식별 및 태그-소설 RIP;으로 유전자 이동에 의해 전이성 요인의 특성 RIP-tva Murine 모델

이 절차의 전반적인 목표는 Novel RIP-Tag로의 유전자 전달에 의해 전이성 요인을 식별하고 특성화하는 것입니다. RIP-tva 마우스 모델. 이 방법은 동인 및 새로운 치료 표적을 식별하는 것과 같은 암 전이 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 암의 마우스 모델의 주요 장점은 췌장 베타 세포 전구체 군단으로의 체세포 유전자 전달에 의해 전이 인자를 식별하는 것입니다.

감염될 쥐당 DF1 세포를 생성하는 15cm 접시 하나를 수확하는 것으로 시작합니다. 먼저 합류 15cm 접시에서 매체를 수집합니다. 그런 다음 사전 냉각 원심분리기에서 1650배 G 및 섭씨 4도에서 10분 동안 저속 원심분리로 세포 파편을 제거합니다.

다음으로, 바이러스 상층액을 폴리알로머 초원심분리기 튜브로 옮깁니다. 초원심분리기에서 1.5시간 동안 G 9540배, 섭씨 4도에서 회전합니다. 초원심분리기 튜브에서 상층액을 최대한 많이 제거합니다.

그런 다음 PBS를 초원심분리기 튜브에 추가하여 15cm 접시당 최종 100마이크로리터 바이러스 현탁액을 만듭니다. 튜브를 실험실 필름으로 덮고 중간 속도로 2분 동안 볼텍싱하여 보이지 않는 바이러스 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 초원심분리기 튜브를 섭씨 4도에서 1시간 또는 하룻밤 동안 흔듭니다.

배양 후 바이러스 현탁액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 바이러스 역가를 진행합니다. 12개의 웰 조직 배양 플레이트에 장착된 DF1 세포가 30% 포화도에 도달했는지 확인하여 적정 절차를 시작합니다. 각 바이러스 역가 측정을 위해 1개의 12웰 플레이트가 필요합니다.

먼저 마이크로 원심분리기 튜브에서 5마이크로리터의 바이러스 상등액과 495마이크로리터의 성장 배지를 혼합하여 10에서 2차 희석을 만들어 바이러스 상등액의 10배 연속 희석을 시작합니다. 몇 초 동안 잠시 동안 소용돌이. 그런 다음 10에서 2 희석액으로 40 마이크로 리터를 10에서 3 희석을 위해 마이크로 원심 분리 튜브에서 360 마이크로 리터의 성장 매체로 옮깁니다.

몇 초 동안 잠시 동안 소용돌이. 이 과정을 계속하여 10에서 4까지, 10에서 5까지 희석합니다. 다음으로 2.25 밀리리터의 성장 배지를 5 개의 6 밀리리터 폴리스티렌 튜브 각각에 분취합니다.

그리고 각각 10에서 6까지, 10에서 7까지, 10에서 8까지, 10에서 9까지, 그리고 10에서 10까지라고 이름을 붙인다. 10 내지 5 번째 희석액 0.25 밀리리터를 6 밀리리터 폴리스티렌 튜브에 2.25 밀리리터의 성장 배지와 혼합하여 10 내지 6 차 희석액을 만듭니다. 몇 초 동안 잠시 동안 소용돌이.

10에서 7번째, 10에서 8번째, 10에서 9번째, 10에서 10번째 희석에 대해 절차를 반복합니다. 다음으로, 12개의 웰 플레이트에 있는 DF1 세포에서 원래 배양 배지를 제거합니다. 그리고 각 웰에 1밀리리터의 희석된 바이러스를 중복하여 첨가합니다.

세포가 섭씨 37도, CO2 5도에서 최소 7일 동안 성장하도록 합니다. 먼저 7주 된 RIP-Tag RIP-tva 마우스를 마취하여 감염 절차를 시작합니다. 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 양쪽 눈에 눈 윤활제를 바르십시오.

RIP-Tag RIP-tva 마우스의 흉강에서 털을 면도하고 포근한 안전 워머 위에 있는 흡수성 실험실 벤치 종이에 가슴이 위를 향하도록 마우스를 등을 대고 놓습니다. 발가락 꼬집기를 수행하여 동물이 반응이 없는지 확인하고 완전한 마취 효과를 확인합니다. 앞다리를 펴고 테이프로 고정합니다.

주사를 위해 마우스의 가슴을 표시하십시오. 흉골 노치와 xiphoid 돌기의 상단 사이의 중간 위치와 흉골의 해부학적으로 약간 왼쪽을 표시합니다. 그런 다음 포비돈 요오드 스크럽 또는 클로르헥시딘 스크럽으로 전방 흉벽을 문지른 다음 70% 이소프로필 알코올 또는 70% 에탄올을 적신 거즈 스펀지로 문지릅니다.

멸균 28.5 게이지 인슐린 주사기에 50마이크로리터의 공기를 빨아들여 플런저와 500마이크로리터 주사기의 반월판 사이에 공간을 만듭니다. 100마이크로리터의 바이러스를 추출합니다. 벽에 액체가 없는 공기는 심장 맥박을 보는 데 매우 중요합니다.

바늘을 똑바로 세우고 한 손으로 마우스의 피부를 팽팽하게 잡고 표시된 위치에 바늘을 삽입합니다. 주사기에 밝은 붉은 혈액 펄스가 나타나면 바늘 전진을 멈추고 한 손으로 마우스의 바늘 깊이를 고정하십시오. 다른 손을 사용하여 플런저를 조심스럽고 천천히 밀어 약 60초 동안 바이러스 현탁액을 전달합니다.

주사기에 밝은 빨간색 혈액 펄스가 나타날 때마다 10-20 마이크로 리터를 전달하십시오. 산소가 공급된 적혈구가 투명한 바늘 허브로 계속 들어가는 것은 바늘이 좌심실에 올바른 위치를 잡았음을 나타냅니다. 바이러스 현탁액을 전달하기 위해 약탈물을 마지막으로 누른 후 다음 붉은 혈액 맥박을 보기 전에 흉강에서 바늘을 빠르게 빼냅니다.

출혈을 줄이기 위해 최소 1분 동안 주사 부위에 부드러운 압력을 가합니다. 그런 다음 마우스를 가열 패드 또는 열 램프 아래로 조심스럽게 이동하여 완전히 의식이 될 때까지 이동합니다. RIP-Tag RIP-tva 마우스는 생후 7주에 표시된 RCASBP-Bcl-xL 레트로 바이러스에 감염되었고 16주에 안락사되었습니다.

이 사진은 췌장 림프절에서 전이성 췌장 신경내분비 종양의 대표적인 시냅토피신 염색을 보여줍니다. 여기서 RIP-Tag RIP-tva 마우스는 표시된 RCASBP-RHAM B에 감염되었습니다.이 사진은 췌장 림프절에서 전이성 췌장 신경내분비 종양의 대표적인 시냅토피신 염색을 보여줍니다. 여기서 시냅토피신 염색은 RCASBP-RHAMM B 바이러스 주입 후 간에서 볼 수 있습니다.

RIP-Tag에서 증식하는 TVA 세포의 생체 내 감염에 필요한 밀리리터당 8개의 감염 단위가 10개 이상이라는 제목을 기억하는 것이 중요하며, RCASBP 레트로 바이러스 렉터는 최대 2.5 킬로베이스까지 CDNA를 전달할 수 있습니다. 이 마우스 모델의 개발 이후, BCL-xL이 실제로 항세포사멸 기능과 무관하게 암 전이를 촉진한다는 패러다임 전환의 길을 열었습니다.