헬러의 HDAC1 및 HDAC6의 동시 측정 셀 사용 하 여 UHPLC MS

이 방법의 전반적인 목표는 단일 초고성능 액체 크로마토그래피 질량 분석 분석을 사용하여 화합물의 HDAC 억제 가능성을 측정하고 세포에서 HDAC6 또는 HDAC1에 대한 선택성을 확인하는 것입니다. 이 방법은 살아있는 세포에서 HDAC 억제제가 Class I HDAC보다 HDAC6에 선택적인지 여부를 결정하는 것과 같은 약물 발견 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 두 개의 HDAC 동형에 대한 효능을 동시에 측정하기 위해 세포, 억제제 및 선택적 기질을 사용한 단일 배양 단계가 필요하다는 것입니다.

이 기술의 의미는 내인성 단백질 아세틸화 분석을 피하면서 살아있는 세포에서 HDAC6 선택성이 유지되는지 여부를 감지하기 때문에 선택적 HDAC 억제제의 조기 약물 발견으로 확장됩니다. 이 방법은 HeLa 세포에서 HDAC 억제제의 선택성을 평가하지만, 임상 검체를 포함한 1차 및 기타 종양 세포와 같은 다른 세포주에도 적용할 수 있습니다. 10% 소 태아 혈청, 페니실린 G 및 스트렙토마이신이 보충된 최소한의 필수 배지에서 T75 세포 배양 플라스크에서 HeLa 세포를 80% 포화도로 배양합니다.

Dulbecco의 인산염 완충 식염수 5ml로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 완충액을 흡입하고 1ml의 세포 해리 시약을 추가합니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 배양하여 세포를 분리합니다.

5분 후, 9ml의 MEM 배양 배지를 세포에 추가하고 세포 현탁액을 완전히 재현탁합니다. 세포를 새로운 15ml 튜브로 옮긴 다음 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 세포 현탁액의 조밀도를 60, MEM에 있는 밀리리터 당 000의 세포에 조정하십시오.

다음으로, 100마이크로리터의 세포 현탁액을 멸균되고 평평한 바닥, 조직 배양 처리된 96웰 플레이트의 제어 및 테스트 웰에 추가합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 MEM 배양 배지를 96웰 플레이트의 빈 웰에 추가합니다. 96웰 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.

96 웰 플레이트의 웰의 매체를 흡입합니다. 배지를 흡인하는 동안 웰에서 세포를 분리하거나 제거하지 마십시오. 이는 낮은 흡인 속도를 사용하고 흡입 팁을 웰 표면의 하단 모서리에 조심스럽게 배치함으로써 달성할 수 있습니다.

그런 다음 트리코스타틴 A, MS275 및 투바스타틴 A를 포함한 MEM의 두 번 테스트 화합물 25마이크로리터를 테스트 웰에 추가합니다. 다음으로, 25마이크로리터의 기판 혼합물을 대조군 및 테스트 웰에 추가합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 MEM을 블랭크 웰에 추가합니다.

96웰 플레이트를 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 8시간 동안 배양합니다. 세포 용해를 수행하려면 먼저 프로테아제 억제제가 보충된 6배 RIPA 완충액 10마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 각 웰에 160마이크로리터의 차가운 아세토니트릴을 첨가하여 반응을 중지하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.

접시를 섭씨 영하 80도의 냉동고에 10분 동안 넣습니다. 냉동실에서 플레이트를 제거하고 각 웰의 내용물 220마이크로리터를 비멸균 원추형 바닥 96웰 플레이트로 옮깁니다. 5, 000 시간 g 및 10 분 동안 4 섭씨 온도에 판을 원심 분리하십시오.

원심분리 후 200마이크로리터의 상등액을 UHPLC 시스템과 호환되는 96웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 플레이트 실러를 사용하여 벗겨낼 수 있는 열 밀봉 호일로 플레이트를 밀봉합니다. 초고성능 액체 크로마토그래피 질량 분석 시스템을 이동상 시스템으로 채워 준비합니다.

96웰 플레이트를 플레이트 홀더가 포함된 샘플 매니저에 놓습니다. 텍스트에 있는 UHPLC ESI MS/MS 조건에 따라 샘플을 실행합니다. 데이터 분석을 수행하려면 각 기질과 탈아세틸화된 산물의 피크 면적을 적절한 UHPLC 통합 소프트웨어와 통합하십시오.

각 기질에 대해 각 크로마토그램에서 탈아세틸화와 아세틸화의 피크 면적 비율을 계산합니다. 테스트 및 제어 샘플을 포함합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜의 방정식에 따라 각 테스트 샘플의 HDAC 억제 백분율을 계산합니다.

시료의 UHPLC-MS 크로마토그램이 여기에 나와 있습니다. 세포에 추가된 기질에 해당하는 피크는 서면 프로토콜의 표 1에 설명된 대로 질량 전이에 따라 검출됩니다. MOCPAC은 HDAC1에 의해 탈아세틸화되어 탈아세틸화된 MOCPAC 피크를 제공합니다.

마찬가지로, BACP는 HDAC6에 의해 탈아세틸화되어 탈아세틸화된 BATCP 피크를 제공합니다. 마지막으로, MAL은 여러 내인성 HDAC의 탈아세틸화를 비특이적으로 반영하는 탈아세틸화된 MAL 피크를 제공합니다. 여기에 표시된 그림은 HDAC 억제제인 Trichostatin A.의 농도가 다른 상태로 얻은 크로마토그램이 있는 그림입니다.표준 HDAC 억제제의 용량 반응 평가를 수행했습니다.

MOCPAC과 dMOCPAC에서 얻은 통합 값을 사용하여 HDAC1에 대한 표준 억제제의 효능을 계산했습니다. IC 50 계산 결과, 선택적인 Class I HDAC 억제제인 MS275는 알려진 HDAC6 억제제인 Tubastatin A보다 HDAC1에 대한 IC 50 값이 더 낮았습니다. 반면에, BATCP 및 dBATCP의 격리된 값은 HDAC6에 대한 표준의 효능을 계산하는 데 사용되었습니다.

이번에 투바스타틴 A는 MS275보다 낮은 IC 50 값을 제공하여 동형 선택성 프로파일을 확인했습니다. 트리코스타틴 A는 강력한 비선택적 억제제입니다. 이 기법을 완전히 익히면 세포 처리 시간과 96웰 플레이트의 분석을 포함하여 적절하게 수행된다면 72시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 여기에 표시된 배양 시간은 HeLa 세포에 대한 것임을 기억하는 것이 중요합니다. 다른 세포주를 사용하는 경우 이를 최적화해야 합니다. 이 절차에 따라, 특정 기질이 존재하는 한 다른 동형의 선택적 HDAC 억제 활성을 측정할 수 있습니다.

유기 용제 및 기타 화학 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 보호 안경, 장갑 및 실험실 가운을 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.