3D-FRAP 현미경을 이용한 miRNA의 gap junction 의존적 전달 분석

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 심근세포에서 마이크로 RNA의 간극연접에 따른 전달을 조사하는 것입니다. 이 방법은 세포간 신호 거래 시스템에서 마이크로 RNA의 역할을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마이크로 RNA의 간극 접합 교환을 높은 공간 시간 해상도로 살아있는 세포에서 시각화하고 정량화할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 심근세포를 분리한 후, 제곱센티미터당 5번째 세포까지 10의 3배 밀도로 6개의 웰 플레이트에 세포를 플레이트화합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음 날, 세포에 0.5 트립진을 첨가하고 5분 동안 배양물을 배양하여 세포를 분리합니다.

세포 배양 배지를 첨가하여 트립진을 비활성화합니다. 세포를 계수한 후 300배 g에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 electroporation 완충액을 사용하여 100 마이크로 리터 당 5 번째 세포까지 4 배 10에서 세포를 다시 현탁시킵니다.

다음으로, 100마이크로리터의 세포 현탁액과 형광 마이크로 RNA를 튜브에 혼합하고 혼합물을 전기천공법 큐벳에 로드합니다. 다음 electroporator에 G009 프로그램을 사용하여 electroporation를 실행하십시오. 500마이크로리터의 예열된 세포 배양 배지를 추가하고 전체 부피의 세포 현탁액을 4웰 유리 바닥 챔버 슬라이드의 웰로 옮깁니다.

섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 대기에서 하루 동안 세포를 배양합니다. 현미경 인큐베이터를 예열하고 confucal 시스템을 켠 후 챔버 슬라이드를 스테이지 샘플 홀더에 삽입합니다. 낮은 레이저 출력에서 570 - 680 나노미터의 검출 범위로 1.4 na 오일 대물렌즈와 561 나노미터 레이저 여기광을 사용하여 transvected cardiomyocytes의 클러스터를 찾습니다.

그런 다음 설정 관리자에서 z-stack, time series, bleaching 및 regions 버튼을 활성화합니다. 그런 다음 frap 매개변수를 정의하려면 획득 모드 메뉴에서 프레임 크기를 512 x 512로, 라인 단계를 1로, 스캔 시간을 1초 미만으로 설정합니다. channels 메뉴에서 laser power, offset 및 gain 설정을 조정하여 최소 레이저 여기에서 최대 형광을 얻고 강도 포화를 방지합니다.

그런 다음 핀홀 크기를 2마이크로미터로 설정합니다. 그런 다음 영역 메뉴에서 로이 그리기 도구를 선택하고 커서를 사용하여 대상 셀, 참조 셀 및 배경 영역을 표시합니다. 필요한 경우 광 표백을 위한 여러 표적 세포를 선택합니다.

표백 메뉴에서 사진 표백 설정을 조정합니다. 그런 다음 z-stack 메뉴에서 셀의 두께에 따라 z-stack 획득에 대한 제한을 정의합니다. z 레이어의 수를 12 tp 15로 조정 한 다음 frap 실험을 시작하고 형광 회수를 기록합니다.

데이터를 분석하려면 현미경 특정 소프트웨어를 사용하여 획득한 z-스택의 최대 투영을 생성하고, 처리를 클릭하고, 최대 강도 투영을 선택하고, 파일을 선택하고, 적용합니다. 마지막으로, 대상, 배경 및 참조 셀의 모든 시점에서 형광 강도 데이터를 스프레드시트에 복사하고 텍스트 프로토콜에 따라 데이터 분석을 수행합니다. 여기에 표시된 것은 세포에서 세포 경계를 따라 전형적인 줄무늬 알파 액티닌 패턴과 connexin43의 큰 플라크를 가진 분리된 심근세포입니다.

일부 비심근세포(non-cardiomyocyte)가 배양에 존재했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 유세포 분석에 의해 45%의 transvection 효율에 도달했습니다. 또한, live-dead 에세이에서는 대다수의 세포가 높은 생존력을 보였음을 밝혔는데, 이는 간극연접 통신을 분석할 때 중요합니다.

frap 분석을 위해 세포 클러스터 내에서 타겟 세포를 선택하고 100% 레이저 출력으로 광 표백하여 선택한 세포의 micro RNA 형광을 감소시킵니다. 수집된 데이터의 정량적 분석 및 정규화는 평균 20%의 회수율을 보여주었습니다.이 실험에서 siRNA는 connexin43의 녹다운을 매개하여 단백질 발현을 감소시키고 간극연접 커뮤니케이션을 억제했습니다. 형광 회수율이 50% 이상 감소한 것은 miro RNA 전달의 효율이 세포 간 간극연접 결합에 크게 의존한다는 것을 나타냅니다.

이 그림은 frap 실험의 3D 표면 렌더링을 보여줍니다. 최대 투영과 비교하여 z-스택을 획득하면 세포 내 마이크로 RNA의 국소화 및 이동성을 조사하기 위한 3D 재구성을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 일단 마스터하면 프랩 측정이 제대로 수행되면 2-3시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 인접한 셀의 수가 비슷한 대상 셀을 선택하는 것이 중요합니다. 또한 광독성 효과를 피하기 위해 표백 매개변수와 이미지 획득 조건을 선택해야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 클러스터 내에서 마이크로 RNA의 움직임을 정량화하고 시각화하기 위해 frap 현미경을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.