Name: 3D-FRAP 현미경을 이용한 miRNA의 gap junction 의존적 전달 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 배우세요 3D-FRAP 현미경법을 이용하여 살아있는 심근세포에서 gap junction을 통해 microRNA가 세포 간 전달되는 과정을 실시간으로 정량화하고 시각화하는 방법을. 이 기술은 세포 간 소통 메커니즘 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 연방 교육 연구부 (FKZ 0312138A 및 FKZ 316159), 유럽 연합 구조 기금 (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 및 ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) 및 독일 심장 재단 (F / 01 / 12). 또한 RD는 Rostock University Medical Center (889001)의 FORUN 프로그램, DAMP Foundation 및 BMBF (VIP + 00240)의 지원을받습니다.

신생아 생쥐가 관련된이 프로토콜의 모든 단계는 Rostock University Medical Center의 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 세포 배양 용 접시의 준비 및 심근 세포 배양 용 배지 <ol><li> PBS에서 0.1 % 젤라틴으로 세포 배양 플레이트를 코팅하고 37 ° C에서 4 시간 또는 4 ° C 밤새 인큐베이션하십시오. 젤라틴을 제거하고 멸균 층류 공기 흐름 하에서 건조 시키십시오. </li><li> 10 % 태아 소 혈청 (FBS)과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)가 보충 된 DMEM 50 ML로 구성된 세포 배양 배지를 준비합니다. 37 ° C로 예열하십시오. </li></ol> 2. 신생아 심근 세포의 분리 <ol><li> 멸균 가위로 목을 베고 신생아 생쥐 (1 ~ 2 일 된)를 희생시키고 흉골을 따라 가슴을 엽니 다. 포어를 사용하여 가슴을 약간 제거하면서 가슴을 제거하고 심장을 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어있는 24-well plate에 옮긴다.(Ca 2+ 및 Mg 2+ 없이). </li><li> 살균 포셉을 사용하여 비 심장 조직 및 큰 혈관을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어있는 1.5 ML 튜브로 청소 마음을 전송하십시오. 효소 소화에는 튜브 당 최대 5 개의 하트를 사용하십시오. </li><li> 작은 가위로 가슴을 0.5-1mm³ 이하로 말하십시오. </li><li> 다량의 심장을 HBSS로 2 회 씻어 낸다. 1 mL microliter 피펫을 사용하여 HBSS를 흡입 / 첨가한다. 효소를 첨가하기 전에 HBSS를 완전히 제거하십시오. </li><li> 신생아 심장의 효소 소화를 위해서는 시중에서 구입할 수있는 키트를 사용하고 제조업체의 프로토콜 ( Table of Materials 참조)을 따르십시오. 35 분 동안 37 ° C에서 효소와 함께 잠복하면서 매 5 분마다 다진 하트가 담긴 튜브를 흔든다. </li><li> 비 - cardiomyocyte 분수의 준수를 허용 1.5-2 시간 세포 배양 배지를 포함하는 비 코팅 세포 배양 접시에 종자 세포를 중단. 높은 순도라면이 단계를 반복하십시오.의 심근 세포가 필요합니다. 원하는 경우, 비 - cardiomyocyte 분수를 추가로 배양하십시오. 참고 : 15 하트의 세포 현탁액의 경우, 75 cm² 세포 배양 플라스크에서 사전 도금 단계를 수행 할 수 있습니다. 일반적으로 한 신생아 심장에서 ~ 5 x 10 5 세포를 얻습니다. </li><li> 300 x g에서 10 분간 15 mL 원추형 튜브와 원심 분리기에서 뜨는 물을 수집합니다. 세포 배양 매체 1 ML에 세포를 Resuspend. </li><li> Neubauer 챔버 hemocytometer로 세포를 계산하거나, 동등한 방법을 사용하십시오. </li><li> 플레이트는 3 x 10 5 cells / cm²의 밀도를 지닌 6- 웰 플레이트상의 분리 된 심근 세포를 분리 하였다. 37 밤새 세포를 품어 ° C 5 % CO 2 . 참고 : 선택적으로이 시점에서 세포를 트랜 스펙 션 할 수도 있습니다. 그러나 일주일 동안 배양 한 후 일렉트로 포 레이션 (electroporation)을 실시 할 때 증가 된 생존력이 관찰되었다. </li></ol> 3. Fluorescently Labeled miRNA를 사용한 형질 감염 <ol><li> 사전 -따뜻한 세포 배양 배지 (단계 1.2 참조)를 수 욕조 또는 이와 동등한 장치에서 37 ° C로 가열합니다. </li><li> RNase가없는 멸균 수에서 형광성 miRNA의 20 μM 축적 용액을 준비하십시오. </li><li> 90 MM Na 2 HPO 4 , 90 MM NaH 2 PO 4 , 5 MM KCl, 10 MM MgCl 2 및 10 MM sodium succinate가 들어있는 일렉트로 포 레이션 버퍼를 준비하고 7.2로 pH를 조절하십시오. electroporation 버퍼는 -20 ° C에서 몇 개월 동안 저장할 수 있습니다. </li><li> 5 분 0.05 % 트립신을 사용하여 문화 요리에서 세포를 분리하십시오. 세포 배양 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화시킨다. </li><li> Neubauer 챔버 hemocytometer로 세포를 계산하거나, 동등한 방법을 사용하십시오. 10 분 동안 300 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 100 μL 당 4 X 10 5 세포의 농도를 얻기 위해 일렉트로 포 레이션 버퍼에 세포를 Resuspend. </li><li> 튜브에 형광 miRNA (최종 농도 : 0.25 μm의)와 세포 현탁액의 100 μL를 혼합하고혼합물을 전기 천공 큐벳에 넣는다. <ol><li> 세포 유형에 따라 적절한 양의 miRNA를 경험적으로 결정하십시오. </li></ol></li><li> &quot;G - 009&quot;프로그램을 사용하여 일렉트로 포 레이션 장치 (물질 표 참조)를 사용하여 일렉트로 포 레이션을 수행하십시오. </li><li> 사전 예열 세포 배양 매체 500 μL를 추가하고 4 - 웰 유리 바닥 챔버 슬라이드의 우물에 전체 세포 현탁액 (4 X 10 5 세포)을 전송합니다. 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 하루 동안 세포를 배양하십시오. 참고 : FRAP 분석의 경우 ~ 80 %의 셀 밀도가 최적입니다. 분류 된 miRNA의 transfection은 electroporation을 사용하여 독점적으로 수행해야합니다. 분류 된 miRNA 분자의 균질 한 분포가 FRAP 측정에 유리하므로, 시약 기반 형질 감염은 권장하지 않습니다. </li></ol> 4. 3D-FRAP 현미경 검사 (3 일) 적용 <ol><li> 현미경 배양기를 37 °로 예열하십시오.C와 열 평형을 확립하고 표류의 가능성을 줄이기 위해 FRAP 측정 전에 적어도 2 시간 공 촛점 현미경 시스템을 전환합니다. 가능하면 5 % CO2 대기를 유지하십시오. </li><li> 스테이지 슬라이드 홀더에 챔버 슬라이드를 삽입합니다. </li><li> 1.4 NA 오일 대물 렌즈 (400 배율)와 낮은 레이저 출력에서 ​​561 nm의 레이저 여기 광을 사용하여 570-680 nm의 검출 범위로 트랜 스펙 션 된 심근 세포의 클러스터를 찾으십시오. 참고 : FRAP 설정, 이미지 획득 및 분석의 정의는 현미경 전용 소프트웨어를 사용하여 수행했습니다 ( 재료 표 참조). </li><li> &quot;Setup Manager&quot;에서 &quot;z-Stack&quot;, &quot;Time Series&quot;, &quot;Bleaching&quot;및 &quot;Regions&quot;버튼을 활성화하십시오. </li><li> FRAP 매개 변수를 정의하십시오. <ol><li> &quot;획득 모드&quot;메뉴에서 &quot;프레임 크기&quot;를 설정하여 이미지 획득 설정을 정의하십시오4; 512 x 512, &quot;라인 단계&quot;를 1로, &quot;스캔 시간&quot;을 1 초 미만으로 설정하십시오. </li><li> &quot;Channels&quot;메뉴에서 레이저 파워, 오프셋 및 게인 설정을 조정하여 최소 레이저 여기에서 최대 형광을 얻습니다 ( 예 : 레이저 출력 : 1-5 %). 강도 채도를 피하기 위해 조정하십시오. &quot;핀홀 크기&quot;를 2 μm로 설정하십시오. </li><li> 다음으로 &quot;Regions&quot;메뉴에서 &quot;ROI drawing tool&quot;을 선택하고 커서를 사용하여 대상 셀, 참조 셀 및 배경 영역을 표시합니다. 필요한 경우, 표백을 위해 여러 표적 세포를 선택하십시오. </li><li> &quot;표백&quot;메뉴 ( 예 : 반복 : 9-14, 광 표백을위한 레이저 출력 : 100 %, 이미지 획득 간격 : 60 초,주기 : 15)에서 표백 설정을 조정하십시오. 3 회 초기 스캔 후 표백 시작을 정의하십시오. </li><li> &quot;z-Stack&quot;메뉴에서 셀의 두께에 따라 Z- 스택 획득을위한 한계를 정의하십시오. &quot;숫자 o 조정f z-layers &quot;를 12 - 15로 설정합니다. </li><li> FRAP 실험을 시작하고 형광 복구를 기록합니다. 참고 : FRAP 실험의 설정은 세포 유형, 형광 염료 및 현미경 시스템에 따라 다르므로 파일럿 실험을 수행하여 FRAP에 대한 최적 매개 변수를 결정하는 것이 가장 좋습니다. 표백은 초기 형광 강도를 50 % 이상 줄이는 데 충분해야합니다. 일반적으로 형광 복구는 고원 단계에 도달 할 때까지 30-60 초마다 기록해야합니다. </li></ol></li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 획득 한 z- 스택의 최대 투사를 생성하고 표백 된 표적 세포, 참조 세포 및 배경의 형광 강도 값을 얻습니다. 현미경 전용 소프트웨어를 사용하여 &quot;Processing&quot;→ &quot;Maximum intensity projection&quot;→ 파일 선택 → &quot;Apply&quot;를 클릭하십시오. <ol><li> 또는, 동급 이미지 분석 도구 ( <e예를 들어, ImageJ). </li></ol></li><li> 대상 세포, 배경 및 참조 세포의 모든 시점에서 형광 강도 데이터를 스프레드 시트에 복사합니다. <ol><li> 획득 과정에서 발생한 photobleaching을 수정하기 위해 대상 세포의 강도 값에서 참조 셀의 배경 강도와 강도를 뺍니다. 각 시점에 대한 배경 및 기준 셀 보정을 수행하십시오. </li><li> 표백 전 초기 형광 강도로 각 값을 나눔으로써 보정 된 FRAP 데이터를 초기 형광 강도로 표준화하십시오. </li><li> FRAP 곡선을 얻으려면 각 시점의 강도 값에서 빼서 표백 직후의 형광 강도로 기준선을 설정하십시오. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+state-of-the-art%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: state-of-the-art.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).</li>
<li>Raghunathan, S., Patel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+implications+of+small+interfering+RNA+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases.</a> Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).</li>
<li>Sluijter, J. P. G. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/journals/isrn/2013/593517/">MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation.</a> ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).</li>
<li>Li, M., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+MicroRNAs%3A+Potential+and+Emerging+Biomarkers+for+Diagnosis+of+Cardiovascular+and+Cerebrovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases.</a> Biomed Res Int. , 1-9 (2015).</li>
<li>Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+cardiovascular+disease%3A+an+introduction+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians.</a> Heart. 101 (12), 921-928 (2015).</li>
<li>Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+and+pannexin+signaling+in+gastrointestinal+and+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease.</a> Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).</li>
<li>Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+connexin+43+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of connexin 43 in cardiovascular diseases.</a> Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).</li>
<li>Naus, C. C., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+and+challenges+of+connexin+connections+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Implications and challenges of connexin connections to cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).</li>
<li>Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+modulate+glioma+invasion+by+direct+transfer+of+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA.</a> Oncotarget. 6 (17), Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.impactjournals.com/oncotarget">http://www.impactjournals.com/oncotarget</a> 15566-15577 (2015).</li>
<li>Lee, H. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+deliver+synthetic+microRNA+mimics+to+glioma+cells+and+glioma+stem+cells+and+inhibit+their+cell+migration+and+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal.</a> Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).</li>
<li>Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+microRNA+is+transferred+between+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Functional microRNA is transferred between glioma cells.</a> Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).</li>
<li>Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+mediated+miRNA+intercellular+transfer+and+gene+regulation%3A+A+novel+mechanism+for+intercellular+genetic+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication.</a> Sci Rep. 6, 19884(2016).</li>
<li>Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+connexin26+mutants+associated+with+human+hearing+loss+have+trans-dominant+effects+on+connexin30%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30.</a> Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).</li>
<li>Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+gap+junctions+in+monolayer+and+three-dimensional+cultures+of+human+tendon+cells+using+fluorescence+recovery+after+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching.</a> J Biomed Opt. 19 (1), 15001(2013).</li>
<li>Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+requires+a+biphasic+modulation+of+gap+junctional+intercellular+communication+caused+by+dynamic+changes+of+connexin43+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).</li>
<li>Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+shuttling+of+miRNA+-+A+novel+pathway+of+intercellular+gene+regulation+and+its+prospects+in+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application.</a> Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).</li>
<li>Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+connexin43+in+the+EGF%2FEGFR+signalling+during+self-renewal+and+differentiation+of+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells.</a> Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).</li>
<li>Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).</li>
<li>Laupheimer, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/journals/bmr/2014/182645/">Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient.</a> Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+enhance+the+antiproliferative+effect+of+microRNA-124-3p+in+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells.</a> J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).</li>
<li>Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mobility+to+crosstalk.+A+model+of+intracellular+miRNAs+motion+may+explain+the+RNAs+interaction+mechanism+on+the+basis+of+target+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Math+Biosci%22%5BJournal%5D)">From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization.</a> Math Biosci. 280, 50-61 (2016).</li>
<li>Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+single+molecule+microscopy+reveals+two+kinetically+distinct+pathways+for+microRNA+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly.</a> EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).</li>
<li>Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+photobleaching%2C+laser+illumination+unbinds+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins.</a> J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).</li>
<li>Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+generation+and+calcium+increase+induced+by+visible+light+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).</li>
<li>Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA%3A+Function%2C+detection%2C+and+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis.</a> Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).</li>
<li>Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNA+expression+profiles+in+normal+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues.</a> BMC Genomics. 8 (1), 166(2007).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nat Commun. 2, 282(2011).</li>
<li>Squadrito, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+RNAs+Modulate+MicroRNA+Sorting+to+Exosomes+and+Transfer+to+Acceptor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells.</a> Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).</li>
<li>Zhang, B., Farwell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs%3A+a+new+emerging+class+of+players+for+disease+diagnostics+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).</li>
<li>Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+delivery+of+miRNAs+for+cancer+therapy%3A+Challenges+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).</li>
</ol>

저자는 아무런 이해 상충을 선언하지 않습니다.

<html> miRNA는 세포 생리학에서 중요한 역할을 담당하며, 다른 것들 중에서도 GJ를 세포 간 교환을위한 경로 11 , 12 , 22 로 사용함으로써 신호 분자로 작용하는 것으로 나타났습니다. 현재 프로토콜 세포 클러스터 내에서 형광 miRNAs를 사용 하여이 GJ 의존 shuttling을 특성화 하는 체외 라이브 셀 이미징 기술을 제공합니다. 프로토콜은 세포 모델 시스템으로 cardiomyocytes에 개발되었습니다. 그러나, electroporation이 miRNA transfection에 적합한 방법이라면이 접근법은 여러 세포 유형에 적용될 수 있습니다. 세포 간 교환 외에도 제시된 기술은 miRNA 분자의 세포 내 이동성을 조사하는데도 적합합니다 ( 예 : 세포 내에...

작은 noncoding RNA는 세포 유전자 조절에서 중요한 역할을합니다. 이 분자는 특정 표적 mRNA에 결합하는 20-25 개의 뉴클레오타이드로 이루어져 번역의 막힘 또는 mRNA 분해 1 또는 2를 유도합니다. miRNA와 siRNA와 같은 작은 RNA에 의해 수행되는 유전자 조절 과정은 많은 다른 종에서 발견 된 매우 보전 된 메커니즘입니다 3 . 특히, miRNA 분자는 증식, 분화 및 재생을 포함한 다양한 생리적 과정에 매우 중요합니다. 또한, miRNA 발현의 조절 장애는 많은 병리학 적 장애로 인한 것입니다. 그에 상응하여, miRNA는 진단을위한 바이오 마커 및 유전자 요법을위한 치료제로서 적합하다는 것이 입증되었습니다 6 , 7 </sup&gt;. GJ는 분자량이 1kD 인 분자를 확산 교환 할 수있는 인접한 두 세포의 원형질막에 특화된 단백질 구조입니다. 그들은 조직 발달, 분화, 세포 사멸, 암이나 심혈관 질환과 같은 병리학 적 장애에 중요한 것으로 밝혀졌습니다 8 , 9 , 10 . 여러 분자가 이온, 대사 산물 및 뉴클레오타이드를 포함하여 GJ 채널을 통과 할 수 있다고 기술되어 왔습니다. 흥미롭게도 GJ는 작은 RNA 11,12 의 세포 간 이동을위한 경로를 제공하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서, miRNAs는 생산 된 세포 내에서뿐만 아니라 수용 세포 내에서 작용할 수 있습니다. 이것은 세포 간 신호 전달 시스템에서 miRNA의 역할을 강조합니다. 동시에, 데이터는그 gap junctional intercellular communication은 miRNA 기능과 밀접하게 연관되어있다. 조직 항상성, 병리학 및 진단에 대한 miRNA 및 GJ의 중요한 영향으로 인해 GJ의 기능과 miRNA의 관련 세포 간 역학에 대한 포괄적 인 이해는 miRNA 기반 질병의 메커니즘을 명확히하고 새로운 전략을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. miRNA 치료법. gap junctional coupling의 정도에 따라 세포 간 miRNA 분자의 이동은 매우 신속한 과정이 될 수 있습니다. 따라서, 이들 조절 신호 분자의 빠른 세포 간 이동의 시각화 및 정량화를 가능하게하는 방법론이 요구된다. 일반적으로 작은 RNA 11 , 12 , 13 , 14 의 왕복을 입증하기 위해 유동 세포 계측법과 분자 생물학적 기술이 적용되었습니다. 그러나 FRAP 마이크로와는 달리이러한 접근법은 GJ를 통한 miRNA 교환을 분석 할 때 높은 시간 해상도가 필요하지 않습니다. 더욱이 FRAP 현미경 검사법은 덜 침습적이므로 여러 세포 유형에서 GJ에 의존하는 분자의 교환을 평가하는 강력하고 새로운 생체 ​​영상 기술입니다 15 , 16 , 17 . 여기, 우리는 cardiomyocytes 사이에 miRNA 셔틀을 평가하는 3D - FRAP의 응용 프로그램을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시한다. 이 목적을 위해, 형광성으로 표지 된 miRNA로 심근 세포를 형질 감염시켰다. 이 miRNA로 표시된 세포는 광 표백되었고, 인접한 세포로부터 다시 유입되는 gap junctional miRNA는 시간 의존적으로 기록되었다. FRAP 실험의 높은 시간 해상도는 살아있는 세포 사이의 miRNA 및 siRNA의 세포 간 전달을 정확하게 평가하기위한 운동 연구를 수행 할 수있는 가능성을 제공합니다. 모레 오ver., 작은 RNA는 매우 다른 동력학을 가진 다른 메커니즘을 통해 교환 될 수 있기 때문에, FRAP 현미경 검사는 GJ가 각각의 왕복 운동 과정에 얼마나 관여 하는지를 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 3D-FRAP은 GJ 투과성의 생리 학적 및 병리학 적 변화와 작은 RNA 전이에 미치는 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다 15 , 19 .

<table><tbody><tr><td>신생아 NMRI 마우스</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td>PBS의 0.1% 용액, 멸균</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s 변형 배지</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-03550</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100&micro; g/mL</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Pan Biotech</td><td>P30-3306</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스틱</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1차 심근세포 분리 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88281</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88281</td><td>1차 심근세포 분리 키트에 포함됨</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN Dy547 표지 microRNA Mimic</td><td>Dharmacon</td><td>CP-004500-01-05</td><td>RNAse 자유 수, 원액 20&micro에 용해; M</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td>성 <td>시그마</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>Carl Roth</td><td>T877.2</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Serva</td><td>28305.01</td><td></td></tr><tr><td>호박산나트륨</td><td>Carl Roth</td><td>3195.1</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신/EDTA 용액</td><td>Merck</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>4-well- 유리 바닥 챔버 슬라이드</td><td>IBIDI</td><td>80827</td><td>코팅은 0.1% 젤라틴 용액이 포함된</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector II</td><td>Lonza</td><td></td><td>프로그램 G-009가 전기천공법에 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1 시스템</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 소프트웨어</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-actinin 항체</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>Connexin43 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9059</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 Alexa 594 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11005</td><td>희석 1:300</td></tr><tr><td>염소 anti-rabbit Alexa 488 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>희석 1:300</td></tr><tr><td>Connexin43 siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM16708 ID158724</td><td>최종 농도 250 nM</td></tr><tr><td>근적외선 라이브/데드 셀 염색 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Calcein Red-Orange</td><td>Thermo Scientific</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 핵 염색</td><td>써모 사이언티픽</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

3d-frap 현미경을 이용한 mirna의 gap junction 의존적 전달 분석

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

miRNA 및 siRNA와 같은 작은 안티센스 RNA는 세포 생리학 및 병리학에서 중요한 역할을하며, 또한 여러 질병의 치료에서 치료제로 사용될 수 있습니다. miRNA / siRNA 치료를위한 새롭고 혁신적인 전략의 개발은 근본적인 메커니즘에 대한 광범위한 지식을 기반으로합니다. 최근의 데이터는 작은 RNA가 갭 접합부 (gap junction-dependent) 방식으로 세포들 사이에서 교환 됨으로써 수용 세포에서 유전자 조절 효과를 유도 함을 시사한다. 분자 생물학적 기법과 유동 세포 계측 분석은 일반적으로 miRNA의 세포 간 교환을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나, 이러한 방법은 높은 시간 해상도를 제공하지 못하며, 이것은 분자의 갭 접합 플럭스를 연구 할 때 필요하다. 따라서 miRNA / siRNA가 세포 간 신호 전달 분자로서의 영향을 조사하기 위해서는 이러한 작은 RNA를 세포 수준에서 분석 할 수있는 새로운 도구가 필요합니다. 현재의 프로토콜은 ap(3 차원 - FRAP) 현미경 검사 후 3 차원 형광 복구의 plication은 심장 세포 사이의 갭 접합 - 의존적 인 miRNA 분자의 교환을 해명합니다. 중요한 것은,이 간단하고 비 침습적 인 라이브 셀 이미징 접근 방식은 높은 시공간 해상도로 실시간으로 형광 표지 된 작은 RNA의 갭 접합 셔틀 링의 시각화 및 정량화를 허용합니다. 3D-FRAP에서 얻은 데이터는 작은 RNA가 세포 간 네트워크 내에서 신호 분자로 작용하는 세포 간 유전자 조절의 새로운 경로를 확인합니다.

여기, 신생아 cardiomyocytes 이내 형광 miRNA의 간격 junctional 셔틀을 연구 비 침습적 인 기술로 3D - FRAP 현미경을 제시합니다. 분리 된 심근 세포는 전형적으로 흘린 α- 액티 닌 패턴을 나타내었고, 세포 간 경계 ( 그림 1A , 흰 화살촉)를 따라 Cx43의 큰 플라크를 포함하여 분자간의 높은 세포 간 플럭스를 허용했다. 단리 된 심근 세포의 순도는 α-actinin 양성 세포의 현미경 적 정량으로 평가 하였다. 일부 비 - 심근 세포 (α- 악티닌 - 음성 세포)가 배양 물에 존재 하였지만, 신생아의 심근 세포는 분리 후 주요 세포 유형을 나타내었다 (79.62 ± 3.68 %, 도 1B ). miRNA의 gap j...

여기, 우리는 miRNA의 갭 접합 종속 셔틀 (gap junction-dependent shuttling) 분석을위한 광 표백 (photobleaching) 후 3 차원 형광 복구 (3D-FRAP)의 응용을 기술한다. 일반적으로 적용되는 방법과는 달리, 3D-FRAP은 높은 시공간 해상도로 실시간으로 작은 RNA의 세포 간 전달을 정량화합니다.

3D-FRAP 현미경을 이용한 miRNA의 gap junction 의존적 전달 분석

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 살아있는 심근세포에서 간극 결합(gap junction) 의존적인 마이크로 RNA의 이동을 조사하는 것입니다. 이 방법은 세포 간 신호 전달 체계에서 마이크로 RNA의 역할을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포 내에서 마이크로 RNA의 간극 결합 교환을 높은 시공간 해상도로 시각화하고 정량화할 수 있다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 심근세포를 분리한 후, 3 × 10⁵ cells/cm²의 밀도로 6-웰 플레이트에 세포를 분주합니다. 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 세포에 0.5 trypzine을 첨가하고 5분 동안 배양하여 세포를 탈착시킵니다.세포 배양액을 첨가하여 트립신을 불활성화합니다. 세포 수를 측정한 후, 300 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 전기천공 버퍼를 사용하여 세포를 100 µL당 4 × 10⁵ cells의 농도로 재현탁합니다.다음으로, 튜브에 100 µL의 세포 현탁액과 형광 micro RNA를 넣고 혼합한 후, 혼합물을 전기천공 큐벳에 로딩합니다. 그런 다음 전기천공 장치의 G009 프로그램을 사용하여 전기천공을 수행합니다. 미리 데워둔 세포 배양액 500 µL를 첨가하고, 세포 현탁액 전체 부피를 4-웰 유리 바닥 챔버 슬라이드의 웰로 옮깁니다.세포를 37 °C, 5% CO₂ 분위기에서 하루 동안 배양합니다. 현미경 인큐베이터를 예열하고 컨포컬 시스템을 켠 후, 챔버 슬라이드를 스테이지 샘플 홀더에 삽입합니다. 1.4 NA 오일 대물렌즈와 561 nm 레이저 여기광을 사용하고, 낮은 레이저 출력과 570~680 nm의 검출 범위에서 형질전환된 심근세포 클러스터를 찾습니다.다음으로, 설정 관리자(setup manager)에서 z-stack, time series, bleaching 및 regions 버튼을 활성화합니다. 그런 다음 FRAP 파라미터를 정의하기 위해 획득 모드(acquisition mode) 메뉴에서 프레임 크기를 512 by 512로, 라인 스텝(line step)을 1로, 스캔 시간을 1초 미만으로 설정합니다. 채널 메뉴에서 레이저 출력, 오프셋 및 게인 설정을 조정하여 강도 포화를 방지하면서 최소한의 레이저 여기로 최대 형광을 얻을 수 있도록 합니다.그런 다음 핀홀 크기를 2 µm로 설정하십시오. 다음으로, 영역 메뉴에서 ROI 그리기 도구를 선택하고 커서를 사용하여 표적 세포, 기준 세포 및 배경 영역을 표시하십시오. 필요한 경우, 광탈색(photobleaching)을 위해 여러 개의 표적 세포를 선택하십시오.표백(bleaching) 메뉴에서 광표백 설정을 조정하십시오. 그다음, z-stack 메뉴에서 세포의 두께에 따라 z-stack 획득 범위를 정의하십시오. z-layer 수를 12~15개로 조정한 후, FRAP 실험을 시작하고 형광 회복 과정을 기록하십시오.데이터를 분석하려면 현미경 전용 소프트웨어를 사용하여 획득한 z-stack의 최대 투영(maximum projection) 영상을 생성하십시오. processing, maximum intensity projection을 클릭하고 파일을 선택한 후 apply를 누릅니다. 마지막으로 타겟, 배경 및 참조 세포의 모든 시점에서의 형광 강도 데이터를 스프레드시트로 복사하고 텍스트 프로토콜에 따라 데이터 분석을 수행하십시오. 여기에는 전형적인 가로무늬 alpha actinin 패턴과 세포 간 경계를 따라 형성된 커넥신43(connexin43)의 거대한 플라크가 관찰되는 분리된 심근세포가 나타나 있습니다.배양물에 일부 비심근세포가 존재했습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 유세포 분석을 통해 45%의 형질전환 효율을 달성했습니다. 또한, 생존-사멸 분석(live-dead assay) 결과 대부분의 세포가 높은 생존력을 보였으며, 이는 간극 결합 통신(gap junctional communication)을 분석할 때 매우 중요합니다.FRAP 분석을 위해 세포 군집 내에서 표적 세포를 선택하고 100% 레이저 출력으로 광탈색하여, 선택된 세포 내의 마이크로 RNA 형광을 감소시켰습니다. 획득한 데이터의 정량 분석 및 표준화 결과, 평균 20%의 회복률을 보였습니다. 본 실험에서 siRNA 매개 knockdown을 통한 connexin43의 억제는 단백질 발현 감소와 간극 연접 통신(gap junctional communication)의 저해로 이어졌습니다. 형광 회복이 50% 이상 감소한 것은 마이크로 RNA 전이 효율이 세포 간의 간극 연접 결합에 크게 의존한다는 것을 나타냅니다.이 그림은 FRAP 실험의 3D 표면 렌더링을 보여줍니다. 최대 투영법(maximum projections)과 비교하여, z-stack 획득은 세포 내 micro RNA의 국소화와 이동성을 조사하기 위한 3D 재구성 모델을 생성하는 데 사용될 수 있습니다. 숙달되면, FRAP 측정은 적절하게 수행될 경우 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 인접한 세포의 수가 유사한 표적 세포를 선택하는 것이 중요합니다. 또한, 광독성 효과를 방지하기 위해 표백 파라미터와 이미지 획득 조건을 적절히 선택해야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 세포 클러스터 내에서 micro RNA의 이동을 정량화하고 시각화하기 위해 FRAP 현미경을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

analysis-gap-junction-dependent-transfer-mirna-with-3d-frap

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 가까이 높은 콘트라스트와 시간적 해상도의 세포 표면 구조를 관찰하기위한 강력한 방법입니다. 우리는 TIRF은 세포 벽 - 동봉된 세균과 곰팡이 세포의 피질에서 단백질 역학을 공부 고용 수있는 방법을 보여줍니다.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

우리는 살아있는 세포에서 갭 접합을 통해 셀룰러 통신을 시각화 루시퍼 노란색의 단일 세포 미세 주입을 수행하고 몇 가지 유용한 팁을 제공하는 방법을 여기에 대해 설명합니다. 우리는이 논문으로 인해 기능 갭 접합에 세포 결합의 정도를 평가하기 위해 모두 도움이 될 것으로 기대하고있다. 여기에 설명 된 모든 1,000 달톤 이하의 분자량을 가진 다른 형광 염료에 적응 원칙적으로 될 수있다.

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 촬상 실시간 세포 생물학 연구를위한 강력한 도구이다. 여기서, 종래의 표면 형광 현미경을 사용하여 생리적 3 차원 히드로 겔 미세 환경에서 FRET 촬상 세포위한 방법이 제시된다. 활성 범위에 걸쳐 선형 비율을 산출 비율 적 FRET 프로브에 대한 분석을 설명한다.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

여기, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 TIRFM를 사용하여 리포좀과 미세 유체 채널에 지원 이중층 사이에 하나의 SNARE 매개 융합 이벤트를 감지하는 프로토콜을 제시한다. 지질 용해성화물 분리를 동시에 검출 할 수있다. 리포좀의 크기, 지질 확산과 융합 기공 특성을 측정한다.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

개별 번역 이벤트를 추적하면 캡 종속 번역 메커니즘에 대한 고해상도 운동 연구를 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표지된 항체와 에피토프 태그가 달린 초기 성 펩티드 사이의 화상 진찰 상호 작용에 근거를 둔 체외 단일 분자 분석체를 보여줍니다. 이 방법은 활성 체외 캡 의존 변환 동안 개시 및 펩티드 신장 운동의 단일 분자 특성화를 가능하게한다.

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

여기서는 형광 표지된 microRNA의 풍부함에 대한 체외 평가를 통해 microRNA 패키징의 역학을 연구하고 세포외 소포체(EV)로 내보낼 수 있는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

유세포 분석을 사용하여 세포외 소포체로의 miRNA 방출 추적

배우세요 3D-FRAP 현미경법을 이용하여 살아있는 심근세포에서 gap junction을 통해 microRNA가 세포 간 전달되는 과정을 실시간으로 정량화하고 시각화하는 방법을. 이 기술은 세포 간 소통 메커니즘 연구에 활용됩니다.

3D-FRAP 현미경을 이용한 miRNA의 gap junction 의존적 전달 분석

더 많은 동영상 탐색