Name: 종양의 유도 및 진단 Drosophila 상피 디스크 상피 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 배우세요 Drosophila 상피 디스크에서 GAL4-UAS 시스템을 활용한 종양 유도 및 단계별 분류 방법을. 이 프로토콜은 암 연구를 위한 신뢰할 수 있는 모델을 제공합니다.

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우리는 원고를 비판적으로 읽었던 J. Vaughen에게 감사드립니다. 이 연구는 JSPS 가신 교부금 번호 26891025, 15H01500 및 YT에 대한 다케다 과학 재단 연구 보조금의 교부금으로 지원되었습니다

1. 십자가 비행 및 유도 유도 <ol><li> 처녀 파리를 수집하기 전에 유리 병에서 모든 파리를 12 시간 안에 제거하십시오. </li><li> CO 2 가스를 주입하고 파리를 CO 2 플라이 패드 위에 놓아 바이알의 파리를 마취시킵니다. </li><li> CO 2 플라이 패드의 10 - 20 명의 처녀 암컷과 10 명의 수컷을 신선한 유리 병으로 옮기고 25 ° C에서 1 일 동안 품어 라. </li><li> 이들 파리를 신선한 유리 병에 옮기고 25 ° C에서 12 시간 동안 품어 낸다. 참고 : 처녀 암컷은 첫날에 충분한 알을 낳지 않으므로 첫 번째 약병을 폐기하십시오. </li><li> 인핸서 GAL4 라인 들어, 성인 파리를 제거하고 25 분 해부 때까지 바이알을 품어. </li><li> 플립 아웃 GAL4에 의해 모자이크 클론의 유도에 대한 성인 파리를 제거하고 25에서 2 ~ 4 일 동안 유리 병을 품어 ° C. 열 충격 이전의 배양 시간은 실험 목적에 달려있다. 난자 채취 2 일 후 열충격 (AED)은 미성숙 한 두 번째 날에 모자이크 클론을 생성한다상상 상피를 형성한다. 3 또는 4 일 후 열 충격은 분화 된 조기 - 중반 - 셋째 inst 상상 세포에서 모자이크 클론을 생성합니다. 참고 : 종양 생성 성 표현형에 대한 열 충격 타이밍의 변화를 조사하는 것이 중요합니다. </li><li> 플립 아웃 GAL4에 의한 모자이크 클론의 유도를 위해 25 ℃에서 2-3 일 동안 배양 한 후 10-45 분 동안 37 ℃의 수조에 침지시켜 바이알을 가열 충격을가한다. 참고 : 각 실험에서 열 충격 시간, 시간 및 배양 시간에 대한 정보는 그림 범례에 표시되어 있습니다. </li></ol> 2. 애벌레의 해부 <ol><li> 형광 입체 현미경하에 적절한 형광 마커 ( 예 : EGFP)에 의해 나무 막대기 또는 무딘 집게와 genotype 그들 방황 셋째 instar 애벌레를 수집하고 PBS (인산염 완충 식염수)와 해부 접시에 그들을 놓으십시오. </li><li> 2 ML 플라스틱 전송 pipettes와 pipetting하여 PBS에 애벌레를 씻으십시오. </li><li>하나의 집게로 유충의 중심을 꼬집어 다른 집게로 반으로 몸을 찢어. </li><li> 하나의 집게로 앞쪽 절반의 입 갈고리를 집어 넣고 다른 집게로 몸쪽으로 입을 밀어 내면 몸을 밖으로 내 보냅니다. </li><li> 타액선과 같은 불필요한 물질이나 집게로 지방을 제거하십시오. </li></ol> 3. 고정 및 항체 염색 <ol><li> 1.5 ML 플라스틱 튜브에 유충 본문 (상상의 날개 디스크를 포함하여)의 해부 전방 절반을 전송하고 부드럽게 회전과 어둠 속에서 실온에서 10 분 수정 솔루션 (PBS에 4 % 포름 알데히드) 1 ML에 수정. 주의 : 포름 알데히드는 독성이며 발암 가능성이 있습니다. 피부 접촉을 방지하기 위해 보호 장갑 및 의복을 착용하십시오. 참고 :이 부분에서는 다르게 표시되지 않는 한 어두운 곳에서 실온에서 nutator를 사용하여 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 수정 솔루션을 제거하고 버립니다. 조직을 1 mL의 PBT (0.3 % TritPBS 중 X-100)로 15 분씩 각각 3 회 세척한다. </li><li> PBT를 제거하고 실온에서 1 시간 동안 또는 4 ℃에서 밤새도록 블로킹하고 절식하기 위해 PBTG (PBT 중 0.2 % 소 혈청 알부민 및 5 % 정상 염소 혈청) 1 mL를 첨가한다. </li><li> PBTG를 제거하고 PBTG로 적절히 희석 한 1 차 항체 용액을 첨가하고 ( 재료 표 참조) 4 ° C에서 밤새 숙고시킨다. </li><li> 1 차 항체 용액을 제거하고 PBT 1 mL로 각각 15 분씩 세 번 세척하십시오. </li><li> PBT를 제거하고 PBTG (1 : 400)로 적절히 희석 한 2 차 항체 용액을 첨가한다. 실온에서 2 시간 동안 또는 4 ℃에서 밤새 누 ate다. </li><li> 2 차 항체 용액을 제거하고 각각 15 분 동안 PBT 1 mL로 조직을 두 번 씻는다. </li><li> F - 굴지를 얼룩이려면, PBT를 제거하고 PBS (1:40)에 적절히 희석 Phalloidin 솔루션을 추가합니다. 그런 다음 20 분 동안 타다. Phalloidin 용액을 제거하고 PBT 1 mL로 각각 15 분씩 두 번 세척하십시오. </li><li> 핵 DNA를 counterstain하려면 PBT를 제거하고 DAPI (4 &#39;, 6 - diamidino - 2 - phenylindole) 솔루션 (PBS에 0.5 μg / ML DAPI)을 추가합니다. 그런 다음 10 분간 타다. 주의 : DAPI는 발암 가능성이 있습니다. 피부 접촉을 방지하기 위해 보호 장갑 및 의복을 착용하십시오. </li><li> DAPI 용액을 제거하고 각각 15 분 동안 PBT 1 mL로 두 번 조직을 씻으십시오. </li><li> 실온에서 10 분 동안 PBS 1 mL에서 한번 씻어 낸다. </li><li> PBS를 제거하고 미리 장착 매체로 100 % 글리세롤 500 μL를 추가합니다. </li></ol> 4. 현미경 슬라이드에 장착 <ol><li> 2 ML 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 현미경 슬라이드에 스테인드 조직을 놓으십시오. </li><li> 집게와 다른 현미경 슬라이드에 장착 매체의 방울로 조직을 전송합니다. </li><li> 하나의 집게로 해부 조직의 끝을 잡고 다른 집게로 두뇌와 눈 antennal 디스크를 당겨. 참고 : 해부 된 뇌를 날개의 상상 디스크 근처에 두도록하십시오.. 두뇌는 coverslip가 날개 imaginal 원판을 분쇄하는 것을 막는 플래트 홈으로 작동합니다. </li><li> 날개 imaginal 디스크를 분리하기 위해 하나의 집게로 해부 조직의 끝을 누르고 부드럽게 몸 포획 벽을 긁고 다른 집게로 디스크를 찢습니다. 참고 : 날개가있는 상처 원판을 찾기가 어려우면 후방에서 앞쪽으로 기관을 떼어냅니다. 윙 상상의 원판은 기관에 붙어 있습니다. </li><li> 부드럽게 coverslip과 매니큐어와 인감으로 imaginal 디스크를 커버; 4 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 5. 공 초점 현미경 <ol><li> 발광 파장 범위의 레이저 강도, 게인, 오프셋, 주사 속도와 화상 사이즈 (24)를 포함하는 공 초점 레이저 주사 현미경으로 설정 화상 획득 파라미터를 이용하여 공 초점 화상을 취득. 참고 : 이미지 획득 설정에 대한 자세한 절차는 각 현미경 제조업체에서 제공하는 사용 설명서를 참조하십시오. </li><li> 단일 공동 촬영전체 날개 디스크의 초점이 맞지 않는 부분에 20X 대물 렌즈를 사용하십시오. </li><li> 40X 또는 60X 렌즈를 사용하여 0.5 - 1.0μm의 스텝 크기로 z 스택 스캐닝으로 3 차원 이미지를 획득하십시오. 참고 : 고해상도로 세포 표현형을 분석하려면 이미지 크기가 512 x 512 픽셀보다 커야합니다. </li></ol> 6. ImageJ를 이용한 이미지 분석 <ol><li> 공 촛점 z- 스택 이미지를 수집하고 분석하기 위해 생물 이미지 분석 (https://fiji.sc/) 25 에 초점을 맞춘 오픈 소스 ImageJ 소프트웨어 인 피지를 사용하십시오. </li><li> 수직 섹션을 얻으려면 ImageJ에서 z 스택 이미지를 열고 &quot;Image / Stacks / Reslice&quot;메뉴 항목을 선택하십시오. 참고 : Reslice 메뉴에서 XZ 축 또는 YZ 축을 선택할 수 있습니다. 수직 단면은 z- 스택 이미지에 직선이나 직사각형을 그리면 임의의 방향으로도 얻을 수 있습니다. </li></ol> 7. 종양의 진단 <ol><li> 수직을여십시오.하나의 세트의 z- 스택 이미지로부터 얻어진 단면 (XZ 또는 YZ 축)을 분석하고 형태 학적 표현형 및 항체 염색을 분석한다. </li><li> 종양 phenotypes의 진단을 위해, 주로 다음 세 가지 포인트에 초점을 맞추고 있습니다 : (1) 세포 덩어리 (knockdown clones 포함)가 주요 상피층에서 벗어나는 경우, (2) junctional 단백질의 세포 내 위치가이 세포 덩어리에서 변형되면 , 및 (3)이 세포 덩어리의 직경이 4 세포보다 큰 경우. </li><li> 그림 1에 설명 된 순서도에 따라 종양 표현형을 분류합니다. </li></ol>

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</ol>

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GAL4-UAS 시스템은 초파리 (26) 내의 표적 유전자의 발현을위한 가장 강력한 유전 적 도구이다 크게 생체 4 종양 세포 유도 분석을 용이하게한다. 이 시스템은 변형 된 종양 세포가 정상 상피 세포로 둘러싸인 인간 암의 초기 단계와 매우 유사한 상황 인 야생형 상피 조직 내 종양 억제 유전자의 knockdown 또는 종양 유전자의 과발현을 나타내는 클론의 생성을 가능하게한다. GAL4 인핸서 - 트랩 라인 또는 Janelia GAL4 라인 27 과 같은 인핸서 서열에 의해 조절되는 GAL4 드라이버 라인은 고유하고, 시공간적으로 제한된 발현 패턴을 갖는다. 따라서, 이러한 enhancer-GAL4 계통은 제한된 상피 원판에서 종양을 지속적으로 유도하는데 유용합니다. 본 연구에 제시된 sd-GAL4 및 upd-GAL4 이외에<...

상피 조직은 발달 및 세포 회전율을 통해 조직을 유지할 수있는 현저한 항상성을 지닌 고도로 조직화 된 시스템입니다. 그러나이 강력한자가 조직 시스템은 종양 발달 중에 점차적으로 혼란을 겪습니다. 종양 발달 초기에, 종양 유전자 활성화 또는 종양 억제 유전자 불 활성화로 인해 발생하는 개개의 돌연변이 세포가 상피층 내에서 출현한다. 이 형질 전환 된 &quot;종양 세포&quot;가 억제 환경을 피하고, 상피 조직을 파괴하고, 제어되지 않은 증식을 시작할 때, 종양 형성이 발생합니다 1 . 지난 수십 년 동안 유전학 및 분자 생물학 분야의 탁월한 기술 발전은 암 연구에서 눈부신 발전을 이루었습니다. 특히, FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase 표적) 유사 분열 재조합과 같은 Drosophila melanogaster 에서 유 전적으로 모자이크 분석 도구를 사용한 최근의 연구2 및 플립 - GAL4 - UAS (업스트림 활성화 시퀀스) 시스템 3 , 종양의 형성과 전이에 관련된 유전자 메커니즘을 이해하는 데 크게 기여했습니다 4 , 5 , 6 . 치명적인 자이언트 애벌레 ( lgl ), 큰 디스크 ( dlg ) 및 낙서 ( scribble )와 같은 보존 된 Drosophila 종양 억제 유전자 그룹에 대한 연구는 상피 조직 손실과 종양 발달 사이의 중요한 관계를 강조했습니다. apical-basal cell의 극성과 상피 조직에서의 세포 증식의 조절 7 . Drosophila imaginal disc는 일반적으로 단층 상피 세포이지만,이 3 가지 유전자 중 homozygous 돌연변이는 세포가 구조와 극성을 잃게하고,overproliferate, rentiate 궁극적 인접 조직 7 융합 다층 비정질 덩어리를 형성한다. 마찬가지로, 포유 동물에서 이들 유전자의 파괴는 악성 종양의 발병과 관련이있다 8 , 9 . 돌연변이 조직에 의해 나타나는 종양 표현형은 보존, 종양 종양 억제 유전자 (nTSGs)와 같은 세 가지 유전자의 분류 7, 8로 이어졌다. 그러나 homozygous nTSG 돌연변이 세포가 FLP-FRT 매개 성의 유사 분열 재조합을 사용하여 야생 형 상상 원판을 개발할 때 산발적으로 생성되면 c-Jun N-terminal kinase (JNK) 의존성 세포 사멸을 통해 돌연변이 세포가 조직에서 제거됩니다 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 압출 15 </sup&gt; , 16 , 또는 이물질에 의한 황산 화 및 식균 작용 17 . 이 유 전적으로 모자이크 상피 세포에서는 세포 경계가 클로닝 경계에 위치한 nTSG 돌연변이 세포에서 주로 검출되며, 이는 인접한 정상 세포가 nTSG 돌연변이 세포의 세포 사멸을 유발한다는 것을 의미합니다. 10 , 11 , 12 , 18 . 포유 동물 세포에 대한 최근의 연구에 따르면 전구 세포 종양 세포의이 세포 경쟁 의존적 제거가 암에 대한 진화 적으로 보존 된 상피 세포 방어 기작임을 확인했다 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . 그러나 Drosophila imaginal discs에 대한 최근 연구에서 모자이크 nTSG-knockdown clone은 종양의 종양을 특이 적으로 유도한다는 것을 보여 주었다날개의 상상의 디스크의 IC 영역 16 . 초기 종양 형성은 말초 &quot;힌지&quot;영역에서 항상 발견되었고 날개 디스크 상피의 중앙 &quot;파우치 (pouch)&quot;영역에서는 관찰되지 않았으며, 이는 nTSG- 녹다운 세포의 종양 형성 잠재력이 국소 환경에 의존한다는 것을 암시한다. 중앙 파우치 지역은 전립선 종양 세포가 이형성 과증식을 나타내지 않는 반면 말초 경첩 부위는 &quot;종양 핫스팟&quot; 16 처럼 행동하는 &quot;종양 냉점&quot;으로 기능합니다. &quot;coldspot&quot;파우치 영역에서 nTSG- 녹다운 세포는 기저부로부터 박리되어 세포 사멸을 겪습니다. 대조적으로 &quot;핫스팟&quot;힌지 셀들이 기저 측면에 견고한 골격 구조의 네트워크를 갖고, nTSG-녹다운 세포는 상피의 선단 측으로부터 박리 및 발암 성 과증식 (16)을 시작. 따라서, 상상의 디스크에서 종양 phenotypes의 분석은주의 consin 필요합니다종양 형성 자극에 대한 부위 특이 적 감수성의 저하. 여기, 우리는 정상 날개 디스크 상피에서 nTSG - knockdown 세포가 생성되는 GAL4 - UAS - RNAi 시스템을 활용하여 초파리 날개 imaginal 디스크에 종양 형성을 유도하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 실험 시스템이 암의 초기 단계를 연구하는 데 유용하지만 상상 디스크 상피 세포에서 종양 진행 단계를 평가하는 명확한 분류 방법은 이전에 명확하게 설명되지 않았습니다. 따라서 우리는 또한 날개 원발성 상피 세포에서 유래 된 전 종양의 클론 성 표현형을 3 가지 범주로 분류하는 진단 방법을 제안한다 : 증식 (증가 된 증식으로 정상 출현하는 세포의 과도한 수의 축적), 이형성증 (비정상적으로 나타나는 전암 조직 세포) 및 신 생물 (비정상적인 모양 및 비정상적인 증식 패턴을 갖는 세포로 구성된 양성 또는 악성 종양).

<table><tbody><tr><td><강>시약</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충식염수(PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>장착 매체, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>mouse-anti-Dlg 4F3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td><td>PBTG에 희석, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 혼합 1:1:1 및 PBTG에 희석, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-atubulin</td><td>Developmental 연구 Hybridoma Bank</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>PBTG에 희석, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Molecular probes</td><td>A22283</td><td>PBS에 희석, 1:40</td></tr><tr><td>염소 항-마우스 IgG 항체, Alexa Fluor 546</td><td>Molecular probes</td><td>A11030</td><td>PBTG에 희석, 1:400</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fly strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>recombined with UAS-EGFP</td></tr><tr><td>em<>upd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-lgl-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>UAS-scrib-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>UAS-RasV12</td><td>와 재결합블루밍턴 초파리 재고 센터</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>UAS-Yki3SA</td><td>블루밍턴 초파리 재고 센터</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>hsFLP</td><td>Bloomington Drosophila 재고 센터</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>Act>CD2>GAL4 (플립아웃 GAL4)</td><td>블루밍턴 초파리 스톡 센터</td><td>#4780</td><td>UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>X chromosome</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>세 번째 염색</td></tr>체<tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24650</td><td>두 번째 염색체</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24651</td><td>세 번째 염색체</td></tr><tr><td>vkg-GFP</td><td>Morin et al. 2001</td><td></td><td>GFP protein trap</td></tr></tbody></table>

종양의 유도 및 진단<em&gt; drosophila</em&gt; 상피 디스크 상피 세포

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

암의 초기 단계에서, 형질 전환 된 돌연변이 세포는 세포 학적 이상을 보이고 통제되지 않은 과증식을 시작하며 점차적으로 조직 구성을 붕괴시킵니다. Drosophila melanogaster 는 종양 형성의 유전 및 세포 메커니즘을 연구하기 위해 암 생물학에서 대중적인 실험 모델 시스템으로 부상했습니다. 특히 Drosophila imaginal disc (애벌레의 상피 형성)를위한 유전 도구는 인간 상피 세포의 초기 단계와 유사한 상황 인 정상 상피 조직 내에서 형질 전환 된 종양 세포의 생성을 가능하게합니다. 그러나 Drosophila wing imaginal disc의 종양 발생에 관한 최근의 연구에 따르면, 종양 발생은 조직 고유의 세포 구조와 국소 미세 환경에 달려있어 상상적으로 종양 표현형을 평가할 때 종양 형성 자극에 대한 영역 특이성 감수성을 고려하는 것이 중요하다는 것을 알 수있다 디스크. 종양 진행의 표현형 분석을 용이하게하기 위해GAL4-UAS 시스템을 이용하여 날개 상상 디스크에서 종 양성 종양을 유도하는 유전자 실험 프로토콜을 설명합니다. 우리는 상피 성 상피에서 유도 된 클론 병변의 표현형을 분류하기위한 진단 방법을 소개한다. 종양 진행의 다양한 단계 (과형성, 이형성증, 신 생물 등)를 구분하기위한 분명한 분류 방법은 이전에 기술되지 않았다. 이러한 방법은 Drosophila의 여러 기관에서 종양 phenotypes의 클론 분석에 널리 적용 할 수 있습니다.

Drosophila wing imaginal disc에서 RNAi 매개 된 nTSG-knockdown에 의해 실험적으로 유도 된 종 양성 종양을 확인하기 위해 3 가지 다른 GAL4 드라이버를 사용하여 lgl 또는 scrib에 대한 UAS-RNAi 를 발현 시켰다 : (1) sd-GAL4 . 힌지 영역 ( 그림 2 및 그림 3A )에서 날개 파우치 및 마일드 표현. (2) 등 지느러미 내측 배의 두 영역에서 강력한 발현, 하나의 앞쪽 - 외측 영역에서의 약한 발현 및 복부 - 뒤쪽 도메인에서의 약한 발현을 포함하여 힌지의 하위 도메인을 유도하는 upd-GAL4 ( 도 2</strong...

Drosophila imaginal disc epithelia의 모자이크 클론 분석은 종양 형성의 유전 및 세포 메커니즘을 연구하는 강력한 모델 시스템입니다. 여기에서는 GAL4-UAS 시스템을 사용하여 Drosophila wing imaginal discs에서 종양을 유도하는 프로토콜을 설명하고 종양 표현형을 분류하는 진단 방법을 소개합니다.

종양의 유도 및 진단<em&gt; Drosophila</em&gt; 상피 디스크 상피 세포

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 초파리(Drosophila)의 성충원판(imaginal discs)에서 종양원성 모자이크 클론을 생성하고, 생성된 클론 병변을 종양 발달의 다양한 단계로 분류하는 것입니다. 이 방법은 종양을 일관되게 유도하는 방법과 진행 단계를 분류하는 방법과 같이 암 모델링의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 Drosophila 날개 성충판에 종양을 주입하는 과정이 단순한 초파리 유전학을 통해 이루어지며, 종양 발달 단계의 분류가 간단한 진단으로 가능하다는 점입니다. 절차 시연을 위해 제 연구실의 기술자인 Kimiko Morimoto가 Kenta Morimoto와 함께할 것입니다. 먼저 유전적 교배 설정을 시작하십시오.교배용 처녀 파리를 수집하기 12시간 전에, 성숙한 번데기가 들어 있는 바이알에서 모든 성체 파리를 제거하십시오. 다음 날, 유전적 모자이크 자손을 생성하기 위한 교배를 설정합니다. 처녀 파리 12~20마리와 수컷 10마리를 새 바이알로 옮기고, 25 °C에서 하루 동안 배양하십시오.24시간 후, 파리들을 새 바이알로 옮기고 처음에 사용했던 바이알은 폐기합니다. 이후 12시간이 더 지나면 알을 얻을 수 있습니다. 12시간 간격으로 성충을 새 바이알로 옮겨주고, 생성된 자손을 실험에 사용합니다.알이 든 바이알을 25°C에서 2~4일 동안 배양한 후, flip-out GAL4에 의한 모자이크 클론 유도를 위해 37°C 항온수조를 사용하여 유충에 10~45분간 열충격을 줍니다. 발달 2일 차에 열충격을 주면 미성숙한 디스크에서 클론이 생성됩니다. 발달 3~4일 차에 열충격을 주면 더 후기 단계의 디스크에서 클론이 생성됩니다.열충격 처리 후, 3령 유충을 사용할 수 있을 때까지 바이알을 25°C 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 먼저, 나무 막대나 끝이 뭉툭한 포셉을 사용하여 배회하는 3령 유충을 PBS가 담긴 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음, 형광등 아래에서 유전형 분석을 수행하여 모자이크 유충에 적합한 형광 마커를 확인합니다.진행하기 전, 유충을 PBS로 세척하십시오. 그런 다음 해부 현미경 하에서 두 쌍의 핀셋을 사용하여 유충의 중앙을 집고, 몸통을 반으로 찢으십시오. 다음으로, 입을 몸쪽으로 밀면서 입 갈고리(mouth hooks)를 집어 몸통을 뒤집으십시오.그 다음, 침샘과 지방체와 같은 불필요한 조직을 제거합니다. 이제 유충은 고

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 프로토콜은 3 instar 단계에서 drosophila의 유충에서 imaginal 디스크를 분리에 사용되는 절개 기법을 보여줍니다. 말하는 후 조직을 고정하고 날개, 다리와 눈 디스크를 제거하는 방법은 직접 이후 시각화를위한 현미경 슬라이드에 시연하고 있습니다.

셋째 Instar Drosophila의 유충에서 Imaginal 디스크의 해부

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Drosophila Pupal의 복부 Immunohistochemistry

초파리 상상 디스크를 염색할 때, 디스크가 노출되어 있지만 몸에 붙어 있는 부분을 거칠게 해부하는 경우가 많습니다. 염색이 완료되면 관심 디스크가 분리되어 장착됩니다. 예제 프로토콜은 날개 상상 디스크 해부 및 장착 절차를 보여줍니다.

초파리 유충 상상 디스크 해부: 상피 발달을 관찰하는 방법

RAS V12 및 남겼, 종양 세포는 또한 침략적인 행동을 표시 초파리에있는 종양의 성장 결과와 같은 세포 극성 유전자의 돌연변이와 같은 활성화 된 발암 유전자 간의 협력. 여기에 양성 및 침입 종양의 유도 및 관찰을위한 간단한 프로토콜을 제시한다.

의 두부 컴플렉스 유전 유도하고 양성 및 침윤성 종양의 시각화를위한 프로토콜<em&gt; 초파리</em

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

여기에서는 초파리 위장 형성의 실시간 이미지를 캡처하는 절차를 설명합니다. 이를 통해 초기 발달과 관련된 정점 수축을 더 잘 이해하고 조직 구조 변형 중 세포 움직임을 제어하는 메커니즘을 더 자세히 분석할 수 있었습니다.

셀 모양 변경 허가 및 세포 운동에서의 영상 초파리 낭배 사용 DE-cadherin의 기자 형질 전환의 파리

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

우리는 GFP 재구성 기반 접근법을 사용하여 살아있는 초파리 날개 상상 디스크의 인접한 상피층에 있는 세포 간의 접촉을 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

살아있는 초파리 날개 상상 디스크에서 사이톤군에 의해 매개되는 세포-세포 접촉을 평가하기 위한 GFP 상보 기반 이중 발현 시스템

이 글에서는 시약을 경제적으로 사용하고 소수의 상상 디스크를 쉽게 다룰 수 있는 효율적인 상상 디스크 해부 및 항체 염색 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila melanogaster의 눈-더듬이 및 날개 상상 디스크의 소규모 해부 및 항체 염색

배우세요 Drosophila 상피 디스크에서 GAL4-UAS 시스템을 활용한 종양 유도 및 단계별 분류 방법을. 이 프로토콜은 암 연구를 위한 신뢰할 수 있는 모델을 제공합니다.

종양의 유도 및 진단

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