초고 해상도 마우스 광학 일관성 단층 촬영 망막 유전자 치료 연구에서 안 구내 주사를 돕기 위해

이 subretinal 주입 절차의 전반적인 목표는 실시간으로 관찰할 수 있는 최소 침습적이고 재현 가능한 방식으로 망막에 벡터를 전달하는 것입니다. 안녕하세요, 이 방법은 벡터 전달 효능 및 치료제 독성에 대한 유전자 치료 연구에서 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있다. 이 기술의 몇 가지 장점은 망막 및 기타 눈 구조에 최소한의 손상, 정밀 한 사출 사이트 매핑 및 고체 통계 추론을 허용하는 엄격한 정량적 생체 내 측정을 포함한다.

안구 간 유전자 주입의 경우, 먼저 망막 이미징 시스템 현미경의 시야 단계에 마취 마우스를 배치하고 집약을 열고 아래로 밀어 내는 동안 눈꺼풀의 7 시 및 10 시 위치에 멸균 무딘 홍채 집게의 팁을 배치하여 부드럽게 프강전증을 유도합니다. 집게를 사용하여 눈꺼풀을 눈꺼풀을 동축시키고 바늘 끝을 각막 림푸스 가장자리 아래 약 1~1.5밀리미터로 향합니다. 다음으로, 멸균 PBS 용액 한 방울을 눈에 바르고 멸균 커버 슬립으로 눈을 가립니다.

경내 우울증이 생성 될 때까지 조심스럽게 결막을 통해 눈으로 바늘을 운전. 마이크로 조작기를 사용하여 경피성 우울증이 초점을 맞출 때까지 눈을 위쪽으로 회전한 다음 바늘을 앞으로 몰아 바늘 끝으로 망막에 날카로운 피크를 만듭니다. 바늘 홀더를 사용하여, 바늘의 끝이 클라와 RPE를 통해 지루해질 때까지 바늘을 회전시켜, 바늘 의 끝에 있는 밀가루가 피하 공간 및 망막 안료 상피 세포 단층의 바로 부근에 있는 망막 조직 하에서 볼 수 있도록 합니다.

바늘의 끝을 아래로 운전하여 전 세계에 접선한 다음 발 페달 스위치로 사출 펌프를 활성화하십시오. 0.5~1마이크로리터의 트랜스진 용액이 체증 공간으로 전달된 후, 바늘을 철회하고 혈액이 안정되고 그 액체가 주입관 부위에서 누출되지 않는지 확인한다. 주입의 성공을 확인하려면 직사각형 볼륨 OCT를 기록하고 이미지를 다양한 종류의 잠재적 인 주입 결과의 이미지와 비교합니다.

적절한 주입 배치를 확인한 후 직사각형 OCT 이미지를 사용하여 블B의 정도를 fundus 이미지에 매핑합니다. 피망 의 정도를 매핑하기 위해 눈 안에 인식 가능한 랜드마크가 이미지에 포함되는 것과 같은 Bleb의 직사각형 볼륨 OCT 이미지를 엽니다. 필요에 따라 B 스캔의 왼쪽 및 오른쪽 가장자리의 위치를 식별하고 시신경 헤드, ONH, 존재하는 경우 및 망막이 RPE 및 choroid에서 분리된 변곡점을 식별한 다음 데이터를 저장합니다.

그런 다음 저장된 파일을 컴파일하고 데이터를 플롯하여 EN FACE OCT 이미지에 주입 블B맵을 효과적으로 만듭니다. 플롯된 데이터를 주입 부위를 포함하는 fundus 이미지에 오버레이하고 병합된 이미지를 저장합니다. 이 이미지를 사용하여 후속 OCT 이미징 중에 관심 영역을 찾습니다.

사출 망막 변성을 평가하기 위해 먼저 기록된 고해상도 스펙트럼 도메인 OCT 또는 HRSD OCT 직사각형 볼륨 이미지를 열고 측정할 B 스캔을 선택합니다. 선택한 이미지가 화면을 채울 때까지 확대하고 이미지를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 캘리퍼를 클릭하여 적절한 수의 캘리퍼를 선택한 다음 구성 캘리퍼 기능을 사용하여 캘리퍼를 각도 블록 열에서 수직으로 할당하고 디스플레이 캘리퍼 위치를 켜서 망막 전체에 균일한 캘리퍼 배치를 용이하게 합니다.

적용을 클릭하고 적절한 위치에 각 캘리퍼를 이동 0.1 받는 사람 0.2 B 스캔을 통해 밀리미터 떨어져, 적절 한 경우 시신경 헤드의 중심에 하나의 캘리퍼를 배치 하는 주의. 모든 캘리퍼가 배치되면 각 캘리퍼를 관심 지역의 길이 범위로 클릭하고 드래그하여 임의로 B 스캔의 측정 가능한 영역을 최대 길이로 오버레이하지 않도록 설정합니다. 외부 핵층 두께를 측정하려면 각 캘리퍼의 상단을 외부 제한 멤브레인에 놓고 각 캘리퍼의 바닥을 외부 플렉시폼 층의 바닥에 0.1~ 0.2밀리미터 단위로 배치합니다.

모든 캘리퍼를 배치하고 크기로 조정한 후, 이미지를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 캘리퍼 데이터를 저장합니다"라고 적시면 캘리퍼를 X 축의 동일한 위치에 열고 필요에 따라 캘리퍼의 길이를 x 방향으로 이동하지 않고 측정을 반복합니다. 모든 검사를 측정한 경우 저장된 데이터 파일을 열고 수정된 날짜를 클릭하여 저장된 시간에 따라 파일을 정렬합니다. 측정된 각 B 스캔에 대한 모든 파일을 열고 각 B 스캔의 원시 데이터를 가장 낮은 프레임 번호에서 가장 높은 프레임 번호로 단일 파일로 컴파일하고 캘리퍼 이름, 길이 및 중앙 X 열을 포함한 데이터 열을 선택합니다.

처리된 각 직사각형 볼륨 OCT 이미지에 대해 측정된 모든 B 스캔에 대해 가운데 X가 동일한지 확인하고 측정을 기록하는 데 사용되지 않은 캘리퍼의 데이터를 삭제합니다. 시신경 헤드의 중앙에 위치한 캘리퍼를 0으로 설정하고 X 대 다중 Y 데이터 세트에 대한 데이터를 플롯하여 외부 핵층 또는 기타 측정망막 층의 두께에 대한 3D 플롯 함수를 얻습니다. 그런 다음 제어 및 실험 동물 간의 외부 핵층 측정값을 해당 연령과 비교하여 잠재적망막 변성의 속도와 균일성을 결정합니다.

망막 측정의 3D 매핑의 경우, 주입 후 OCT 이미지를 검토하고 식별 가능한 랜드마크를 기록한 다음 동물을 동일한 영역에서 후속 SDO CT 이미지를 획득하도록 배치하고 동일한 식별 가능한 랜드마크를 포함하고 기록된 이미지를 방금 입증한 대로 처리합니다. 이전에 주입된 망막 영역의 재이미징을 용이하게 하기 위해 식별 가능한 랜드마크를 포함하는 고품질 OCT 이미지를 얻는 것이 매우 중요합니다. OS 길이의 변화를 측정하기 위해 캘리퍼는 외부 제한 멤브레인에서 브룩스 멤브레인으로 배치되어 이러한 층이 OCT 이미지에서 쉽게 식별되기 때문에 신뢰할 수 있는 측정을 가능하게 했습니다.

서로 다른 마우스 줄에서 이러한 레이어 사이의 측정의 차이는 짧은 외부 세그먼트 길이에 기인했다. 피하 주사가 성공적으로 수행되는 경우, 하수 공간의 개방은 HRSD OCT 이미저 및 B 스캔 이미지의 en 얼굴 뷰에서 모두 명확하게 시각화될 수 있는 블의 생성을 유도한다. 사출 부위의 경계 맵을 겹쳐서 망막 조직 측정 및 캘리퍼 위치 데이터 세트의 세분화를 통해 망막 변성에 대한 특정 치료제의 효과에 대한 후속 통계 적 테스트를 허용합니다.

일단 마스터되면 제대로 수행하면 이 기술을 10분 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 외과 환경을 깨끗하고 멸균하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 유전자 치료 분야의 연구원들이 전체 subretinal 수술 주사 과정을 실시간으로 모니터링할 수 있는 길을 열어주었으며 생체 내에서 즉시 수술 성공을 결정하는 방법을 만들었습니다.

이 주입 절차에 따라, OCT 및 전기 망열과 같은 다른 방법은 유전자 기능 구조 및 / 또는 독성에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 이 비디오를 시청한 후, 당신은 이 이미지에서 10월에 주입 블B의 정도를 매핑하고, 외부 망막 층의 엄격한 측정을 얻는 방법, 경피성 및 경부 피하 주사를 수행하는 방법을 이해해야 한다. 유전자 치료 벡터로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.