Name: 헬러의 HDAC1 및 HDAC6의 동시 측정 셀 사용 하 여 UHPLC MS (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 학습하세요 UHPLC-MS를 활용하여 HeLa 세포에서 HDAC1과 HDAC6 활성을 동시에 측정하는 방법을. 이 기술은 선택적 HDAC 억제제의 약물 발견 연구에 활용됩니다.

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저자 인정 비용 작업 CM1406 (Epigenetic 화학 생물학). 이 간행물에 보고 된 연구 피에르 메 르 시 재단에 의해 지원 되었다.

1. 세포 배양
참고: 다음 단계는 표준 조직 문화 후드에서 수행 됩니다. 메 마른 기술 친숙으로 예상 된다.
<ol>
	<li>헬러 세포 10% 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린 G 보충 MEM에 T75 셀 문화 플라스 크에서 80 %confluency 문화 (100 U/mL), 고 스 (100mg/mL). 참고: 셀 문화, 치료, 그리고 세포 단계 층 류, 5% CO2 메 마른 조건 하에서 습도 분위기에서 수행 하는 37 ° C에서 셀 인큐베이션 단계에서 수행 됩니다.</li>
	<li>DPBS의 5 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 발음 DPBS, 세포 분리 시 약의 1 mL을 추가. 셀을 분리 하려면 5 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>MEM 문화 매체의 9 mL를 추가, 철저 하 게 셀 서 스 펜 션, resuspend 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>6 x 104 셀/ml MEM에 세포 현 탁 액의 밀도 조정 합니다.</li>
	<li>100 µ L 셀 서 스 펜 션의 컨트롤을 추가 하 고 (그림 1A) 살 균, 평면-바닥, 조직 문화 취급 96 잘 접시의 우물을 테스트.</li>
	<li>96 잘 접시 (그림 1A)의 빈 우물에 MEM 문화 매체의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>24 h 동안 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어. 참고: 24 시간 보육 생 HDAC 활동 HeLa 세포에 대 한 테스트에 적합 한 시간 이다. 알 수 없는 HDAC 활동으로 다른 세포 유형 제어 셀 timecourse 평가 할 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 세포 치료 테스트와 HDAC 기판
<ol>
	<li>96 잘 접시의 우물에서 매체 발음</li>
	<li>추가 테스트 화합물 x 2의 25 µ L (예를 들어, trichostatin, MS275, 및 tubastatin A) 웰 스를 테스트 하려면 메모리에. 제어 및 빈 우물에 MEM의 25 µ L를 추가 합니다. 참고: 테스트 화합물의 농도 이상 5 최종 테스트 농도 (1 농도 잘 당)의 범위를 제공 하기 위해 조정 될 것입니다. 복합 테스트에서 DMSO 최종 농도 0.5%를 넘지 말아야 한다 고에 공백 및 컨트롤을 포함 하 여 각 잘 동일 해야 합니다. 최종 부 화 볼륨 잘 당 50 µ L입니다. Trichostatin A 500에서 1.95에 이르기까지 5 농도에서 테스트 nM (희석 1:4). MS275 및 tubastatin A 8000에서 6.17에 이르기까지 5 농도에서 테스트 nM (1:6 희석). 원하는 최종 테스트 농도 복합 각 테스트에 대 한 복용량 응답 곡선을 작성 하 여 각 개별 사용자에 의해 결정 되어야 합니다.</li>
	<li>제어 및 테스트 웰을 기판 혼합물 (말, MOCPAC의 42 µ M 및 MEM에 BATCP의 42 µ M의 42 µ M)의 25 µ L를 추가 합니다. 빈 우물에 MEM의 25 µ L를 추가 합니다. 참고: 각 기판의 최종 농도 21 µ M. MOCPAC와 BATCP 각각 HDAC1와 HDAC6 활동 사이 구별 (그림 1B). 활동이 그 기판으로 관찰은, 말의 사용 다른 HDAC isoform에 대 한 활동의 식별 잠재적으로 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>습도 5%에서 8 h 동안 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어 CO2 배양 기. 참고:이 보육 시간 HeLa 세포에 적합 이며 생 HDAC 합성 기질 상호 작용을 수 있습니다. 다른 셀 라인 보육 시간 및 기질 농도 조정 필요할 수 있습니다.</li>
</ol>
3. 세포 세포의 용 해 및 UHPLC-ESI-MS/MS에 대 한 샘플 준비
주의: 샘플 준비 단계 높은 가연성 및 독성 섭취 또는 흡입에 의해 유기 화학 물질을 사용 합니다. 적절 한 개인 보호 장갑, 보호 안경 등을 착용 합니다.
<ol>
	<li>6 x RIPA 버퍼 (10 x RIPA 버퍼에서 희석) 96 잘 접시의 각 음에 protease 억제제와 보충의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>각 우물에 감기 이기의 160 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 하 고 아래로 pipetting으로 혼합. 참고:이 단계 전에-20 ° C에는 이기 유지.</li>
	<li>10 분-80 ° C 냉장고에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>접시를 냉장고에서 제거 하 고-살 균 원뿔 바닥 (V-아래) 96 잘 접시에 220 µ L의 각 콘텐츠를 전송. 5000 x g와 10 분 동안 4 ° C에서 격판덮개 원심 참고:이 단계는 단백질과 염 분 제거에서 목표로 합니다. 필요한 경우 솔루션은 원심 분리 전에 개별 원뿔 원심 분리기 튜브로 전송 하거나 96-글쎄, 0.65 μ m PVDF 필터 플레이트의 집합을 통해 필터링 수 있습니다. 침전의 성공적인 제거는 UHPLC 분석 전에 필요 합니다.</li>
	<li>UHPLC 시스템 호환 96 잘 접시에 상쾌한 (또는 여과 액)의 200 µ L를 전송 하 고 peelable, heat-sealing 호 일 접시 마감재를 사용 하 여 그것을 봉인. 참고: 제거는 supernatants 때 펠 릿 pipetting 하지 마십시오. UHPLC 분석 즉시 수행할 수 없는 경우는 플레이트 분석까지 24 h의 최대 4 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>
4. UHPLC/MS-MS 분석
<ol>
	<li>모바일 단계 시스템 (95% A:5 %B)으로 작성 하 여 UHPLC 시스템을 준비: A: H2O, HPLC 급 포함 된 0.1% 개미 산 (준비 1 L) B: 이기, HPLC 급, 0.1% 개미 산을 포함 (1 L 준비). 주의: 모바일 단계 높은 가연성 및 독성 섭취 또는 흡입에 의해 유기 화학 물질을 포함 합니다. 적절 한 개인 보호 장갑, 보호 안경 등을 착용 합니다.</li>
	<li>플레이트 홀더를 포함 하는 샘플 관리자에 96 잘 접시를 놓습니다. 표 1에 제공 된 UHPLC-ESI-MS/MS 조건에 따라 샘플을 실행 합니다. 참고: 모든 열 분석 96 잘 접시의 있어야 컨트롤 잘 한 빈 잘 (같이 접시 체계 그림 1A의). 컨트롤은 테스트 셀 라인에서 100% 효소 활동의 대표 공백 MS 소스 일관 된 백그라운드를 제공 하 고 있는지 여부를 확인 하는 동안. 주어진된 빈에서 발견 하는 특이 한 MS 봉우리 MS 감도 변화를 방지 하기 위해 조사 한다.</li>
</ol>
5. 데이터 분석
<ol>
	<li>적절 한 UHPLC 통합 소프트웨어와 각 기판 및 그것의 deacetylated 제품의 최대 영역을 통합 합니다. 참고: 자동 통합 매개 변수를 사용 하 여 다듬기 방법 (평균, 창 크기 3, 및 2, 예를 들면 매끄러운 수). 표 1에 제공 된 컬럼에 조건 사용 하 여, 차입 순서는 dMAL (5.8 분), dBATCP (6.0 분), dMOCPAC (6.2 분), 말 (7.6 분), MOCPAC (8.9 분), 그리고 BATCP (9.8 분), 그림 1C에서 같이.</li>
	<li>각 기질에 대 한 (deacetylated/acetylated) 각 크로마 (테스트 및 컨트롤 샘플)에서 피크 지역 비율을 계산 합니다.</li>
	<li>각 테스트 샘플의 백분율 HDAC 저해를 계산. 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55878/55878eq1.jpg"> 참고: HDAC1 저해 dMOCPAC/MOCPAC;의 피크 면적 비를 사용 하 여 계산 HDAC6 억제는 dBATCP/BATCP으로 계산 됩니다. 일반 HDAC 저해 표현 하 비율 dMAL/말을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

HDAC 저해 약물 발견, 암 치료21HDAC6-선택적 억제제에 현재 초점에서 뜨거운 주제입니다. HDAC 선택도 일반적으로 개별 HDAC isoforms21으로 억제 효능을 결정 하는 높은 처리량, 셀 무료 분석 실험의 시리즈에 의해 평가 됩니다. 그러나, 억제제의 선택도 확인 되어야 합니다 또한 살아있는 세포에서 히스톤과 같은 내 생 단백질 기판의 acetylation 상태를 평가 하 여 (에 대 한 클래스 I HDACs) 및 tubulin (HDAC6)에 대 한. 따라서, 세포 항 체 인식 (예를 들어, immunostaining, 서쪽 오 점, cytometry, 고 애 란)를 포함 분석 실험은 일반적으로 필요한 isoform의 양적 또는 반 양적 평가 달성 하기 위해 생활에 주어진된 화합물의 힘21세포. 그것은 드문 셀 무료 효소 분석 결과에서 선택적 되었다 화합물 비-선택적 ...

HDACs 효소 chromatin 구조 내에서 히스톤 deacetylate 수의 가족에 속한다. 그들은 또한 다른 단백질 기판은 cytosol에서 있고 다양 한 셀 구획에 있습니다. 18 HDAC isoforms의 총 세포 신호 뿐만 아니라 녹음 방송 요인 유전자 발현의 규칙을 포함 하 여 몇 가지 셀 메커니즘에 관련 된 고1,2,3,,45,,67수송 지금까지 확인 된. HDAC 촉매 억제제는 암 치료에 대 한 잠재적인 치료 약물으로 떠오르고 있다. 현재 FDA에 의해 승인 대부분 HDAC 억제제 T-세포 림프 종 및 다 발성의 치료에 대 한 되며 vorinostat (사), belinostat, panobinostat,89등 일반적인 HDAC 저 해제. 그러나, 부작용의 시리즈 팬-억제제, 연관 된 고 isoform 특정 작은 분자에 대 한 검색의 약 화학과 약물 발견에 뜨거운 주제입니다. 따라서, 클래스 I (HDAC1-3와 HDAC8) 선택적 억제제 romidepsin는 이미 승인 된 약10, HDAC6 특정 억제제는 현재 임상 시험, 다중 골 수 종11,12,13,,1415에 증가 치료 잠재력.
HDAC 특성 분석 실험 심사 억제제 (단일 isoform, 핵 추출 물, 또는 세포 lysate) 효소 소스와 HDAC 기판의 외피에 근거한 다. 기판은 일반적으로 N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (말)16등 쪼갤 fluorophore (예: coumarin), 결합 틸 리 진 잔류물을 포함 하는 작은 펩 티 드 순서. Isoform 특정 활동을 구분 하기 위해 각 isoform를 포함 하는 별도 셀 무료 분석 필요 하 고 살아있는 세포에서 진짜 isoform 활동을 반영 하지 않을 수도 있습니다. Isoform 특정 기판 벤 질 등 상업적으로 사용할 수 있습니다 (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 특정 기판)와 (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic 산 tert-부 틸 에스테 르 (BATCP, HDAC6 특정 기판) (그림 1B). 그러나, 말을 포함 하는 다중 기판 혼합물, MOCPAC, 및 BATCP 살아있는 세포에 게 주어진 것입니다 허용 하지 개별 deacetylated 제품의 탐지 fluorometric 측정에 의해 그들은 동일한 쪼갤 fluorophore를 품는.
여기 설명 하는 방법을 검색 및 각 기판 및 UHPLC-ESI-MS/MS 분석17다음 멀티 기판 분석 결과 사용 하 여 헬러 세포에 그것의 deacetylated 제품의 상대적 정량화 할 수 있습니다. HDAC 분석 결과 HDAC 억제 활동의 및 내 인 성 HDACs에 시험 화합물의 특이성의 직접 식별 수 있도록 HeLa 세포에 실시 됩니다. 동시에 평가 되는 HDAC1 및 HDAC6에 초점이 이다. 위해 단일 외피 분석 결과에서 이러한 효소 측정, 비 및 특정 HDAC 기판의 혼합물 96 잘 접시에 도금 처리와 치료 HeLa 세포에 추가 됩니다. 인큐베이션 단계 세포는 기질 및 그들의 각각 반응 제품을 구분 되 고 UHPLC MS 메서드 (그림 1C)을 사용 하 여 검출 하 lysed 됩니다. 말, MOCPAC, 및 BATCP 기판의 deacetylated 제품 이다 deacetylated 말 (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC), 그리고 deacetylated BATCP (dBATCP), 각각. 복용량 응답 곡선 활성 화합물으로 만들 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55878/55878fig1.jpg"> 
그림 1: 여러 기판의 UHPLC MS 분석에 의해 HDAC1 및 HDAC6 관련 억제제를 식별 하기 위해 셀 기반 HDAC 분석 결과 대 한 일반적인 구성표. 전형적인 96 잘 접시 포함 하는 치료 (시험 화합물)의 (A) 체계 및 치료 (제어) 헬러 세포 뿐 아니라 셀 무료 공백. (B) 기판 내 생 HDACs에 의해 deacetylated 혼합 (21 µ M 각)으로 추가의 화학 구조. (C) 추가 기판 (말, MOCPAC, 및 BATCP) 및 그들의 deacetylated 제품의 봉우리를 보여주는 전형적인 UHPLC-MS 크로마 (dMAL, dMOCPAC, 그리고 dBACTP, 각각). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55878/55878fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>BATCP</td><td>시그마-알드리치</td><td>B4061</td><td></td></tr><tr><td>MAL</td><td>시그마-알드리치</td><td>SCP0168</td><td>동의어: BOC-Ac-Lys-AMC</td></tr><tr><td>MOCPAC</td><td>시그마-알드리치</td><td>M2195</td><td></td></tr><tr><td>MS275 시</td><td>그마-알드리치</td><td>EPS002</td><td></td></tr><tr><td>트리코스타틴 A</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8552</td><td></td></tr><tr><td>투바스타틴 A</td><td>시그마-알드리치</td><td>SML0044</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴, HPLC 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td></td></tr><tr><td>포름산, LC/MS 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>10596814</td><td></td></tr><tr><td>H2O,</td><td>Milli-Q 정제 시스템을 통해 여과된 HPLC 등급</td><td></td><td></td> 증류 H2O</tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>ATCC CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>세포 해리 시약 TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 세포 배양 등급</td><td>Applichem</td><td>146463</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>10x RIPA 완충액</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast 프로테아제 억제제 정제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트, 멸균, 평면 바닥, 조직 배양 처리 Corning</td><td>VWR</td><td>29442-058</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트, 비멸균, V-바닥 Corning</td><td>VWR</td><td>29442-404</td> 원<td>심분리 단계에서 사용</td></tr><tr><td>96웰 플레이트, 원뿔형 바닥,</td><td></td><td>Acquity UHPLC 시스템</td><td></td></tr><tr><td>T75 세포 배양 플라스크와</td> 호환되는 Nunc ThermoFisher Scientific 249944 Corning <td>Sigma-Aldrich CLS430641</td><td></td><td></td></tr><tr><td>박리 가능한 열 밀봉 호일</td><td>Waters</td><td>186002789</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC 시스템</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-413-323</td><td></td></tr><tr><td>통합 소프트웨어: MassLynx V4.1</td><td>Waters</td><td></td><td>카탈로그 번호 사용 불가</td></tr><tr><td>Combi thermo-sealer SP-0669/240</td><td>Waters</td><td></td><td>카탈로그 번호 사용 불가</td></tr><tr><td>Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td><td>Waters</td><td></td><td>카탈로그 번호 사용 불가</td></tr></tbody></table>

헬러의 hdac1 및 hdac6의 동시 측정 셀 사용 하 여 uhplc ms

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

새로운 히스톤 deacetylase (HDAC) 억제제에 대 한 검색 증가 약물 발견에 대 한 관심입니다. Isoform 선택 romidepsin, 클래스의 승인부터 스포트 라이트에서 되었습니다 내가 HDAC 억제제 암 치료, 그리고 여러 발성에 대 한 HDAC6 전용 억제제의 임상 조사에 대 한. 현재 메서드는 HDAC1 및 HDAC6 셀에 테스트의 금지 활동을 결정 하는 데 사용 됩니다. Isoform 활동 초 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (MS UHPLC) 분석의 특정 기판 처리와 치료 HeLa 세포와 알을 품을 사용 하 여 측정 됩니다. 메서드는 환경 내에서 셀 셀 무료 생 화 확 적인 분석 실험 격리 isoforms에 달리 생 HDAC 활동 반영의 이점이 있다. 또한, 합성 기판의 정량화에 기반 하기 때문에 메서드는 생 acetylated 단백질의 항 체 인식이 필요 하지 않습니다. 그것은 쉽게 여러 셀 라인 및 자동화 된 프로세스에 적응입니다. 메서드는 이미 neuroblasts에서 HDAC6-선택적 화합물을 찾는 유용한 증명 했다. 대표 결과 표준 HDAC 억제제 trichostatin는 (일반적인), MS275 이전으로 여기에 표시 됩니다 (HDAC1 전용), 및 tubastatin (HDAC6-특정) 헬러 세포를 사용 하 여.

HDAC1에 대 한 비 선택 및 선택적 억제제를 식별 하는 방법의 응용 프로그램을 (종류 I)와 HDAC6 (클래스 IIb), HeLa 세포는 알려진된 표준 화합물으로 치료 했다: trichostatin A (비-선택적 HDAC1와 HDAC6 사이)18, MS275 (HDAC1-선택적 억제제)19및 tubastatin (HDAC6-선택적 억제제)20. 현재 방법 (그림 1)를 사용 하 여 IC50 값 수 수 직접 정한 살아있는 세포에 (봐서 MOCPAC deacetylation) HDAC1 및 HDAC6 (BATCP deacetylation 보고) (그림 2). Trichostatin A HDAC1와 HDAC6 강력한 ...

현재 메서드 여러 기판의 UHPLC MS 분석에 의해 HeLa 세포에서 히스톤 deacetylases (HDAC)의 isoform 특정 억제제를 식별 하는 역할. 이것은 생활에서 HDAC1 및 HDAC6 활동을 반영 하기 위해 개발 된 항 체 없는 메서드를 단일 isoform 셀 무료 분석 달리 셀 환경.

헬러의 HDAC1 및 HDAC6의 동시 측정 셀 사용 하 여 UHPLC MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

이 방법의 전반적인 목적은 단일 초고성능 액체 크로마토그래피 질량 분석(UHPLC-MS) 어세이를 사용하여 화합물의 HDAC 억제 가능성을 결정하고, 세포 내에서 HDAC6 또는 HDAC1에 대한 선택성을 확인하는 것입니다. 이 방법은 생존 세포 내에서 HDAC 억제제가 Class I HDAC보다 HDAC6에 선택적인지 여부를 결정하는 것과 같이 신약 개발 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포, 억제제 및 선택적 기질을 이용한 단 한 번의 배양 단계만으로 두 가지 HDAC 이소폼에 대한 효능을 동시에 결정할 수 있다는 점입니다.이 기술은 내인성 단백질 아세틸화 분석을 피하면서 살아있는 세포 내에서 HDAC6 선택성이 유지되는지를 검출하기 때문에, 선택적 HDAC 억제제의 조기 신약 개발로 그 활용 범위가 확대될 수 있습니다. 이 방법은 HeLa 세포에서 HDAC 억제제의 선택성을 평가하지만, 일차 세포나 임상 검체를 포함한 다른 종양 세포와 같은 다른 세포주에도 적용 가능합니다. 10% fetal bovine serum, penicillin G 및 streptomycin이 첨가된 minimal essential media가 담긴 T75 세포 배양 플라스크에서 HeLa 세포를 80% 밀도로 배양하십시오.Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline 5 mL로 세포를 두 번 세척합니다. 그 다음, 완충액을 흡입하여 제거하고 세포 해리 시약 1 mL를 첨가합니다. 세포를 분리하기 위해 37 °C에서 5분 동안 배양합니다.5분 후, 세포에 MEM 배양 배지 9 mL를 첨가하고 세포 현탁액을 충분히 재현탁합니다. 세포를 새로운 15 mL 튜브로 옮긴 다음, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. MEM 내 세포 현탁액의 밀도를 mL당 60,000 cells로 조정합니다.다음으로, 멸균된 평평한 바닥의 조직 배양 처리된 96-well 플레이트의 대조군 및 실험군 웰에 세포 현탁액 100 µL를 추가합니다. 그런 다음, 96-well 플레이트의 공백 웰에 MEM 배양 배지 100 µL를 추가합니다. 96-well 플레이트를 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다.96웰 플레이트의 웰 내 배지를 흡입하여 제거합니다. 배지를 흡입하는 동안 웰에서 세포가 탈착되어 제거되지 않도록 주의하십시오. 이는 흡입 속도를 낮게 설정하고, 흡입 팁을 웰 바닥의 모서리 부분에 조심스럽게 배치함으로써 수행할 수 있습니다.그 다음, Trichostatin A, MS275 및 Tubastatin A를 포함하여 MEM에 희석된 2배 농도의 테스트 화합물 25 µL를 테스트 웰에 첨가합니다. 대조군 및 공백 웰에는 MEM 25 µL를 첨가합니다. 이어서, 대조군 및 테스트 웰에 기질 혼합물 25 µL를 첨가합니다. 마지막으로, 공백 웰에 MEM 25 µL를 첨가합니다.96-웰 플레이트를 습도가 유지되는 5% 이산화탄소 배양기에서 37°C로 8시간 동안 배양합니다. 세포 용해를 수행하려면, 먼저 프로테아제 억제제가 첨가된 6배 농도의 RIPA 버퍼 10µL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 각 웰에 차가운 아세토니트릴 160µL를 첨가하여 반응을 중단시키고, 피펫팅으로 위아래로 섞어줍니다.플레이트를 -80 °C 냉동고에 10분 동안 보관합니다. 냉동고에서 플레이트를 꺼내 각 웰의 내용물 220 µL를 비멸균 원추형 바닥 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 5,000 ×g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 상층액 200 µL를 UHPLC 시스템과 호환되는 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 그다음, 플레이트 실러를 사용하여 박리 가능한 열 밀봉 호일로 플레이트를 밀봉합니다. 이동상 시스템을 채워 초고성능 액체 크로마토그래피 질량 분석 시스템을 준비합니다.플레이트 홀더가 포함된 샘플 매니저에 96-웰 플레이트를 넣습니다. 본문에 기재된 UHPLC ESI MS/MS 조건에 따라 샘플을 분석합니다. 데이터 분석을 수행하려면, 적절한 UHPLC 통합 소프트웨어를 사용하여 각 기질과 그 탈아세틸화 생성물의 피크 면적을 적분합니다.각 기질에 대해, 각 크로마토그램에서 아세틸화 대비 탈아세틸화된 피크 면적 비율을 계산합니다. 이때 테스트 샘플과 대조군 샘플을 모두 포함하십시오. 마지막으로, 텍스트 프로토콜의 공식에 따라 각 테스트 샘플의 HDAC 억제 백분율을 계산합니다.시료의 UHPLC-MS 크로마토그램이 여기에 제시되어 있습니다. 세포에 첨가된 기질에 해당하는 피크는 서면 프로토콜의 표 1에 기술된 질량 전이에 따라 검출됩니다. MOCPAC은 HDAC1에 의해 탈아세틸화되어 탈아세틸화된 MOCPAC 피크를 생성합니다.마찬가지로, BATCP는 HDAC6에 의해 탈아세틸화되어 탈아세틸화된 BATCP 피크를 생성합니다. 마지막으로, MAL은 여러 내인성 HDAC의 비특이적 탈아세틸화를 반영하는 탈아세틸화된 MAL 피크를 제공합니다. 여기에서는 HDAC 억제제인 Trichostatin A의 서로 다른 농도로 얻은 크로마토그램 그림이 제시되어 있습니다. 표준 HDAC 억제제에 대한 용량 반응 평가가 수행되었습니다.MOCPAC 및 dMOCPAC에서 얻은 적분값은 HDAC1에 대한 표준 억제제의 효능을 계산하는 데 사용되었습니다. IC₅₀ 계산 결과, 선택적 Class I HDAC 억제제인 MS275가 알려진 HDAC6 억제제인 Tubastatin A보다 HDAC1에 대해 더 낮은 IC₅₀ 값을 나타냈습니다. 반면, BATCP 및 dBATCP에서 얻은 분리값은 HDAC6에 대한 표준물질의 효능을 계산하는 데 사용되었습니다.이번 실험에서는 Tubastatin A가 MS275보다 낮은 IC 50 값을 나타내어, 이들의 아이소폼 선택성 프로파일을 확인하였습니다. Trichostatin A는 강력한 비선택적 억제제입니다. 이 기술을 숙달하면 세포 처리 시간과 96 웰 플레이트 분석을 포함하여 적절히 수행했을 때 72시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 여기에 명시된 배양 시간은 HeLa 세포 기준임을 유념하는 것이 중요합니다. 다른 세포주를 사용하는 경우, 이 시간을 최적화해야 합니다. 본 절차를 따르면, 특정 기질이 존재하는 한 다른 동형 단백질의 선택적 HDAC 억제 활성을 측정할 수 있습니다.유기 용매 및 기타 화학 물질을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 보호 안경, 장갑 및 실험복을 착용해야 함을 잊지 마십시오.

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연구

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헬러의 HDAC1 및 HDAC6의 동시 측정 셀 사용 하 여 UHPLC MS

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