을 나타내며, 순수한 포스파티딜콜린 SLB에 대한 결합은 보이지 않는다. PIP-on-a-chip 분석은 낮은 샘플 부피 및 리간드 / 수용체 표지 요구 사항이 없지만 작은 및 낮은 친화도 막 상호 작용을 테스트 할 수있는 능력을 포함하되 이에 국한되지 않는 전통적인 PIP 결합 분석보다 유리합니다. 큰 분자 및 개선 된 신호 대 잡음비. 따라서, PIP-on-a-chip 접근법의 사용은 광범위한 막 상호 작용 메커니즘의 해명을 용이하게 할 것이다. 또한이 방법은 잠재적으로세포막과 상호 작용할 수있는 단백질의 능력을 조절하는 치료제를 확인하는데있어

우리는 PIP-on-a-chip 마이크로 디바이스 ( 그림 1 ) 내에서 PLC-δ1 PH 도메인 -PI (4,5) P 2 상호 작용을 연구하기 위해 pH 변조 분석을 사용했습니다. 상세한 프로토콜을 통해 마이크로 유체 소자 구성 요소를 준비 및 조립하고 소형 단층 소포 (SUV)를 만들고 ( 그림 2 ) 장치 내 SLB를 형성하고 ( 그림 3 ) PIP를 함유 한 SLB에 대한 단백질 결합을 테스트하는 방법을 시연했습니다. 일반적인 SLB 바인딩 실험의 흐름도가 그림 4에 묘사되어 있습니다. pH 조절 분석의 원리는 PH 도메인 -PI (4,5) P 2 결합을 예로 들어 그림 5에...

여기서 우리는 pH 조절에 기반한 라벨없는 방법을 사용하여 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용을 연구하기위한 마이크로 유체 플랫폼의 맥락에서지지 된 지질 이중층을 제시합니다.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

PIP-on-a-chip 분석의 전반적인 목표는 정량적 표지 없는 방식으로 단백질 멤브레인 상호 작용을 평가하는 것입니다. 단백질막 상호작용은 세포와 병원체의 수많은 과정의 핵심이지만, 이러한 상호작용을 연구하는 기술은 거의 없습니다. 이 기술의 장점은 단순 부피가 적고 리간드 또는 수용체 라벨링 요구 사항이 없으며 생리학적으로 관련된 방식으로 멤브레인 상호 작용을 테스트할 수 있다는 것입니다.바이러스의 많은 치료 표적은 막 단백질이며, 이러한 표적 단백질에 대한 연구는 종종 세제를 사용하여 용액에서 수행됩니다. 우리의 기술은 생물학적으로 더 관련성이 높은 대안을 제공합니다. 이 분석법이 단백질과 멤브레인의 상호 작용을 모니터링할 수 있다는 것을 알 수 있지만 실제로는 매우 다재다능한 분석법이며 철 막, 소분자 막 및 펩타이드 막 상호 작용을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.먼저 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 프리폴리머와 경화제를 대형 플라스틱 계량 보트에서 10:1 비율로 혼합합니다. 진공 강도가 500 tor 이하인 진공 상태에서 1시간 동안 혼합물의 가스를 제거합니다. 동일한 SU8 마이크로패턴의 여러 복제가 포함된 실리콘 마스터를 대형 플라스틱 계량 보트에 놓고 탈기 PDMS를 부은 다음 섭씨 60도의 건조 오븐에서 밤새 경화시킵니다.다음날 실리콘 마스터에서 PDMS를 손으로 부드럽게 떼어냅니다. 각 마이크로 패턴의 경계를 수술용 메스와 자를 사용하여 직사각형으로 표시합니다. 그런 다음 PDMS를 블록으로 자르고 생검 펀치로 각 마이크로 채널의 양쪽 끝에 16개의 구멍을 뚫어 직경 1.0mm의 구멍을 만듭니다.포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨 4, 5-비스포스페이트 및 pH 민감성 형광 프로브의 부피를 단일 20ml 유리 환기 바이알에 피펫으로 계산했습니다. 화학 흄 후드 내부의 질소 가스 흐름에서 혼합물을 10분 동안 또는 용매가 증발하고 바이알 바닥에 얇은 지질 막이 형성될 때까지 건조합니다. 그런 다음 10 밀리터의 진공 강도로 최소 3시간 동안 진공 상태에서 혼합물을 건조시켜 잔류 유기 용매를 제거합니다.건조된 지질막을 5ml의 러닝 버퍼로 재수화하고, 재수화된 지질을 실온에서 30분 동안 35킬로헤르츠의 작동 주파수로 초음파 수조에 넣습니다. 액체 질소와 섭씨 40도의 수조로 소포 현탁액을 동결 해동하여 단층 소포를 얻습니다. 동결 해동을 10회 반복하고, 지질 압출기를 사용하여 소포 현탁액을 0.1미크론 트랙 에지 폴리카보네이트 멤브레인으로 돌출시켜 작은 단층 소포를 농축합니다.압출을 10회 반복합니다. 물 세척 병을 사용하여 구멍을 통해 탈이온수를 분출하여 PDMS 블록의 입구와 출구가 막혔는지 테스트한 다음 질소 가스로 PDMS 블록을 건조시킵니다. 다음으로, PDMS 블록과 사전 세척된 커버 슬립을 산소 플라즈마 시스템 시료 챔버 내부에 놓습니다.PDMS 블록과 커버 슬립을 75와트의 전력 설정, 분당 10입방센티미터의 산소 흐름 속도 및 200밀리미터의 진공 강도로 45초 동안 산소 플라즈마로 노출시킵니다. 다음으로, 산소 플라즈마 처리 직후 PDMS 블록의 패턴면을 커버 슬립과 접촉하도록 배치한다. 부드럽게 눌러 접촉 부위의 기포를 제거합니다.접착력을 향상시키기 위해 섭씨 100도의 레벨 핫 플레이트에 장치를 3분 동안 놓습니다. 100% 에탄올이 함유된 보푸라기가 없는 젖은 물티슈를 사용하여 장치의 상단과 하단에서 먼지 입자를 제거합니다. 그런 다음 유리 현미경 슬라이드 위에 장치를 테이프로 붙입니다.작은 단층 소포를 포함하는 Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate 100 마이크로 리터를 0.65 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 6.4마이크로리터의 0.2 일반 염산을 첨가하여 용액의 pH를 약 3/2로 조정합니다. pH를 조정한 10마이크로리터의 피펫은 작은 일층 소포 용액을 주입구를 통해 각 채널로 들어가고 용액이 배출구에 도달할 때까지 피펫을 통해 압력을 가합니다.피펫에서 팁을 분리하고 장치에 부착된 상태로 둡니다. 각 채널에 대해 이 단계를 반복한 후 실온에서 10분 동안 장치를 배양하고 장치 조립 직후 마이크로 채널에 소포를 주입해야 합니다. 한편, 핀셋을 사용하여 입구 및 출구 튜브 세트를 자르고 출구 튜브 세트를 장치에 연결한 다음 장치를 현미경 스테이지에 테이프로 붙입니다.주입구 튜빙 세트의 한쪽 끝을 원뿔형 튜브에 들어 있는 25밀리리터의 러닝 버퍼에 담그고 테이프로 붙여서 튜브가 고정되었는지 확인합니다. 랩 잭을 사용하여 원뿔형 튜브를 장치보다 높은 곳에 놓고 중력 흐름을 통해 마이크로 채널을 통해 용액을 밀어 넣습니다. 각 주입 튜브에 대해 주사기를 사용하여 튜브의 자유 끝에서 1ml의 러닝 버퍼를 추출합니다.주입구에서 피펫 팁을 제거하고 주입구 튜브의 다른 쪽 끝을 장치에 삽입합니다. 이 과정을 반복하여 모든 입구 튜브 조각을 장치에 연결합니다. 채널을 통해 흐르는 버퍼는 파열되지 않은 과도한 소포를 제거하고 이중층을 실험 조건으로 평형을 이루는 데 도움이 됩니다.그런 다음 현미경 제어 소프트웨어를 엽니다. 왼쪽 패널에서 현미경 탭을 클릭하고 10x 대물렌즈를 선택합니다. 라이브를 클릭한 다음 도구 모음에서 Alexa 568 이미지 아이콘을 클릭하고 미세 및 거친 조정 노브를 사용하여 마이크로 채널에 초점을 맞춥니다.장치를 스캔하여 SLB 및 채널의 품질을 확인합니다. 그런 다음 도구 모음에서 FL 셔터 닫힌 이미지 아이콘을 클릭하고 획득 탭을 클릭한 다음 기본 조정에서 노출 시간을 선택합니다. 노출 시간을 200밀리초로 설정합니다.왼쪽 패널에서 multi-dimensional acquisition을 클릭합니다. 필터 메뉴에서 빨간색 채널을 선택합니다. 그런 다음 타임랩스 메뉴를 클릭하고 시간 간격을 5분으로, 지속 시간을 30분으로 설정하고 경과 메뉴를 설정합니다.측정 탭에서 원 도구를 선택하고 아무 채널에서나 원을 그립니다. 원이 선택된 상태에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 속성을 선택합니다. 프로필 탭에서 모든 T를 선택하여 형광 강도를 시간 함수로 표시합니다.다음 단계로 진행하기 전에 이 곡선이 평형을 나타내는 고원에 도달했는지 확인하고 버퍼 용액을 장치와 동일한 접지로 낮추어 흐름을 중지합니다. 한 번에 하나씩 각 배출구 튜브를 분리하고 피펫을 사용하여 각 단백질 희석액 200마이크로리터를 배출구 채널에 적용합니다. 압력을 가하지 말고 중력이 일을 하도록 하십시오.피펫에서 팁을 분리하고 마이크로 유체 장치에 부착된 상태로 둡니다. 각 채널에 대해 이 과정을 반복하고 이 과정에서 기포가 채널에 유입되지 않도록 합니다. 다음으로, 입구 튜브를 미세유체 장치 아래의 바닥으로 낮추어 마이크로 채널을 통해 단백질을 흐르게 합니다.튜브의 다른 쪽 끝을 폐기물 용기에 테이프로 붙입니다. pleckstrin homology domain의 희석액을 30분 동안 유동화합니다. 소프트웨어의 왼쪽 패널에 있는 타임랩스 탭에서 시작을 클릭하여 이미징을 다시 시작합니다.여기에 표시된 것은 마이크로 채널 내에서 SLB를 함유하는 Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate의 대표적인 모습입니다. 표시된 농도에서 pleckstrin 상동성 영역을 추가하기 전과 후. 마이크로 채널을 가로질러 스캔된 라인의 형광 강도는 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨 4 인산염 및 포스파티딜이노시톨 4, 5-비스포스페이트 결합 실험에 대한 거리 및 픽셀의 함수로 표시됩니다.그런 다음, 개별 실험에서 결합 데이터를 정규화하고, 포스포리파제 C 델타 1 플렉스트린 상동성 도메인 농도의 함수로 플롯하고, 겉보기 연관 상수를 추출하기 위해 결합 이소항에 맞춥니다. 겉보기 연관 상수를 비교하면 포스포리파아제 C Delta 1 pleckstrin 상동성 도메인이 예상대로 포스파티딜이노시톨 4, 5-비스포스페이트와 특이적으로 상호 작용함을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 당사의 PIP-on-a-chip 접근법과 함께 이 분석을 사용하여 작은 단층 소포를 만들고, 미세유체 장치를 만들고, 이러한 미세유체 장치 내부에 지지된 지질 이중층을 형성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 지질의 측면 확산에 대한 단백질 막 결합의 효과를 평가하기 위해 광 표백 후 형광 회수와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 한 번에 하나가 아닌 세포에서 발견되는 지질의 조립과 함께 단백질 막 상호 작용을 연구하는 길을 열며, 따라서 이 접근 방식은 단백질 막 상호 작용의 생화학 및 세포 생물학에 광범위하게 영향을 미칠 것입니다.

pip-on-chip-label-free-study-protein-phosphoinositide

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연구

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Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는 미세유체 플랫폼이라고 하는 지지된 지질 이중층의 포스파티딜에탄올아민 지질에 태그가 지정된 pH 민감 형광 염료를 사용하여 pH 조절 분석을 사용하여 미세유체 패턴의 단백질-포스포이노시티드 상호 작용을 시연합니다. 단백질이 인지질에 결합한 후 pH의 조절은 형광 소멸을 유발합니다.

단백질-포스포이노시티드 상호작용을 검출하기 위해 지원되는 지질 이중층에 대한 pH 조절 분석

Phosphoinositides는 상대적인 풍부 빠르게 다양한 자극에 대한 반응의 변화 지질 신호된다. 이 문서 추출 및 탈아 실화 다음 3 H-의 미오의 -inositol와 대사 라벨 세포에 의해 phosphoinositides의 풍부를 측정하는 방법을 설명합니다. 추출 글리세 inositides 후 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리하고, 섬광 유동에 의해 정량화된다.

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

PI (4,5) P (2)는 다양한 세포 기능을 조절하지만, 세포 세포막에서의 나노 조직 잘못 이해된다. 라벨 PI 플렉스 트린 상동 도메인에 융합 된 이중 색상 형광 프로브 (4,5) P (2)에 의해, 우리는 나노 미터 스케일에서 (4,5) P 원형질막 2 공간 분포를 PI를 연구하는 새로운 방법을 기술 .

소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

여기에 프로토콜 작은 분자 지질 ligand phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍2)을 정제 hEAG1 이온 채널 단백질의 상호 작용을 설명합니다. 측정 씨 소설 작은 분자 이온 채널 ligand 심사에 대 한 잠재적인 방법이 될 수 보여 줍니다.

바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

이 프로토콜은 이노 시 톨 인산 염 또는 인산 염에 바인딩하는 단백질의 식별에 초점을 맞추고. 그것은 아가로스 또는 자기 구슬에 streptavidin을 통해 고정되는 생물이노시톨 인산염 또는 인산화물과 친화성 크로마토그래피를 사용합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화결합 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 확인된다.

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

여기에서, 우리는 세포 및 조직으로부터 내인성 포스포단백질 포스파타제와 이들의 상호작용하는 단백질의 농축과 질량 분광법 기반 프로테오믹스에 의한 이들의 확인 및 정량화를 위한 프로토콜을 제시한다.

포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

외인성 hyaluronic의 산성 (HA)과 암 세포의 상호 작용의 고해상도 분석이 가능합니다 새로운 접근 방식이 설명되어 있습니다. 패턴의 표면은 carbodiimide 화학 및 microcontact 인쇄 결합하여 가공하고 있습니다.

Micropatterned 표면은 암세포와 Hyaluronic 산성 상호 작용을 연구하기 위해

라만 분광법은 비 접촉에 적합한 기술, 살아있는 세포, 조직 - 엔지니어링 구조와 기본 조직의 라벨이없는 분석입니다. 소스 고유의 스펙트럼 지문가 생성 및 복수 변수 분석을 사용하여 분석할 수 있습니다.

라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

배우세요 PIP-on-a-chip 기법을 이용한 라벨 없는 단백질-포스포이노시타이드 상호작용 정량 분석 방법입니다. 이 마이크로유체 플랫폼은 생리학적으로 관련성 높은 막 단백질 연구에 활용됩니다.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

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