Name: 단백질 단백질 상호 작용 Autophagy 연구에서의 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
Description: 학습하세요 면역형광법과 면역침전법을 이용한 포유류 자가소식에서 단백질 상호작용 분석 방법을. 이 기술은 세포 신호전달 경로의 새로운 구성요소를 발견하고 단백질 역학을 이해하는 데 필수적입니다.

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이 작품은 과학 및 터키 과학 기술 연구 위원회 (TUBITAK) 1001 그랜트 107T153, Sabanci 대학교에 의해 지원 되었다. 세 브와 NMK 박사 연구 TUBITAK BIDEB 2211 장학금에 의해 지원 됩니다.

1. 면역 형광 DMEM 높은 포도 당 매체, <ol><li>유지 HEK293T 인간 미 발달 신장 세포 및 N2A 마우스 neuroblast 셀 DMEM 낮은 포도 당 중간, 5% CO 2-37 ° c.에 습도 인큐베이터 10% 태아 소 열 비활성화 (FBS) 혈 청, 문화 미디어 보충 (50 U/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스), 항생제 및 L-글루타민 (2mm).</li>
	<li>는 0.25 %trypsin 사용 하 여 셀을 분리 합니다. 먼저 세포 배양의 미디어 제거 다음 셀 10 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 되는 염 (PBS)을 세척 하 고, 트립 신 2 mL DMEM 매체를 추가 하 여 5 분 비활성화 트립 신에 대 한 37 ° C에서의 1 mL와 함께 품 어.</li>
	<li>Pipetting에 의해 잘 접시를 세척. 셀 솔루션의 10 µ L을 제거 하 고 10 µ L trypan 파랑의 혼합. hemocytometer를 사용 하 여 라이브 셀의 수를 계산 하.</li>
	그러나 <li>모두 HEK293T와 N2A 부착 세포,, HEK293T 셀 쉽게 접시에서 분리. 따라서, 작동 HEK293T 셀 라인, 코트와 살 균 coverslides 필터링 0.01% 폴 리-L-리 신 셀을 뿌리기 전에.
	<li>10 cm 배양 접시에에서 장소 살 균 coverslides <ol>. 각 coverslide에 폴 리-L-리 신 솔루션의 적절 한 금액을 추가 합니다. 10 분에 대 한 폴 리-L-리 신 솔루션 coverslides를 품 어</li>
		<li>폴 리-L-리 신 솔루션 제거. 
		참고: 폴 리-L-리 신은 재사용 가능한; 그것은 수집 하 여 추가 실험을 위해 재사용 옵션입니다. 폴 리-L-리 신 독성 때문에, 모두는 coverslides에 솔루션의 완전히 증발 될 때까지 기다립니다 그리고 폴 리-L-리 신 다음 복구.</li>
		<li>세척 살 균 PBS 가진 coverslides.</li>
	</ol></li> <li>1 mL DMEM 12-잘 접시의 각 음에 추가. 각 잘에서 한 coverslide 장소.</li>
	<li>씨앗 20000 셀/글쎄, 드롭 들러는 coverslides 셀의 균일 분포에 대 한 동시에 접시를 떨고 있는 동안. 셀에에서 계속 CO 2 인큐베이터 37 ° C에서 고 약을 추가 총 보육 시간 48 h를 초과 하지 않는, 즉, 3 h Torin 치료에 대 한 추가 약 45 h 게시물 시드에.
	<ol>RACK1-LC3 <li>상호 작용 연구, Torin 1, rapamycin, 그리고 기아 autophagy inducers로 사용 되었다. 셀은 알을 품 Torin 1 3 h (250 nM 최종 농도 겠어요); rapamycin 16 h (200 nM 최종 농도 겠어요);에 대 한와 함께 그리고 얼 &#39; s 균형 소금 솔루션 (EBSS) 세포를 굶 어 하려면 2 h. 
		참고: 10 %FBS 제어 조건으로 사용 된 DMEM 부 화.</li>
	</ol></li> <li>총 보육 시간의 48 h 후에 coverslides 미디어를 제거 하 고 1 mL PBS와 함께 그들을 씻어.</li>
	<li>셀을 해결 하기 위해 품 어 1 mL 얼음 차가운 살 균 필터링 된 4 %paraformaldehyde (PFA) 어떤 동요 없이 실 온에서 20 분의 1 x PBS (pH 7.4)에 있는 셀. 
	PFA 빛에 민감한 때문에, 계속 (중요 한) 접시 어둠 속에서 부 화 기간; 알루미늄 호 일 접시를 덮고 도울 수 있습니다. 또한, PFA 독성, 따라서, 증기 두건에서 셀을 수정 하는 동안 작업. 
	참고: 고정 단계 면역 형광 실험에서 유의 최적화 해야 합니다, 특정 항 체는 최고의 조건과 다른 고정 에이전트를 사용 하 여 작업 수 있습니다.</li>
	<li>PFA 부 화 후 20 분 먼저는 coverslides에 PFA 솔루션을 제거 하 고 각 샘플 3 번 1 mL 균 필터링 된 PBS로 세척. At이이 단계, (중요 한) 세척을 말리 우물 하나. 이후 후속 반응 셀의 방해 하 고 세포 형태를 변경, 일반적인 신호를 증가 것입니다 그것을 건조 하지 마십시오.</li>
	<li>세척이 완료 되 면 계속 1 ml PBS 얼음에 샘플</li>
	<li>차단 솔루션 준비: 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 0.1% 사포닌과 PBS.</li>
	<li>는 파라핀 영화 6 잘 플레이트 커버. 플레이트 하단 파라핀 영화 취재 후 부드러운 인지 확인 합니다. 6 잘 플레이트 라벨.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여, 전송은 coverslides 12-잘 접시 6 잘 플레이트에 파라핀 필름으로 커버.</li>
	<li>는 Coverslides에 PBS를 삭제 하 고 차단 하는 permeabilization에 대 한 각 coverslide에 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 30 분에 대 한 얼음에 샘플을 품 어</li>
	<li>는 솔루션을 차단에 1 차적인 항 체를 준비 합니다. 실험을 하기 전에 얼룩에 대 한 최상의 작업 농도 정의 하기 위해 항 체 희석 최적화. 
	참고: 예를 들어 LC3 항 체 솔루션을 차단에 1: 100 희석에 사용 됩니다.</li>
	<li>30 분 부 화 후 차단 솔루션을 삭제 하 고 부드럽게 1 mL의 PBS로 샘플을 한 번 씻어.</li>
	<li>추가 100 µ L 각 coverslide에 대 한 1 차적인 항 체 해결책의. 대 한 통에 1 시간 실 온에서 샘플을 품 어. 
	참고: 1 차적인 항 체 외피 시간 최적화 되어야 합니다. 항 체에 따라 4 ° C에서 하룻밤 인큐베이션 바람직 있을 수 있습니다. 통에 품 어 부드럽게 하는 것이 좋습니다 (100 회전/분)는 coverslides에 항 체를 똑같이 배포.</li>
	<li>1 차적인 항 체를 가진 외피 후 샘플 개별적으로, 3 회로 씻어 1 mL PBS.</li>
	<li>준비 1: 500 이차 항 체 (이차 항 체의 희석의 최적화 필요할 수 있습니다) 솔루션을 차단에. 여기, 안티-토끼 IgG 알 렉 사 Fluor 568 보조 안티 토끼 항 체로 사용 되었다.
	<ol><li>샘플 통에 실 온에서 1 h를 위한 이차 항 체 해결책의 100 µ L 품 어. 이후 fluorophore 표시 된 이차 항 체는 빛에 민감한, (중요 한) 어둠 속에서 솔루션을 계속. 이차 항 체 외피 전후 동안 어둠 속에서 샘플을 배치.</li>
	</ol></li> <li>이차 항 체 부 화 후 3 회 PBS 가진 접시 세척. 
	참고: 사용 경험에 따라, 일부 항 체는 PBS에 의해 제거 될 수 없는 높은 배경 신호 세척. 같은 항 체, 단계 1.21, 후 처리 하는 경우 6 h 4 ° C에서 PBS에 샘플을 유지 도울 수 있습니다.
	<ol><li>필요한 경우 얼룩 Hoechst, 핵 표시 같은 DNA 바인딩 염료와 셀.</li>
	</ol></li> <li>더 이상의 단백질 얼룩, 적용 단계 1.16 두 번째 단백질에서에서 시작 하는 동일한 절차.
	<ol>확인 <li>하나 이상의 항 체 (예, 사용 마우스와 토끼 항 체)로 얼룩을 수행할 때 항 체 사이 아무 종 반응이 다는 것. 
		참고: 여기에서, RACK1은 스테인드 두 번째 단백질으로 안티-RACK1 주 항 체와 반대로 마우스 IgG 알 렉 사 Fluor 488 이차 항 체 위에서 언급 한 같은 농도 사용 하 여 사용 하 여.</li>
	</ol></li> <li>장착 솔루션 준비: 50% 글리세롤 1 x PBS에. 22 µ m 필터를 통해 필터.</li>
	<li>에탄올 보풀 지우기를 사용 하 여 슬라이드를 닦 고 10 µ L 장착 솔루션 각 슬라이드에 추가. 트위터를 사용 하 여 셀으로 측면 장착 매체와 직접 접촉에 있는 각 dropso에는 coverslides를 놓습니다. 부드럽게 보풀 물티슈를 사용 하 여 초과 장착 솔루션 삭제.</li>
	<li>인감 투명 매니큐어와 coverslides. 먼저,는 coverslides 4 가장자리에 매니큐어의 방울을 추가 하 여 안정과 다음 완전히 그들을 봉인.</li>
	<li>형광 신호 수 있습니다 몇 시간 후 표 백제 이후 가능한 한 빨리 형광 또는 confocal 현미경 샘플을 분석.</li>
</ol> 2. Immunoprecipitation <ol><li>분리 및 수로 셀 1.2와 1.3 단계에서 설명한.</li>
	<li>는 HEK293T 셀을 사용 하는 경우 15 cm 배양 접시에서 각 조건에 대 한 4 백만 셀 씨. N2A 세포를 사용 하는 경우 15 cm 배양 접시에 5 백만 셀 씨. 37 ° C에서 CO 2 배양 기에서 세포 실험의 끝까지 품 어.</li>
	<li>치료 관련 약물 또는 정의 된 기간에 대 한 조건 셀을 셀의 총 보육 시간 48 h.를 초과 하지 않는 
	참고:이 연구에서 immunoprecipitation 테스트에 대 한 세포 치료 Torin 1 3 h (250 nM), rapamycin 16 h (200 nM), 및 EBSS 가진 2 h. 10 %FBS 컨트롤로 셀에 추가 된 DMEM.</li>
	<li>후 48 h 총 보육 시간, 미디어를 제거 하 고 세포를 수확. HEK293T 셀 접시에서 쉽게 분리, 이후 얼음 접시 세척 차가운 PBS 수 있습니다 수확에 적합. 그러나, N2A 셀은 더 강한 분리; 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 수확 하는 데 도움이.
	<ol><li>Microcentrifuge 튜브에 있는 모든 셀을 수집.</li>
	</ol></li> <li>4 ° C. 삭제는 상쾌한 세척 다시 pipetting으로 일시 중단 하 여 1 mL PBS 가진 펠 릿에서 15 분 동안 16000 x g에서 원심 분리기 샘플.</li>
	<li>원심 분리기 단계를 반복 하지만 15 분에 4 ° C에서 높은 원심 분리기 속도에 상쾌한 삭제.</li>
	<li>실험을 시작 하기 전에 준비 라디오 면역-강 수 분석 결과 (RIPA) 버퍼. 
	참고: RIPA 버퍼;의 3 종류가 있습니다. (아래 수식 참조) 하는 것을 조사 되 고 단백질의 상호 작용 강도 따라 선택 합니다.
	<ol><li>강한 단백질-단백질 상호 작용은, 정규 RIPA 버퍼를 선택 하십시오.</li>
		<li>상호 작용은 약한 경우 가벼운 RIPA 또는 온화한 RIPA 선택. 
		참고: 이러한 버퍼 조리법 다음 단계에 있습니다. Immunoprecipitation 테스트에 사용 되는 모든 버퍼 protease 억제제와 함께 보충 해야 합니다.
		<ol><li>50 mM Tris pH 8에에서 1 %NP-40, 150 mM NaCl, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 및 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염을 사용 하 여 일반 RIPA 버퍼 준비.</li>
			<li>50 mM Tris pH 7.5에에서 1 %NP-40, 150 mM NaCl, 및 0.25% 나트륨 deoxycholate를 사용 하 여 가벼운 RIPA 버퍼 준비.</li>
			<li>50 mM Tris pH 7.4에에서 1% 트리톤 X 100, 137 mM NaCl, 1% 글리세롤과 1mm 나트륨 orthovanadate를 사용 하 여 온화한 RIPA 버퍼 준비.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>적절 한 RIPA 버퍼를 선택한 후 보충 protease 억제제 (RIPA +)와 버퍼. 다음, RIPA + 셀 펠 릿의 볼륨 x 3 세포를 lyse.</li>
	<li>소용돌이 15에 대 한 서 스 펜 션 5 분 소용돌이 장식 5 번 반복 하 고 다음 15 분 동안 16000 x g에서 샘플 4 원심 s. 얼음에 그것을 계속 ° c.</li>
	<li>깨끗 한 microcentrifuge 튜브와 나머지 세포 파편을 제거 하는 원심 분리기에는 상쾌한 전송. 깨끗 한 튜브에 상쾌한 전송.</li>
	<li>단백질 lysates 1시 50분을 희석 하 고 빈와 표준 96 잘 접시를 준비 합니다. 샘플 희석.
	20: <ol><li>브래드와 혼합 샘플 솔루션 1. 어둠 속에서 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>595 nm 파장에서 광학 밀도 측정합니다. 각 샘플에 대 한 흡 광도 값을 사용 하 여 단백질 농도 계산.</li>
	</ol></li> <li>셀, 수확 전에 하루는 관심사의 단백질에 항 체와 단백질 A 플러스 구슬 커플.
	<ol><li>커트가 위를 사용 하 여 200 µ L 팁의 가장자리 및 비드 슬러리에서 25 µ L를 사용 하 여 각 조건에 대 한.</li>
		<li>1 mL PBS와 함께 한 번, 한 번 1 mL RIPA 버퍼와 함께 한 번 1 mL RIPA + 구슬 세척. 3300 x g, 1 분에 4 ° C에 세척 단계 수행</li>
		<li>마지막 세척 후 구슬에 RIPA + 300 µ L을 추가 하 고 1.5 µ g 항 체에 내려 오게 될 단백질에 관련 된 추가.</li>
		<li>품 어 회전 (20 회전/분)에 4 ° C에서 하룻밤 튜브. 
		참고: 여기에서, ATG5는 특정 안티-ATG5 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitated.</li>
	</ol></li> <li>항 체와 구슬의 하룻밤 배양 후 씻어 PBS와 한 번, 한 번 RIPA와 함께 한 번 RIPA + 구슬 2.12.2 단계에서 설명한 대로.</li>
	<li>추가 2 mg 단백질 각 구슬에 lysate의 조건 하 고 총 볼륨 RIPA + 버퍼/튜브와 300 µ L. 4에는 회전자에 하룻밤 튜브를 품 어 ° c.</li>
	<li>는 부 화 후 앞에서 설명한 구슬 (단계 2.12.2) 세척.
	<ol><li>마지막 세척 후 사용 하 여 작은 피펫으로 팁 구슬 건드리지 않고 모든 상쾌한 제거.</li>
		<li>염료 로드 x 3의 추가 10 µ L: 6 %SDS, 30% 글리세롤, 16% β-Mercaptoethanol, 및 1 M Tris HCl pH 6.8에서에서 0.1 %Bromophenol 블루.</li>
	</ol></li> <li>각 조건에 대해 적어도 100 µ g 단백질 lysate를 사용 하 여 입력된 컨트롤을 준비. 물을 사용 하 여 샘플 볼륨을 균일화 하 고 염료를 로드 x 3의 적절 한 볼륨 추가.</li>
	<li>10 분 동안 95 ° C에서 종 샘플 
	참고: 일반적으로 샘플을 끓는 때 튜브의 캡 수 저절로 열고 샘플 손실 됩니다. 특정 모자 차단제와 모자를 눌러이 문제를 방지.</li>
	<li>스핀 샘플 및 표준 프로토콜을 사용 하 여 그들의 크기에 따라 단백질을 SDS 페이지 젤에 부하. 
	참고:이 연구에서 RACK1 및 ATG5에, 샘플 12 %polyacrylamide 젤 80 V 30 분 그리고 약 90 분 동안 120 V에서 통해 실행 했다. 그러나, LC3 같은 작은 단백질에 대 한 15 %polyacrylamide 젤을 사용 하 여 더 적당 하다.</li>
	<li>젤 실행 완료 한 후 니트로 또는 PVDF 막 중 습식 또는 세미 드라이 전송 방법을 사용 하 여 단백질을 전송 합니다. 그런 다음 0.05%와 PBS에서 5% 비-지방 우유에 외피에 의해 세포 막 차단 트윈 20 (PBST) 1 h. 세척 세포 막에 대 한 실 온에서 3 시간 5 분에 대 한 PBST와</li>
	<li>실 온에서 1 h에 대 한 작동 농도에서 1 차 항 체를 막 품 어. 1 차적인 항 체 희석에 대 한 사용 빨간 솔루션을 포함 하는 BSA (5% BSA Cohn V 분수, PBST, pH 7.5;에 0.02% 나트륨 아 지 드 페 놀 레드 산도 표식으로 추가 추가) 항 체의 재사용을 허용 하도록. 
	참고: 예를 들어 빨간색 솔루션에서 ATG5 항 체 2000 x 희석.
	<ol><li>보육 시간의 끝에, PBST와 3 번 막 세척.</li>
	</ol></li> <li>HRP 활용 된 이차 항 체 5% 비-지방 우유 솔루션에서 준비 했다와 막 품 어 (여기, 안티-토끼 IgG 1:10.000에서 사용 되었다). 다음 씻어 막 3 5 분에 대 한 PBST x</li>
	<li>만들 ECL 솔루션: 25mm luminol, 9 mM coumaric 산, 70 mM Tris HCl pH 8.8에에서 3 x 10 -4% H 2 O 2. 각 실험에 대 한 신선한 H 2 O 2를 사용 하 여. 
	참고: 반응 시작 후 H 2 O 2 추가 하 고 그것은 약 20 분 동안 계속.
	<ol><li>멤브레인을 품 어 고 ECL에 20 분에 대 한 영화를 x-선. 개발 하 고 어두운 방에 수정.</li>
	</ol></li> <li>닫기 또는 중복 분자 무게 단백질의 co immunoprecipitation를 확인, 그것은 막 벗기는 버퍼에서 30 분 동안 60 ° C에서 배양 하 여 세포 막에서 항 체를 제거 해야 할 수 있습니다: (25mm Tris HCl pH 2와 1 %SDS).</li>
	<li>반복 단계 2.20 2.23 공동-immunoprecipitation 다른 항 체를 사용 하 여 확인. 예를 들어 다음 ATG5 검출과 세포 막의 스트립, RACK1 단백질 안티-RACK1 1 차 항 체 (1:1, 000) 및 2 차 항 체 (1:10, 000)을 사용 하 여 동일한 막에 시험 되었다. Β-말라 로드 제어;로 사용 IgG 신호 immunoprecipitated 샘플 로드 제어로 사용 되었다.</li>
</ol>

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</ol>

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Immunoprecipitation 및 면역 형광 기법 단백질 단백질 상호 작용의 연구에 대 한 중요 한 있습니다. 이러한 두 가지 기술을 일반적으로 사용 되 고 잘 설립, 비록 몇 가지 기준은 이러한 기법을 사용 하는 동안 실험의 품질을 정의 하 고려 되어야 한다.
이 테스트에서 사용 되는 첫 번째, 1 차 항 체는 관심사의 단백질에 특정 해야 합니다. 을 보장 하기 위해이 테스트에 항 체의 특이성을 shRNA knockdowns 또는 녹아웃 셀을 사용 합니다. 또한, 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 또는 관심사의 단백질의 알려진된 유도 된 세포 치료. 항 체의 일괄 처리를 일괄 처리도 존재 합니다. 또한, 일부 polyclonal 항 체 또는 세라 높은 배경 및 일반적인 밴드 할 수도 있습니다. 이러한 밴드 중 일부는 관심사의 단백질의 다른 형태의 수 있습니다, 하지만 그들은 polyclonal 항 체 관련 된 단백질의 분에서 발생 하는 일반적 또는 그들은 일반적인 인터 있을 ...

Macroautophagy (autophagy, 여기) 대량 세포질, 단백질과 autophagic vesicles 라는 이중 막 소포에서 세포의 격리에 의해 특징입니다 세포 스트레스 메커니즘입니다. 이중 막의 외부 층의 융합을 통해 autophagic 소포 및 그들의 화물 리소좀에 배달 되 고 거기에1저하. Autophagy 모든 세포 유형 및 단백질 저하 등 (예, 미토 콘 드리 아) 세포 기관이 회전율 homeostatic 기능을 수행 하는 모든 유기 체에 낮은 기저 수준에서 발생 합니다. 기아, 같은 세포질 긴장에 지도 하는 조건 하에서 autophagy 빠르게 upregulated 이며 기본 대사1,2,3에너지 레벨을 유지 하기 위해 셀 수 있습니다.
누 룩에서 복제 되어 약 30 autophagy 유전자와 단백질 제품 autophagic 과정, 소포 nucleation, 확장, 늦은 endosome/리소좀, 및 화물 저하 기 퓨전 등의 다양 한 단계에서 역할을 표시 했다 4 , 5.이 유전자의 대다수의 Orthologs 확인 되었습니다 및 그들의 세포질 기능6의 보존을 확인 하는 다양 한 유기 체에 연구. 지난 10 년간에서 연구 보여주었다 여러 autophagy 관련 단백질 복합물 및 단백질-단백질 상호 작용 및 그들은 복잡 하 고 제어 방식 autophagy 통로 지배. 교차로, 백업, 피드백, 피드 포워드 메커니즘 존재, 그리고 다른 관련된 이벤트 (예: 기공을 분 비, 리소좀 속, endosomal 정렬 및 전송7, 등)와 autophagy 조정 셀 수 미끼로 autophagy 단백질 ATG5를 사용 하 여 편견된 효 모 2 잡종 스크린에서 (ATG5는 기아에서 LC3 lipidation 중재 e 2와 같은 conjugating 시스템에 관련 된 주요 autophagy 단백질 유도 autophagy), 수용 체 활성화 확인 했습니다 C-키 1 (RACK1; GNB2L1) 강한 interactor 및 소설 autophagy 구성 요소8. 중요 한 것은, 화면이 보였다 ATG5 RACK1 상호 작용 autophagy 클래식 inducers (즉, 기아와 mTOR 억제)에 의해 autophagy 유도 불가결 이었다.
면역 형광 검사 기반 방법 일반적으로 단백질 단백질 상호 작용을 모니터링 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 주로 항 체 기반 하 고 상호 작용을 시각화 하 고 세포질 지 방화를 확인 하는 데 도움이. 이 기술에서는, 형광 태그 활용 된 항 체 관련 된 관심사의 단백질은 일반적으로 특정 얼룩에 사용 됩니다. 각 단백질 다른 형광 성 염료를 결합 하는 항 체와 함께 표시 될 수 있습니다. 단백질-특정 항 체를 사용 하 여 이미지 병합 되 면 신호에 겹치는 confocal 현미경 검사 법에서 단백질의 공동 지역화를 나타냅니다. 기술은 셀 이나 심지어 조직에 적용 됩니다. 면역 형광 검사 기술을 상호 역학에 대 한 단서를 제공 하 고 크기와 다른 조건9에서 세포 형태학에 있는 일반적인 변화를 추적 하는 동안 단백질 복합물의 분포를 식별 하는 데 도움이. Immunoprecipitation는 다른 일반적으로 사용 되 항 체 기반 기술 상호 작용의 분석에 대 한 수 사이 주어진 단백질10. 이 기술을 사용 하 여, 관심사의 단백질 격리 된 셀에서 또는 조직 추출 단백질 복잡 한 또는 관심사의 단백질 접촉의 강 수의 결과로 특정 항 체를 사용 하 여. 공동-immunoprecipitation, 단백질 및 그것의 공동 interactor는 검색 뿐만 아니라 두 개의 단백질 사이 상호 작용을 보여 하지만 다른 상황11에서 상호 작용의 그것의 힘을 측정할 수 있습니다.
이 프로토콜은 확인 하 고 특성을 ATG5-RACK1 및 RACK1 LC3 상호 작용 하는 데 사용 된 세부 핵심 기술에 설명 합니다. 초점은 중요 한 단계 및 함정 autophagy 연구로 해결의 강조와 함께 면역 형광 및 immunoprecipitation 기술에 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Trypsin EDTA 솔루션 A</td><td>생물학 산업&nbsp;</td><td>BI03-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GE 헬스케어</td><td>SH-30256.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (고포도당)</td><td>시그마&nbsp;</td><td>5671</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (저혈당)</td><td>Sigma</td><td>5546</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>커버슬라이드</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSL-103</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드</td><td>Isolab</td><td>I.075.02.005</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Torin</td><td>Tocris</td><td>4247</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>VWRSAD2650</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>생물학 산업&nbsp;</td><td>BI02-010-1A</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)</td><td>시그마</td><td>15812-7</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>&nbsp; A4503</td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>시그마</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>LC3 항체</td><td>시그마</td><td>L7543</td><td></td></tr><tr><td>안티-래빗 IgG 알렉사 플루어 568</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>RACK1 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>&nbsp; sc-17754</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 IgG Alexa Fluor 488</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Applichem</td><td>A16694.0250</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Applichem</td><td>A9242.5000</td><td></td></tr><tr><td>소듐 데옥시콜레이트</td><td>시그마</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트 (SDS)</td><td>Biochemika</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 베이스</td><td>시그마</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>트리톤-X&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>4975</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>ATG5 항체</td><td>Sigma</td><td>A0856</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Applichem</td><td>A4453</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1108.0250</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3640.0005</td><td></td></tr><tr><td>비지방 우유</td><td>Applichem</td><td>A0830</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Riedel de Haen</td><td>13412</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>114537-5G</td><td></td></tr><tr><td>항토끼 IgG, HRP 결합</td><td>Jackson Immuno.&nbsp;</td><td></td><td></td>1110305144</tr><tr><td>Luminol</td><td>Fluka</td><td>9253</td><td></td></tr><tr><td>Coumeric Acid</td><td>Sigma</td><td>C9008</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>Merck</td><td>K35522500604</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 IgG, HRP 활용</td><td>Jackson Immuno.</td><td>115035003</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actin 항체</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>일반 토끼 혈청</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>라파 마이신</td><td>시그마</td><td>&nbsp; R0395</td><td></td></tr><tr><td>단백질 A-아가로스 비즈</td><td>산타크루즈 바이오테크</td>놀<td>러지 sc-2001</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 솔루션</td><td>생물학 산업&nbsp;</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>생물학 산업&nbsp;</td><td>BI03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>브래드포드 솔루션</td><td>시그마</td><td>6916</td><td></td></tr><tr><td>니토셀룰로오스 멤브레인</td><td>GE 헬스케어</td><td>A10083108</td><td></td></tr><tr><td>X선 필름</td><td>후지필름</td><td>47410 19289</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>시그마</td><td>P8340</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 단백질 상호 작용 autophagy 연구에서의 연구

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

단백질 단백질 상호 작용 이해 셀룰러 신호 폭포 및 식별 소설 통로 구성 요소 단백질 역학 중요 하다. 세포 활동의 대부분 필요 단백질 사이 육체적 인 상호 작용. 분석 하 고 이러한 상호 작용 지도, 다양 한 실험적인 기술 뿐만 아니라 생물 정보학 도구 개발 되었다. Autophagy는 영양 부족, 화학 물질 및 산소를 포함 하 여 다른 스트레스에 대처 하기 위해 셀 수 있도록 메커니즘을 재활용 휴대. Autophagy 관련 신호 이벤트를 더 잘 이해 하 고 단백질 복합물에서 autophagy 조절 하는 새로운 요소를 발견, 우리는 단백질 단백질 상호 작용 화면을 수행. 이러한 심사 결과의 유효성 검사에는 면역 형광 및 immunoprecipitation 기술을 사용을 해야합니다. 이 시스템에서 우리가 발견 특정 autophagy 관련 된 단백질-단백질 상호 작용은 Neuro2A에서 테스트 되었습니다 (N2A) 및 HEK293T 세포 라인. 이 시각된 실험 종이에 사용 되는 기술 절차의 세부 사항 설명 합니다.

그림 1 공동 지역화의 예제에서에서이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과 표시 됩니다. 우리의 최근 종이에서 그림8을표시 됩니다. 여기, 내 생 RACK1 단백질은 녹색, 스테인드 생 LC3 빨간색으로 얼룩진 했다 하는 동안. 병합 된 사진에서 관찰 되는 노란색 점 녹색과 적색 신호 사이 오버랩의 사이트를 나타냅니다. 따라서 노란색 점 들이 두 가지 단백질의 부분 공동 지역화를 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55881/55881fig1.jpg"> 
그림 1 : 대표적인 면역 형광 검사 결과. HEK293T 셀 coverslides에 교양 있었다. 세포 치...

여기는 두 항 체 기반 단백질-단백질 상호 작용 연구 기법 제시: 면역 형광 및 immunoprecipitation. 이 기술은 물리적 상호작용 단백질 세포질 신호 통로의 소설 구성 요소의 발견 및 이해 단백질 역학 공부 위해 적당 하다.

단백질 단백질 상호 작용 Autophagy 연구에서의 연구

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

제 이름은 Devrim Gozuacik입니다. 저희는 터키 이스탄불의 Sabanci University에서 포유류의 오토파지 조절에 관한 연구를 수행하고 있습니다. 저희는 오토파지를 조절하는 다양한 단백질, 경로 및 RNA에 집중하고 있습니다.자가포식(autophagy)을 연구하기 위한 여러 가지 기술이 있습니다. 본 연구에서는 우리가 발견하고 있는 다양한 경로를 분석하기 위해 분자생물학, 생화학 및 세포생물학적 기법을 사용하고 있습니다. 또한 자가포식 경로를 분석하기 위해 면역침전법, 면역형광 기법, 공초점 현미경법 및 기타 다양한 기술을 활용하고 있습니다.다양한 기술의 세부 사항과 주의점 및 문제 해결 방법은 저의 박사 과정 학생인 Secil Erbil이 설명할 것입니다. 면역형광법 및 면역침전법 절차의 전반적인 목표는 세포 내 내인성 단백질-단백질 상호작용을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 단백질-단백질 상호작용 및 그 세포 내 위치에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이러한 기술의 주요 장점은 대조군과 비교하여 원하는 처리 및 조건 동안의 상호작용 강도를 정량화할 수 있다는 것입니다. 먼저, 트립신을 사용하여 세포를 떼어내십시오. 그런 다음 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하고, 세포 농도를 계산하십시오.포장되어 멸균 처리된 커버슬라이드를 가져와 10cm 페트리 접시에 넣습니다. 본 실험에서 사용한 HEK293T와 같이 세포 부착력이 약한 세포주를 사용하는 경우, 멸균 여과된 0.01% poly-L-lysine 용액으로 커버슬라이드를 코팅합니다. 10분간 배양한 후 용액을 제거합니다.poly-L-lysine이 모두 증발하고 커버 글라스가 완전히 마를 때까지 기다립니다. 그 후 멸균된 PBS로 세척합니다. 12-well 플레이트에 배지 1 mL를 넣고, 각 well에 커버 글라스를 배치합니다.웰당 20,000개의 세포를 분주합니다. 커버 슬라이드 위에 세포가 균일하게 분포되도록 접종 중과 접종 후에 플레이트를 흔들어 주는 것이 중요합니다. 세포의 총 배양 시간이 48시간을 초과하지 않도록 하여, 원하는 약물과 대조군으로 세포를 처리합니다.48시간이 지나면 커버 슬라이드 위의 배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그다음 흄 후드 내에서 PBS를 제거하고, 4% PFA를 처리하여 상온에서 20분 동안 배양함으로써 세포를 고정합니다. PFA는 빛에 민감하므로 배양 시간 동안 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어줍니다.그다음 PFA를 제거하고, 샘플을 PBS로 3회 세척합니다. 이 단계에서는 샘플이 마르지 않도록 하나씩 세척하는 것이 중요합니다. 그런 다음 처리 조건에 따라 6-웰 플레이트에 라벨을 붙이고, 각 웰을 파라필름(Parafilm)으로 덮습니다.이 단계에서는 Parafilm으로 덮은 후 바닥면이 매끄러운지 확인하십시오. 그런 다음 커버 슬라이드를 6-웰 플레이트에 놓고, 각 커버 슬라이드 위에 BSA-saponin 혼합물 100 µL를 분주한 후, 블로킹을 위해 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 이후 블로킹 용액을 제거하고, 샘플을 PBS로 한 번 세척합니다.BSA-사포닌 혼합액에서 1차 항체를 1:100으로 희석하여 준비하고, 각 커버 슬라이드에 이 용액을 100 µL씩 넣습니다. 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 중에 플레이트를 흔들어 주면 커버 슬라이드에 항체가 균일하게 분포됩니다.그 후 1차 항체를 제거하고, PBS로 샘플을 3회 세척합니다. BSA-사포닌 혼합액에서 Alexa Fluor 2차 항체를 1:500으로 희석하여 준비하고, 각 커버 슬라이드에 이 용액을 100 µL씩 처리합니다. Alexa Fluor는 빛에 민감하므로, 이 단계 이후에는 샘플을 암소에 보관하는 것이 중요합니다.따라서 6-웰 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 셰이커 위에서 실온으로 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 2차 항체를 제거하고, PBS로 샘플을 3회 세척합니다. 슬라이드에 처리군 이름을 표시하고, Kimwipes를 사용하여 에탄올로 닦아냅니다.그다음 각 슬라이드 중앙에 mounting solution 10 µL를 넣습니다. 핀셋을 사용하여 각 슬라이드 위에 커버 슬라이드를 덮습니다. 그런 다음 Kimwipe를 사용하여 과량의 mounting solution을 조심스럽게 닦아냅니다.먼저, 네일 폴리시 네 방울로 각 커버 슬라이드를 고정합니다. 그다지 커버 슬라이드를 완전히 밀봉합니다. 공초점 현미경을 사용하여 시료를 분석합니다.여기 최근 논문에서 발췌하여 이 프로토콜을 사용해 얻은 공국소화(colocalization) 결과의 예시가 있습니다. 이 비디오에서 내인성 RACK1 단백질은 녹색으로, 내인성 LC3는 적색으로 염색되었습니다. Merge 사진에서 나타나는 노란색 점들은 녹색과 적색 신호가 겹치는 지점입니다.즉, 노란색 점은 이 두 단백질의 공국소화를 나타냅니다. 면역침강법은 단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위해 흔히 사용되는 또 다른 방법입니다. 우선, 각 조건별로 15cm 페트리 접시에 400만 개의 HEK293T 세포를 파종합니다.세포의 총 배양 시간이 48시간을 초과하지 않도록 원하는 약물로 처리합니다. 48시간 배양 후, 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 세포를 회수합니다. HEK293T 세포는 플레이트에서 쉽게 떨어집니다.따라서, 피펫팅을 통해 PBS로 플레이트를 세척하는 것만으로도 모든 세포를 분리하여 수확하기에 충분합니다. 세포를 Eppendorf Tube에 수집하고, 4°C에서 최대 속도로 15분 동안 원심분리하십시오. 그 후 상층액을 제거하고, 피펫팅으로 재부유시켜 1mL의 PBS로 세포 펠릿을 세척하십시오.그 다음 다시 원심분리하고, 상층액을 제거합니다. 그런 다음 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 버퍼에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 현탁액을 15초 동안 볼텍싱하고, Eppendorf Tube를 얼음 위에 5분 동안 둡니다.5분 간격으로 볼텍싱을 5회 반복합니다. 그 다음 샘플을 4°C에서 최고 속도로 15분 동안 원심분리합니다. 이어서 상층액을 취해 다시 한번 원심분리하여 세포 파편을 완전히 제거합니다.단백질 용해물을 1:50으로 희석하고, 공시료(blank), 표준물질 및 희석된 샘플을 포함하는 96-well 플레이트를 준비합니다. 이를 Bradford 용액과 1:20 비율로 혼합하여 암소에서 15분 동안 방치한 후, 595 nm에서 흡광도를 측정하고 각 샘플의 흡광도 값을 이용하여 단백질 농도를 계산합니다. 그다음 항체 결합을 위한 비드를 준비합니다.가위로 200-microliter 팁의 끝부분을 자르고, 각 조건당 비드 슬러리 25 microliters를 취합니다. 비드를 PBS로 한 번, RIPA buffer로 한 번, 그리고 protease inhibitors가 포함된 RIPA buffer로 한 번 세척합니다. 마지막 세척 후, protease inhibitors가 포함된 RIPA buffer 300 microliters에 비드를 재부유시키고, 침강시키고자 하는 단백질에 특이적인 항체 1.5 microgram을 첨가합니다.항체와 비드 혼합물을 4°C의 로테이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 버퍼로 비드를 세척하고, 각 조건의 총 세포 용해물 2 mg을 로딩합니다. 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 버퍼를 사용하여 총 부피를 300 µL까지 채운 후, 4°C의 로테이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.그 다음 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 버퍼로 비드를 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 더 작은 피펫을 사용하여 비드에 닿지 않도록 상층액을 모두 제거합니다. 그런 다음 3X 로딩 다이 10 µL를 첨가합니다.공동면역침전(co-immunoprecipitation) 실험에서 확인할 단백질의 내인성 발현을 제어하기 위해, 최소 100 µg의 단백질 용해물을 사용하여 입력(input) 샘플을 준비합니다. 각 샘플에 적절한 부피의 3X 로딩 다이를 추가합니다. IP 및 입력 대조군 샘플을 변성시키기 위해 95 °C에서 10분 동안 가열합니다.그 후 원심분리하여 상층액을 분리하고, western blot을 통해 단백질을 크기별로 분리하기 위해 샘플을 SDS 젤에 로딩합니다. 단백질 샘플을 SDS 젤에서 전기영동한 후, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 전이시킵니다. wet transfer가 완료되면, 쉐이커 위에서 실온의 5% nonfat milk 용액과 함께 1시간 동안 배양하여 니트로셀룰로오스 막을 블로킹합니다.그런 다음 멤브레인을 상온의 쉐이커에서 5분 동안 PBS-Torin 용액으로 3회 세척합니다. 검출하고자 하는 단백질에 특이적인 1차 항체에 멤브레인을 넣고 상온에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 1차 항체의 품질 저하 없이 재사용하려면 붉은색 용액으로 항체를 준비하는 것이 좋습니다.1차 항체 반응 후, PBS-Torin 세척 단계를 3회 반복합니다. 그런 다음 5% 무지방 우유(nonfat milk)에 HRP-접합 2차 항체 용액을 조제하고, 셰이커를 사용하여 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 반응시킵니다. 반응이 끝나면 세척 단계를 다시 반복합니다.그 다음 직접 제조한 ECL 용액을 준비하고, 막을 카세트에 넣습니다. 이후 전체 도식의 텍스트에 설명된 대로 고정 단계를 계속 진행하십시오. 필름을 고정하고 건조시킨 후, 특정 밴드를 예측할 수 있도록 막의 가장자리와 단백질 표기법에 따라 표시하십시오.상호작용을 확인하고자 하는 모든 단백질에 대해 이러한 모든 항체 배양 단계와 암실 절차를 반복하십시오. 그런 다음 결과를 분석하십시오. 여기 저희의 최근 논문에서 가져온 내인성 면역침강 결과가 있습니다.본 영상에서는 내인성 ATG5 단백질을 침전시키고, 다양한 조건에서 내인성 RACK1의 공동 면역침전 수준을 확인하였습니다. 이러한 절차를 수행할 때는 다양한 처리 조건에 따른 상호작용 수준을 정량화하여 수집하기 위해, 양성 및 음성 대조군을 포함하여 가능한 한 많은 생물학적 반복 실험을 진행하는 것이 중요합니다. 모든 생물학적 반복 실험을 통해 얻은 전체적인 결과는 다양한 조건에서의 상호작용 패턴으로 정의됩니다.이 영상을 시청한 후, 단백질-단백질 상호작용의 역학을 탐색하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

자식 작용은 세포가 단백질과 세포 소기관을 분해하고 재활용 할 수있는 유비쿼터스 프로세스입니다. 우리는 시각화하고 작은 정량화 고급 형광 현미경을 적용하지만, autolysosomes로 형성과 autophagosomes와 리소좀의 배포, 자신의 융합 등 자식 작용의 유도와 관련된 필수, 물리적 변화.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

찬란 autophagy에 마커의 시간 경과 현미경은 높은 시간적 해상도로 동적 autophagy에 응답을 모니터링 할 수 있습니다. 3 가지 색상의 조합으로 특정 자식 작용과 세포 기관 마커를 사용하여, 우리는 강력한 공간과 시간적 맥락에서 autophagosome 형성 단백질의 기여를 볼 수 있습니다.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

우리는 LC-MS / MS 시스템을 사용 coregulatory 상호 작용 단백질의 정제 방법을 확립 하였다.

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

자식 작용의 활성화는 질병의 숫자의 예방에 유용하다. 생리 학적 접근 방법 중 하나는 생체 내에서 자식 작용은 운동이다 유도한다. 여기에서 우리는 유산소 운동으로 자식 작용을 활성화하고 마우스에서 자식 작용의 수준을 측정하는 방법을 보여줍니다.

마우스에 유산소 운동에 의해 자식 작용을 활성화

여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

여기 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 측정 하기 위한 간단 하 고 잘 검증 된 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 전체 셀룰러 LDH 수준에 비해 sedimentable 셀 분수에 젖 산 효소 (LDH)의 비율을 측정에 기반.

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

전계 효과 바이오 센싱 (FEB)은 생체 분자 상호 작용을 검출하기위한 라벨이없는 기술입니다. 결합 표적이 고정되는 그래핀 바이오센서를 통해 전류를 측정한다. FEB 기술은 Hsp90과 Cdc37 사이의 생체 분자 상호 작용을 평가하는 데 사용되었으며 두 단백질 간의 강력한 상호 작용이 검출되었습니다.

필드 이펙트 바이오센싱 기술을 이용한 분자 샤페론 Hsp90과 클라이언트 단백질 키나제 Cdc37 사이의 생체분자 상호작용 탐구

현재 프로토콜은 영양소 고갈을 통한 초파리 멜라노가스터 유충 지방체에서 자가포식 유도를 설명하고 형질전환 파리 균주를 사용하여 자가포식의 변화를 분석합니다.

Drosophila melanogaster 유충 지방체에서 기아로 인한 자가포식 분석

이 프로토콜은 면역형광 후 이미지 분석, 일시적인 과발현 고려 사항, 웨스턴 블롯을 사용한 ATG9A 당화 상태 조사를 포함하여 ATG9A 생물학 연구에 도움이 될 수 있는 다양한 방법을 설명합니다.

ATG9A, Multi-Spanning Membrane 단백질 이미징

여기에서는 반자동 고처리량 스크리닝 형식으로 루시페라아제 기반 리포터 분석을 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

자가포식 관련 4B 시스테인 펩티다아제 억제제에 대한 세포 기반 약물 스크리닝

여기에서는 면역블로팅을 통해 세포외 소포체(EV)에서 자가포식 마커 LC3-II 수준을 간결하게 평가하는 방법론을 제시합니다. EV에서 LC3-II 수준, 자가리소좀 형성 및 오메가솜 형성에 대한 분석은 자가포좀-리소좀 융합이 억제될 때 LC3-II 양성 EV의 방출에서 STX6의 새로운 역할을 시사합니다.

세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가

학습하세요 면역형광법과 면역침전법을 이용한 포유류 자가소식에서 단백질 상호작용 분석 방법을. 이 기술은 세포 신호전달 경로의 새로운 구성요소를 발견하고 단백질 역학을 이해하는 데 필수적입니다.

단백질 단백질 상호 작용 Autophagy 연구에서의 연구

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