Drosophila 섬 분석 결과에서 운전 행동의 높은 처리량 분석

Island Assay의 전반적인 목표는 자동 데이터 처리 및 객관적인 정량화를 통해 Drosophila melanogaster의 기본 운동 행동을 평가하는 것입니다. 이 방법은 운동 장애와 관련된 유전자와 같은 운동 행동의 주요 조절 인자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 결함을 되돌릴 수 있는 약물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 초파리의 운동 행동에 대한 높은 처리량의 정량화가 가능하여 이 기술을 대규모 스크리닝에 적합하게 만든다는 것입니다. 우리는 많은 수의 질병 모델을 분석할 수 있도록 이 방법론을 개발하기로 결정했습니다. 이를 실현하기 위해 자동화된 이미지 데이터 분석이 필요했습니다.

이 방법을 시각적으로 시연하면 매우 유용합니다. 베타 처리의 몇 가지 단계가 중요하며, 새로운 사용자, 특히 사용 중인 소프트웨어 패키지에 익숙하지 않은 사용자에게는 어려울 수 있습니다. 먼저, 실험 조건당 최소 3개의 바이알을 생물학적 복제물로 준비합니다.

각 파일에는 같은 성별과 비슷한 나이의 파리가 약 15마리 포함되어야 합니다. 중요한 것은 파리의 날개가 손상되지 않은 것이어야 한다는 것입니다. 실험을 저장할 폴더를 만듭니다.

conditions 및 replicates에 의해 정의된 디렉토리 구조에서 이를 생성합니다. 예를 들어, 실험에 각각 5개의 반복실험이 있는 두 개의 유전자형이 있는 경우 실험 날짜가 포함된 기본 폴더를 만들고 해당 폴더 안에 각 유전자형에 대해 하나의 하위 폴더를 만듭니다. 그런 다음 유전자형 폴더 내에서 각 복제에 대한 하위 폴더를 만듭니다.

다음으로 테스트 장치를 설정합니다. 목욕 트레이에 소량의 비누를 푼 찬물을 넣고 욕조에 이미 고정되지 않은 경우 플랫폼을 욕조 중앙에 놓습니다. 트레이와 플랫폼을 투명 상자로 덮습니다.

플랫폼을 비추려면 일반 12볼트 LED와 같은 멋진 램프를 그 위에 배치하십시오. 또한 컴퓨터에 연결된 웹캠을 플랫폼 바로 위에 배치합니다. 컴퓨터에서 이미지 녹화 소프트웨어를 엽니다.

메뉴 시스템에서 적절한 웹캠을 캡처 장치로 선택합니다. 섬에 죽은 파리를 놓아 비디오 설정을 조정합니다. 소프트웨어의 밝기, 대비 및 색상을 조정하여 죽은 파리가 흰색 배경에 검은색으로 보이도록 합니다.

그런 다음 타임랩스 동영상 설정을 조정하여 동영상을 AVI 파일로 저장합니다. 그런 다음 데이터를 저장해야 하는 디렉토리로 이동하여 영화의 이름을 정의합니다. 이러한 변경 사항을 저장합니다.

이미지 데이터를 압축하려면 Intel IYUV 코드를 선택합니다. 녹화 속도를 0.1초마다 한 프레임으로 설정하고 해당 재생 속도를 초당 10개 이미지로 조정합니다. 마지막으로 고급 설정으로 이동하여 캡처된 각 프레임에 대해 bmp 이미지 만들기를 선택합니다.

그런 다음 AVI 파일을 호스팅하기 위해 선택한 것과 동일한 디렉토리로 이동하여 확인을 누릅니다. 시작하기 전에 섬이 비어 있고 깨끗한지 확인하십시오. 그런 다음 이미지 녹화 소프트웨어의 타임랩스 이미지 인터페이스에서 녹화를 시작합니다.

파리가 들어 있는 유리병을 두세 번 두드려 모든 파리를 바닥으로 떨어뜨립니다. 그런 다음 바이알에서 플러그를 빠르게 제거하고 파리를 플랫폼에 세게 두드립니다. 그들은 모두 거의 동시에 플랫폼에 도달해야 합니다.

파리가 플랫폼을 떠날 때까지 최대 30초를 기다린 다음 녹음을 중지합니다. 필요한 경우 플랫폼에 남아 있는 파리를 수동으로 제거합니다. 다음 실험을 진행하기 전에 다음 데이터 집합이 저장될 디렉터리를 다시 정의해야 합니다.

첫 번째 작업은 수집된 이미지 시리즈의 스택과 프로젝션을 생성하는 것입니다. 피지에서 Drosophila Island Assay를 엽니다. 새 창에서 첫 번째 이미지 시계열 식별자를 입력합니다.

다음으로, create stack 및 projection 하위 매크로만 선택합니다. 확인을 클릭하고 개별 Island Assay 실험이 있는 모든 하위 폴더가 포함된 폴더로 컴퓨터를 안내합니다. 데이터를 처리한 후 각 개별 실험 하위 폴더에 두 개의 새 파일이 나타납니다.

다음 작업은 이미지에서 플랫폼의 정확한 위치를 정의하는 것입니다. 그래픽 인터페이스를 열고 define platform 확인란을 선택합니다. 그런 다음 실험적 하위 폴더가 저장되는 디렉토리를 선택합니다.

프로젝션 이미지와 두 개의 창이 열립니다. 첫 번째 이미지에서는 폴리곤 선택 도구를 사용하여 아일랜드 플랫폼 위에 폴리곤을 그립니다. 이 선택에서 플랫폼의 매개변수에 경계선을 포함하지 마십시오.

ROI 관리자 창에서 추가를 클릭하여 ROI 관리자 창에 선택 항목을 추가합니다. ROI 관리자에 선택 항목을 추가하면 값 집합으로 나타납니다. 그런 다음 define the platform 창에서 ok를 클릭합니다.

소프트웨어는 폴더에 저장된 다음 프로젝션 이미지로 이동합니다. ROI 관리자에 저장된 ROI를 선택하고 플랫폼 정의 창에서 이 ROI를 확인하여 플랫폼에 대한 동일한 ROI를 다음 프로젝션 이미지에 계속 적용합니다. 다음 프로젝션 이미지로 진행하기 전에 실험 중에 플랫폼이 움직이지 않았는지 확인하십시오.

플랫폼의 위치가 이동한 경우 선택 항목의 가운데를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 필요한 위치로 드래그합니다. 선택 상자가 플랫폼과 일치하지 않는 경우, 선택 영역 바깥쪽을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 폴리곤 도구를 사용하여 플랫폼에 대한 새 선택 영역을 표시합니다. 이 새 선택 항목을 ROI 관리자에 추가합니다.

그런 다음 define platform(플랫폼 정의) 창에서 OK(확인)를 클릭하여 새 선택 항목을 확인하고 모든 이미지가 플랫폼을 올바르게 정의할 때까지 절차를 계속합니다. 데이터를 처리하기 전 마지막 작업은 파리의 최소 크기를 정의하는 것입니다. 이는 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다.

플랫폼에서 탈출하는 파리를 정량화하려면 먼저 최소 플라이 크기를 설정합니다. 그런 다음 실험 계열 내의 파일에서 가장 많은 파리를 나타냅니다. analyze 함수를 시작하고 프롬프트에서 실험의 기본 디렉토리를 선택합니다.

매크로를 실행한 후 새 결과 파일과 새 이미지 스택이 각 폴더에 나타납니다. 이러한 파일을 열어 절차가 올바르게 수행되었는지 확인합니다. R 또는 RStudio 소프트웨어 패키지를 시작하고 Island Assay 분석 스크립트를 열어 모든 실험을 동시에 처리합니다.

분석이 성공하려면 스크립트를 올바르게 편집해야 합니다. 스크립트의 16행에 분석할 실험이 포함된 기본 디렉터리의 경로를 삽입합니다. 분석 출력 파일을 저장해야 하는 폴더의 경로를 행 19에 삽입합니다.

후자는 분석할 이미지 데이터가 포함된 디렉터리와 다른 위치여야 합니다. 이제 도구 모음에서 스크립트를 실행하고 결과 분석을 진행합니다. Island Assay analysis 스크립트는 각 실험 조건에 대한 선 그래프를 내보냅니다.

그래프는 해당 조건의 각 반복에 대해 시간 경과에 따른 플랫폼에 남아 있는 파리의 백분율을 보여줍니다. 내보낸 선 그래프인 escape response:all conditions는 기본 폴더에 있는 처음 12개의 실험 조건에 대한 평균 비행 탈출 응답의 평균 및 표준 오류를 요약합니다. 각 실험 반복실험에 대한 곡선 아래 면적은 실험 조건이 서로 크게 다른지 여부를 확인하기 위해 계산됩니다.

곡선 아래 면적과 각 실험 조건에 대한 중앙값이 그래프로 내보내집니다. 기본 폴더에 있는 조건의 수에 따라 스크립트는 두 개의 조건에 대해 양측 쌍을 이루지 않은 Welch T-검정을 수행하거나 두 개 이상의 조건에 대해 두 개의 키 수정이 있는 ANOVA를 수행합니다. 스크립트 Island Assay 분석으로 계산된 모든 숫자 데이터도 내보내져 데이터 출력 폴더에 csv 또는 txt 파일로 저장됩니다.

운동실조증(Ataxia telangiectasia)은 ATM 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 상염색체 열성 운동 장애입니다. 이 질병은 소뇌 운동 실조증의 조기 발병이 특징입니다. ATM의 플라이 ortholog를 유비쿼터스하게 knocking down down의 효과는 Island Assay에서 조사하고 대조군과 비교했습니다.

전반적으로, 플라이 ATM ortholog, Tefu의 유비쿼터스 넉다운은 유전적 배경 대조군에 비해 Island Assay에서 운동 성능을 크게 감소시켰습니다. 기록된 Island Assay 데이터의 수동 분석은 자동 분석과 동일한 결과를 제공했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 Island Assay를 수행하는 방법, Drosophila Island Assay 매크로를 실행하는 방법 및 Island Assay 분석 스크립트를 작동하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 프로토콜을 시도하는 동안 이미지 분할의 품질이 영화의 품질과 상관 관계가 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 대비가 좋을수록 분석이 더 매끄러워집니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 높은 처리량으로 초파리의 운동 능력을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 분석을 사용한 후, 음성 지오택시를 테스트하는 것과 같은 다른 분석을 사용하여 운동 결함을 추가로 조사할 수 있습니다.