H e r 2에 대 한 프로토콜 Cryo 보전 및 포 르 말린 고정의 장점을 결합 하 여 크로스 연결 비, 포 르 말린-무료 조직 정착 액을 사용 하 여 물고기

개인 맞춤형 의학은 고전적인 조직학에서 분자 분석에 이르기까지 다양한 유형의 분석을 필요로 하며, 최상의 치료법을 선택하기 위해 종양에 대해 다양한 현장 기술을 수행합니다. 조사 기법은 단일 표본에서 다양한 분석 기술을 가능하게 합니다. 우리는 여기에서 간단한 포르말린 고정 후 단계에서 비가교 고정제를 사용하여 형식 및 고정 파라핀 내장 재료에 대해 원래 개발 및 검증된 프로토콜을 사용할 수 있으며, 세포 샘플에서 우수한 형태, 우수한 RNA 품질 및 보다 완전한 의미의 현장 혼성화를 위한 좋은 결과를 산출하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.

일반적인 혼성화 조건은 포르말린이 없는 고정 조직이 FISH 결과를 생성하는 데 적합하지 않습니다. 우리는 펙틴 고정 조직에서 유사한 FISH 결과를 얻기 위해 중요한 것은 침투가 아니라 화학적 보정 시간이라는 것을 밝혔습니다. FISH에 사용되는 섹션만 공식적이고 사후 고정됩니다.

나머지 포르말린이 없는 고정 조직은 RTPCR에 의해 입증된 바와 같이 FFP 조직에 비해 우수한 분자 분석을 가능하게 합니다. 제 연구실의 기술자인 다니엘라 팹스트(Daniela Pabst)가 시연한 절차입니다. 먼저 멸균 메스로 유방암 조직 샘플을 각각 4mm 두께의 두 부분으로 잘라 적절한 조직 수량을 확보합니다.

표준 완충 포르말린 용액 또는 대안적인 비가교, 포르말린이 없는 조직 고정을 통해 고정을 위해 최대 크기의 4x15x15 millimiters를 사용하십시오. 종양 표본의 절반을 표준 조직 카세트에 넣고 SBFS에 담급니다. 종양 표본의 나머지 절반을 24시간 동안 대체 고정 용액에 넣고 4: 고정제와 1: 조직의 부피당 부피 비율로 놓습니다.

그런 다음, 용기를 열고 조직 카세트를 180도 회전시킨 다음 침수하여 2-72시간 동안 교대로 고정된 샘플을 안정제 용액으로 옮깁니다. 다음으로, SBFS가 고정된 샘플이 담긴 조직 카세트를 70% 에탄올이 채워진 용기에 실온에서 30분 동안 넣어 잔류 SBFS를 제거합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 조직 처리 및 포매 후 마이크로톰을 사용하여 FFPE 및 NCFPE 블록의 3미크론 섹션을 절단합니다.

각 유형의 섹션 중 일부를 냉수 욕조에 넣으십시오. 미세한 현미경 슬라이드에서 고운 붓으로 떠 있는 부분을 잡고 따뜻한 수조에 옮깁니다. 주름 없이 붓으로 늘어난 부분을 현미경 슬라이드에 다시 집습니다.

또한 RNA 분리를 준비하여 각 유형의 절편 중 일부를 반응 바이알에 배치하여 동일한 샘플에 대해 역전사 PCR을 수행합니다. 조직 절편의 파라핀화를 위해 염색 용기의 실온에서 절편을 250ml의 다양한 시약으로 단계적으로 수화합니다. 먼저 100% 크실렌에 절편을 15분 동안 두 번 두 번 넣은 다음 절편을 96% 에탄올로 15분 동안 두 번 옮깁니다.

다음으로, 점진적으로 더 낮은 비율의 에탄올을 통해 섹션을 이동하여 각 용액을 2분 동안 배양합니다. 마지막으로 단면을 10분 동안 두 번 증류된 것으로 옮깁니다. NCFPE 슬라이드를 SBFS로 채워진 새 염색 용기에 실온에서 24시간 동안 넣어 고정 후 수행합니다.

고정 후 24시간 단계 동안 용기를 흄 후드에 그대로 두십시오. 놀랍게도, 18시간 이상의 모든 고정 후 시간은 공식 및 고정 파라핀 재료로 얻은 것과 유사한 결과를 제공했습니다. 슬라이드에서 여분의 SPFS를 인산염 완충 식염수로 10분 동안 3회 세척하여 제거합니다.

두 번째 세척은 증류수로 10분 동안 두 번 씻습니다. 다음으로, 250ml의 열처리 용액 시트르가 들어있는 염색 항아리를 섭씨 98도의 수조에 넣습니다. 수화된 FFPE를 고정 후 NCFPE 슬라이드에 넣고 15분 동안 배양합니다.

그런 다음 새 염색 용기에 담아 실온에서 증류수로 슬라이드를 3분 동안 세척합니다. 단백질 분해를 위해 슬라이드를 섭씨 37도의 온도 조절 교잡에 놓습니다. 즉시 사용할 수 있는 펩신 용액을 완전히 덮일 때까지 조직 부분에 적방울로 바르십시오.

그런 다음 교잡 시스템에서 섭씨 37도에서 9분 동안 배양합니다. 다음으로, SSC 세척 버퍼가 들어있는 병에 슬라이드를 넣고 5 분 동안 배양합니다. 슬라이드를 실온에서 1분 동안 증류수에 넣습니다.

각각 1분 동안 일련의 등급이 매겨진 알코올로 섹션의 탈수를 수행합니다. 탈수 시리즈에 이어 섹션을 자연 건조하십시오. 혼성화를 위해 결합된 HER2 및 sun 17의 피펫 10마이크로리터를 건조된 조직 섹션에 프로브하고 각 샘플을 커버 슬립으로 덮고 고무 시멘트로 밀봉합니다.

코드는 섭씨 75도에서 10분 동안 혼성화 시스템에서 프로브와 표본 DNA를 변성시킵니다. 혼성화 시스템은 자동으로 섭씨 37도까지 감소하고 혼성화는 하룻밤 동안 계속됩니다. 다음날, 고무 시멘트와 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 교잡 후 및 보호를 위해 집게로 미끄러집니다.

섭씨 37도의 예열된 1X 완충액 A가 들어 있는 염색 용기에 5분 동안 크기를 배양합니다. 다음으로, 예열된 1X 세척 버퍼를 사용하여 섭씨 27도에서 5분 동안 두 번 슬라이드를 세탁합니다. 그런 다음 각 농도에 대해 1 분에 70 % 90 % 및 100 % 에탄올로 슬라이드를 탈수하십시오.

샘플을 공기 중에서 건조시키고 빛으로부터 보호하십시오. 염색을 위해 30마이크로리터의 DAPI 용액을 혼성화된 영역에 도포하여 기포를 피합니다. 빛을 차단하여 15분 동안 섹션을 배양하기 전에 커버 슬립으로 섹션을 덮으십시오.

여과지 사이의 슬라이드를 부드럽게 눌러 과도한 DAPI 용액을 조심스럽게 제거합니다. 컨포칼 현미경으로 평가할 때까지 최대 2주 동안 섭씨 2도에서 8도의 어두운 곳에서 슬라이드를 보관하십시오. 녹색 및 주황색 채널에 대한 필터를 사용하여 이미지를 획득합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 해석 및 RNA 품질 평가를 진행합니다. 여기에 표시된 것은 형식 및 고정 샘플에서 얻은 결과와 사후 고정된 비가교 고정 샘플의 직접 비교입니다. 신호의 강도는 비슷하고 배경도 비슷합니다.

정상적인 간기 세포에서는 HER2 유전자 자리와 sen 17 참조 유전자 자리에 해당하는 동일한 수의 적색 및 녹색 신호가 있으며, 이는 HER2 유전자에서 증폭이 없음을 보여줍니다. 여기에 보이는 것은 HER2 유전자가 증폭된 또 다른 사례의 결과이며, 참조 유전자보다 HER2 자리에서 훨씬 더 강력하고 넓은 신호가 있습니다. 이 현상은 형식적 조직과 고정조직, 그리고 비가교결합(non-cross-linking) 고정조직에서 명백합니다.

이 그래프는 GAPDH mRNA의 다양한 앰플리콘 길이에 대한 증폭 효능을 보여줍니다. 포르말린의 경우 약 23 사이클이 필요하며 비가교 고정 재료의 경우 20 사이클로 감소합니다. 이러한 차이는 더 긴 앰플리콘에서 더욱 분명해지는데, 이는 단편화와 화학적 변형이 모두 비가교 고정제를 사용하여 현저히 감소함을 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 사전 분석 절차에서 간단한 고정 후 단계를 추가하여 비가교 고정 재료에 FFPN 재료에 대해 FDA 승인 키를 사용하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 이 기술의 주요 장점은 완전한 의미의 현장 혼성화에 사용되는 단면만 포르말린으로 사후 고정되는 반면 나머지 블록은 비가교 고정액에 고정되어 광범위한 분자 분석에 사용할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 상대적으로 작은 종양에서 여러 분석을 수행해야 하고 다른 프로토콜에 대한 조직 표본을 처리하는 것이 불가능할 때 현대 맞춤형 의학의 맥락에서 특히 유용합니다.

또한, 비가교 고정제를 사용하면 동결 보존과 같은 조직 특성을 보존할 수 있다는 장점이 있습니다. 이렇게 하면 액체 질소를 동결할 필요가 없고 화학적 맥락에서 냉각 사슬을 유지할 수 있습니다. RNA 품질의 이러한 차이는 명확하지 않으므로 RNA 무결성 수와 같은 고전적인 RNA 품질 관리 분석을 사용할 때 이러한 분석은 고정 및 파라핀 포매 물질에서 분리된 RNA 품질에서 완전히 형성되지 않기 때문입니다.