PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

PIP-on-a-chip 분석의 전반적인 목표는 정량적 표지 없는 방식으로 단백질 멤브레인 상호 작용을 평가하는 것입니다. 단백질막 상호작용은 세포와 병원체의 수많은 과정의 핵심이지만, 이러한 상호작용을 연구하는 기술은 거의 없습니다. 이 기술의 장점은 단순 부피가 적고 리간드 또는 수용체 라벨링 요구 사항이 없으며 생리학적으로 관련된 방식으로 멤브레인 상호 작용을 테스트할 수 있다는 것입니다.

바이러스의 많은 치료 표적은 막 단백질이며, 이러한 표적 단백질에 대한 연구는 종종 세제를 사용하여 용액에서 수행됩니다. 우리의 기술은 생물학적으로 더 관련성이 높은 대안을 제공합니다. 이 분석법이 단백질과 멤브레인의 상호 작용을 모니터링할 수 있다는 것을 알 수 있지만 실제로는 매우 다재다능한 분석법이며 철 막, 소분자 막 및 펩타이드 막 상호 작용을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.

먼저 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 프리폴리머와 경화제를 대형 플라스틱 계량 보트에서 10:1 비율로 혼합합니다. 진공 강도가 500 tor 이하인 진공 상태에서 1시간 동안 혼합물의 가스를 제거합니다. 동일한 SU8 마이크로패턴의 여러 복제가 포함된 실리콘 마스터를 대형 플라스틱 계량 보트에 놓고 탈기 PDMS를 부은 다음 섭씨 60도의 건조 오븐에서 밤새 경화시킵니다.

다음날 실리콘 마스터에서 PDMS를 손으로 부드럽게 떼어냅니다. 각 마이크로 패턴의 경계를 수술용 메스와 자를 사용하여 직사각형으로 표시합니다. 그런 다음 PDMS를 블록으로 자르고 생검 펀치로 각 마이크로 채널의 양쪽 끝에 16개의 구멍을 뚫어 직경 1.0mm의 구멍을 만듭니다.

포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨 4, 5-비스포스페이트 및 pH 민감성 형광 프로브의 부피를 단일 20ml 유리 환기 바이알에 피펫으로 계산했습니다. 화학 흄 후드 내부의 질소 가스 흐름에서 혼합물을 10분 동안 또는 용매가 증발하고 바이알 바닥에 얇은 지질 막이 형성될 때까지 건조합니다. 그런 다음 10 밀리터의 진공 강도로 최소 3시간 동안 진공 상태에서 혼합물을 건조시켜 잔류 유기 용매를 제거합니다.

건조된 지질막을 5ml의 러닝 버퍼로 재수화하고, 재수화된 지질을 실온에서 30분 동안 35킬로헤르츠의 작동 주파수로 초음파 수조에 넣습니다. 액체 질소와 섭씨 40도의 수조로 소포 현탁액을 동결 해동하여 단층 소포를 얻습니다. 동결 해동을 10회 반복하고, 지질 압출기를 사용하여 소포 현탁액을 0.1미크론 트랙 에지 폴리카보네이트 멤브레인으로 돌출시켜 작은 단층 소포를 농축합니다.

압출을 10회 반복합니다. 물 세척 병을 사용하여 구멍을 통해 탈이온수를 분출하여 PDMS 블록의 입구와 출구가 막혔는지 테스트한 다음 질소 가스로 PDMS 블록을 건조시킵니다. 다음으로, PDMS 블록과 사전 세척된 커버 슬립을 산소 플라즈마 시스템 시료 챔버 내부에 놓습니다.

PDMS 블록과 커버 슬립을 75와트의 전력 설정, 분당 10입방센티미터의 산소 흐름 속도 및 200밀리미터의 진공 강도로 45초 동안 산소 플라즈마로 노출시킵니다. 다음으로, 산소 플라즈마 처리 직후 PDMS 블록의 패턴면을 커버 슬립과 접촉하도록 배치한다. 부드럽게 눌러 접촉 부위의 기포를 제거합니다.

접착력을 향상시키기 위해 섭씨 100도의 레벨 핫 플레이트에 장치를 3분 동안 놓습니다. 100% 에탄올이 함유된 보푸라기가 없는 젖은 물티슈를 사용하여 장치의 상단과 하단에서 먼지 입자를 제거합니다. 그런 다음 유리 현미경 슬라이드 위에 장치를 테이프로 붙입니다.

작은 단층 소포를 포함하는 Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate 100 마이크로 리터를 0.65 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 6.4마이크로리터의 0.2 일반 염산을 첨가하여 용액의 pH를 약 3/2로 조정합니다. pH를 조정한 10마이크로리터의 피펫은 작은 일층 소포 용액을 주입구를 통해 각 채널로 들어가고 용액이 배출구에 도달할 때까지 피펫을 통해 압력을 가합니다.

피펫에서 팁을 분리하고 장치에 부착된 상태로 둡니다. 각 채널에 대해 이 단계를 반복한 후 실온에서 10분 동안 장치를 배양하고 장치 조립 직후 마이크로 채널에 소포를 주입해야 합니다. 한편, 핀셋을 사용하여 입구 및 출구 튜브 세트를 자르고 출구 튜브 세트를 장치에 연결한 다음 장치를 현미경 스테이지에 테이프로 붙입니다.

주입구 튜빙 세트의 한쪽 끝을 원뿔형 튜브에 들어 있는 25밀리리터의 러닝 버퍼에 담그고 테이프로 붙여서 튜브가 고정되었는지 확인합니다. 랩 잭을 사용하여 원뿔형 튜브를 장치보다 높은 곳에 놓고 중력 흐름을 통해 마이크로 채널을 통해 용액을 밀어 넣습니다. 각 주입 튜브에 대해 주사기를 사용하여 튜브의 자유 끝에서 1ml의 러닝 버퍼를 추출합니다.

주입구에서 피펫 팁을 제거하고 주입구 튜브의 다른 쪽 끝을 장치에 삽입합니다. 이 과정을 반복하여 모든 입구 튜브 조각을 장치에 연결합니다. 채널을 통해 흐르는 버퍼는 파열되지 않은 과도한 소포를 제거하고 이중층을 실험 조건으로 평형을 이루는 데 도움이 됩니다.

그런 다음 현미경 제어 소프트웨어를 엽니다. 왼쪽 패널에서 현미경 탭을 클릭하고 10x 대물렌즈를 선택합니다. 라이브를 클릭한 다음 도구 모음에서 Alexa 568 이미지 아이콘을 클릭하고 미세 및 거친 조정 노브를 사용하여 마이크로 채널에 초점을 맞춥니다.

장치를 스캔하여 SLB 및 채널의 품질을 확인합니다. 그런 다음 도구 모음에서 FL 셔터 닫힌 이미지 아이콘을 클릭하고 획득 탭을 클릭한 다음 기본 조정에서 노출 시간을 선택합니다. 노출 시간을 200밀리초로 설정합니다.

왼쪽 패널에서 multi-dimensional acquisition을 클릭합니다. 필터 메뉴에서 빨간색 채널을 선택합니다. 그런 다음 타임랩스 메뉴를 클릭하고 시간 간격을 5분으로, 지속 시간을 30분으로 설정하고 경과 메뉴를 설정합니다.

측정 탭에서 원 도구를 선택하고 아무 채널에서나 원을 그립니다. 원이 선택된 상태에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 속성을 선택합니다. 프로필 탭에서 모든 T를 선택하여 형광 강도를 시간 함수로 표시합니다.

다음 단계로 진행하기 전에 이 곡선이 평형을 나타내는 고원에 도달했는지 확인하고 버퍼 용액을 장치와 동일한 접지로 낮추어 흐름을 중지합니다. 한 번에 하나씩 각 배출구 튜브를 분리하고 피펫을 사용하여 각 단백질 희석액 200마이크로리터를 배출구 채널에 적용합니다. 압력을 가하지 말고 중력이 일을 하도록 하십시오.

피펫에서 팁을 분리하고 마이크로 유체 장치에 부착된 상태로 둡니다. 각 채널에 대해 이 과정을 반복하고 이 과정에서 기포가 채널에 유입되지 않도록 합니다. 다음으로, 입구 튜브를 미세유체 장치 아래의 바닥으로 낮추어 마이크로 채널을 통해 단백질을 흐르게 합니다.

튜브의 다른 쪽 끝을 폐기물 용기에 테이프로 붙입니다. pleckstrin homology domain의 희석액을 30분 동안 유동화합니다. 소프트웨어의 왼쪽 패널에 있는 타임랩스 탭에서 시작을 클릭하여 이미징을 다시 시작합니다.

여기에 표시된 것은 마이크로 채널 내에서 SLB를 함유하는 Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate의 대표적인 모습입니다. 표시된 농도에서 pleckstrin 상동성 영역을 추가하기 전과 후. 마이크로 채널을 가로질러 스캔된 라인의 형광 강도는 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨 4 인산염 및 포스파티딜이노시톨 4, 5-비스포스페이트 결합 실험에 대한 거리 및 픽셀의 함수로 표시됩니다.

그런 다음, 개별 실험에서 결합 데이터를 정규화하고, 포스포리파제 C 델타 1 플렉스트린 상동성 도메인 농도의 함수로 플롯하고, 겉보기 연관 상수를 추출하기 위해 결합 이소항에 맞춥니다. 겉보기 연관 상수를 비교하면 포스포리파아제 C Delta 1 pleckstrin 상동성 도메인이 예상대로 포스파티딜이노시톨 4, 5-비스포스페이트와 특이적으로 상호 작용함을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 당사의 PIP-on-a-chip 접근법과 함께 이 분석을 사용하여 작은 단층 소포를 만들고, 미세유체 장치를 만들고, 이러한 미세유체 장치 내부에 지지된 지질 이중층을 형성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 지질의 측면 확산에 대한 단백질 막 결합의 효과를 평가하기 위해 광 표백 후 형광 회수와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 한 번에 하나가 아닌 세포에서 발견되는 지질의 조립과 함께 단백질 막 상호 작용을 연구하는 길을 열며, 따라서 이 접근 방식은 단백질 막 상호 작용의 생화학 및 세포 생물학에 광범위하게 영향을 미칠 것입니다.