배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징 Utero에서 일렉트로 포 레이션

이 절차의 전반적인 목표는 타임랩스 컨포칼 현미경으로 전기천공된 배아 뇌에서 준비된 유기형 슬라이스 배양에서 방사형으로 이동하는 뉴런을 직접 관찰하는 것입니다. 이 방법은 신피질 발달의 주요 측면을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이를 통해 뉴런 분극과 관련된 분자 메커니즘과 뉴런이 뇌 내 최종 위치로 방사형 이동하는 것을 조사할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 속도 프로파일, 평균 이동 속도 및 이동 방향의 변화를 포함하여 이동하는 뉴런의 동적 특성을 분석할 수 있다는 것입니다. 적절하게 마취된 임신한 마우스를 보온 플레이트의 누운 자세로 놓는 것으로 시작합니다. 페달 반사가 없는지 확인하십시오.

그런 다음 눈이 건조하지 않도록 바셀린으로 눈을 조심스럽게 덮습니다. 다음으로 팔다리를 부드럽게 펴고 수술 테이프로 보온 플레이트에 고정합니다. 70% 에탄올을 면봉으로 닦은 후 요오드 용액을 넣어 복부를 살균한 후, 복부 절개 부위를 절개한 멸균 거즈를 복부 위에 놓습니다.

거즈를 정균 반응식 염화나트륨 용액으로 적십니다. 페달 반사 상실로 인한 외과적 마취의 발달을 재평가한 후 톱니 모양의 마이크로 Adson 집게와 각진 가는 가위를 사용하여 복부 정중선을 따라 피부를 약 1.5cm 정도 자릅니다. 그런 다음 리네아 알바를 따라 밑에 있는 근육을 자릅니다.

링 겸자로 배아 사이의 자궁 뿔을 잡고 태반이나 공급 혈관을 교란시키지 않고 축축한 거즈 위에 부드럽게 올려 놓습니다. 그런 다음 배아를 조심스럽게 배치하여 시상동과 평행한 초승달 모양의 그림자로 나타나는 외심실을 명확하게 볼 수 있도록 합니다. 주사 부위는 색소가 있는 눈과 시상동이 두 개의 전달 부비동으로 분기되는 부비동의 합류점 사이의 선 중간에 있습니다.

확인되면 미세 주사 바늘을 자궁벽을 통해 외심실로 밀어 넣습니다. 다음으로, 풋 페달로 작동되는 마이크로인젝터를 사용하여 1-2마이크로리터의 DNA 용액을 5-10개의 펄스로 주입합니다. 성공적인 주입은 심실을 채워야 하는 착색 DNA 용액에 의해 모니터링될 수 있습니다.

그런 다음 핀셋 형 전극을 배치하여 양극 단자가 주입 된 심실과 같은 쪽에 있고 음극 단자가 배아 머리의 귀 아래 주입 된 심실의 반대쪽에 오도록합니다. 전기천공법 부위를 정균 억제 염화나트륨 용액 몇 방울로 적시고 950밀리초 간격으로 50밀리초 지속 시간의 전류 펄스를 5회 적용합니다. 음극의 기포는 전류를 나타냅니다.

60-90 밀리 암페어는 일반적으로 성공적인 electroporation에 충분합니다. 낮은 전류는 뉴런을 효율적으로 형질주입하지 않는 반면, 높은 전류는 배아의 사멸로 이어질 수 있습니다. 첫 번째 자궁 뿔의 모든 배아에 대해 이 절차를 반복한 후 부드럽게 복강에 다시 놓습니다.

근육층과 피부를 봉합한 후 요오드 용액으로 정중하게 소독하고 셀룰로오스 면봉을 사용하여 눈에서 바셀린을 부드럽게 제거합니다. 마우스를 적외선 아래에 놓습니다.amp 깨어날 때까지. 승인된 방법으로 임산부를 안락사시킨 후, 배아가 들어 있는 자궁을 제거하고 얼음처럼 차갑고 완전한 HBSS가 있는 10cm 페트리 접시에 넣습니다.

이 시점부터는 모든 용액, 배아 및 뇌를 얼음 위에 보관하십시오. 실체현미경으로 작업하는 동안 끝이 가는 집게와 Vannas Tubingen 스프링 가위를 사용하여 자궁에서 각 배아를 분리합니다. 배아를 얼음처럼 차가운 완전한 HBSS가 들어 있는 다른 페트리 접시로 옮깁니다.

뇌간 높이를 절개하고 시상 정중선을 따라 자릅니다. 뇌를 덮고 있는 피부와 연골을 벗겨냅니다. 그런 다음 반구 바로 뒤에 있는 뇌간을 잘라내고 두개골에서 뇌를 제거한다.

마이크로 스푼 주걱으로 뇌를 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어 있는 12웰 플레이트로 옮깁니다. 12웰 플레이트에 있는 쓰레기의 모든 뇌를 수집합니다. 그런 다음 형광 실체 현미경을 사용하여 12웰 플레이트의 뇌를 스크리닝하여 형광의 밝기와 전기 천공 영역의 크기를 확인합니다.

밝은 형광 신호를 가진 2-4개의 뇌와 추가 처리를 위해 추정되는 체성 감각 피질을 선택합니다. 그런 다음 용융된 3% 저융점 아가로스 용액을 박리 일회용 임베딩 몰드에 붓습니다. 마이크로 스푼 주걱을 사용하여 12웰 플레이트에서 뇌를 제거하고 미세한 티슈 페이퍼를 사용하여 뇌 주위에서 과도한 HBSS를 조심스럽게 배출합니다.

뇌를 아가로스 용액에 부드럽게 넣습니다. 그런 다음 20게이지 바늘을 사용하여 금형 바닥으로 밀어 넣고 위치를 조심스럽게 조정합니다. 관상 절편의 경우 후각구가 위쪽을 향하도록 뇌의 방향을 잡습니다.

아가로스 용액이 응고될 때까지 곰팡이를 얼음 위에 두었다가 뇌 절편을 진행합니다. 깨끗한 면도날을 사용하여 뇌 주변의 과도한 아가로스를 제거하고 2-3mm의 아가로스를 남겨야 하는 후각 전구를 제외한 모든 면에 약 1mm의 아가로스를 남깁니다. 소량의 시아노아크릴레이트 접착제를 표본에 바른 후 후각 전구가 아래를 향하도록 트리밍된 아가로스 블록을 고정합니다.

표본 단계를 얼음처럼 차가운 완전한 HBSS를 포함하는 진동 블레이드 마이크로톰의 슬라이싱 챔버로 옮기고 등쪽이 블레이드를 향하도록 뇌를 배치합니다. 전기천공 영역이 포함된 250미크론 두께의 뇌 절편을 낮거나 중간 정도의 진폭과 매우 느린 절편 속도로 절단합니다. 보통 밝은 형광 신호를 가진 4개에서 6개의 조각은 성공적으로 전기구멍이 뚫린 각 뇌에서 얻어진다.

끝이 가는 집게로 한 부분의 아가로스 가장자리를 잡고 구부러진 마이크로 스푼 주걱으로 슬라이스를 당깁니다. 이런 식으로, 뇌 절편을 얼음처럼 차가운 완전한 HBSS가 들어 있는 6웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 라미닌 코팅된 멤브레인 인서트를 100마이크로리터의 완전한 HBSS로 적십니다.

그런 다음 구부러진 마이크로 스푼 주걱과 집게를 사용하여 조각을 멤브레인에 조심스럽게 옮깁니다. 주걱에서 얇게 조각을 멤브레인으로 부드럽게 밀어 넣은 다음 집게를 사용하여 위치를 잡습니다. 나머지 슬라이스를 계속 전송합니다.

하나의 멤브레인 인서트에 최대 5개의 슬라이스를 배치할 수 있습니다. 피펫으로 과도한 전체 HBSS를 제거합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 슬라이스와 함께 멤브레인 인서트를 1.8ml의 슬라이스 배양 배지가 들어 있는 6웰 플레이트에 조심스럽게 놓습니다.

도립 현미경을 통해 절편을 보고 이미징할 뇌 절편을 선택합니다. 상부 SVZ에 있는 밝은 단일 뉴런이 슬라이스의 말뚝 표면을 향해 방사상으로 이동하는 슬라이스를 선택합니다. 전체 접합판에 걸쳐 있는 방사상 신경교세포의 미세한 형광 돌기의 존재는 접합 뉴런을 이동시키는 데 사용되는 손상되지 않은 방사형 신경교세포를 나타냅니다.

선택한 슬라이스가 있는 멤브레인 삽입물을 2밀리리터의 슬라이스 배양 배지가 들어 있는 50mm 직경의 바닥이 유리로 된 접시에 옮깁니다. 접시를 컨포칼 현미경의 기후 챔버에 놓습니다. 해상도를 512 x 512 픽셀로 설정합니다.

스캔 속도를 400Hz에서 700Hz로 높이면 프레임 속도가 초당 약 1.4프레임에서 약 2.5프레임으로 증가합니다. 평균적으로 두 번 이상 사용하지 마십시오. 1.5 미크론의 스텝 크기로 전기천공된 영역을 통해 Z-스택을 정의합니다.

30분마다 Z 스택을 가져와 타임랩스 시리즈를 시작합니다. 설명된 설정은 이미지의 충분한 해상도와 밝기를 허용하면서 획득하는 동안 사진 손상을 낮게 유지합니다. 이 동영상은 E16.5 피질 뉴런이 심실하부(ventricular subventrical zone)에서 피질판(cortical plate)으로 이동하는 것을 보여줍니다.

Bcl11a에서 배아 14.5일에 IRES-GFP 대조군 플라스미드의 전기천공 후 플록스된 조건부 형질전환. 영화는 초당 5프레임의 속도로 108개의 프레임으로 구성됩니다. 축척 막대는 100미크론을 나타냅니다.

Cre-IRES-GFP를 포함하는 DNA 플라스미드 벡터의 전기천공법은 조건부 Bcl11a 플록스 뇌에서 피질 뉴런 이동에 영향을 미쳤습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 매우 적은 수의 뉴런이 중간 영역을 지나 피질 판에 도달합니다. 이 동영상은 왼쪽의 GFP 표지 대조군의 피질 뉴런과 오른쪽의 Bcl11a 돌연변이의 뉴런의 분극을 보여줍니다.

Bcl11a 돌연변이 뉴런의 대표 제어에 대한 이러한 애니메이션 흔적은 1시간 간격 해상도로 E16.5 슬라이스 배양의 타임 랩스 시리즈에서 얻어졌습니다. 다시 말하지만, 제어 뇌의 데이터는 왼쪽에 표시되고 Cre-IRES-GFP 전기 천공 뇌의 데이터는 오른쪽에 표시됩니다. 대조군 및 Bcl11a 돌연변이 절편 배양에서 얻은 대표적인 추적 모음에서 볼 수 있듯이, Bcl11a 돌연변이 뉴런은 빨간색 화살촉으로 표시된 것처럼 이동 속도가 감소하고 방향이 무작위로 변경되는 반복적인 단계를 자주 겪습니다.

속도 프로파일은 이동하는 뉴런의 흔적에서 계산할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 Bcl11a 돌연변이 뉴런의 더 많은 비율은 대조군에 비해 이동 속도가 느립니다. 편차 각도는 트레이스 데이터로부터 계산될 수 있다.

이 히스토그램에서 볼 수 있듯이 검은색 막대로 표시되는 Bcl11a 돌연변이 뉴런은 대조군에 비해 더 큰 편차 각도를 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 자궁 내 전기천공법과 유기형 뇌 절편 배양 준비를 위해 각각 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 혈관 실험뿐만 아니라 기능의 이득 및 상실을 통해 방사상으로 이동하는 피질 뉴런에 대한 관심 유전자의 분수 분석을 수행하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 타임랩스 컨포칼 현미경으로 전기천공된 배아 뇌에서 준비된 유기형 슬라이스 배양에서 방사형으로 이동하는 뉴런을 직접 관찰하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.