Name: 펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 배우세요 펩티드 마이크로어레이를 활용한 히스톤 항체 특이성 프로파일링 방법을. 이 통합 파이프라인은 크로마틴 생화학 및 후성유전학 연구에서 항체 품질 관리와 특이성 분석에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 반 안델 연구소 (Van Andel Research Institute)와 국립 보건원 (CA181343)에서 SBR

저자는 공개 할 것이 없습니다.

생물 의학 연구 분야의 항체 신뢰도가 가장 중요합니다 46 , 47 . 이것은 히스톤 PTM의 풍부성과 분포를 특성화하기 위해 개발 된 대부분의 기술에 대한 핵심 도구로서 항체의 위치를 ​​고려할 때 염색질 생화학에서 특히 그렇습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 히스톤 PTM 항체 특이성을 분석하기위한 펩타이드 마이크로 어레이의 설계, 제조 및 사용을위한 최적화 된 파이프 라인을 상세히 설명합니다. 이 파이프 라인은 상업적으로 이용 가능하고 널리 사용되는 히스톤 PTM 항체의 큰 숫자를 선별하는 데 사용되었으며,이 실험에서 생성 된 데이터는 온라인 및 확장 히스톤 항체 특이성 데이터베이스 (www.histoneantibodies.com) (17)를 통해 자유롭게 사용할 수 있습니다. 우리와 다른 사람들의 연구에서 명백한 것은 his...

게놈 DNA는 히스톤 단백질이있는 진핵 세포 핵 내부에 우아하게 포장되어 염색질을 형성합니다. 염색질의 반복적 인 아 단위는 히스톤 단백질 (H2A, H2B, H3 및 H4 1) 의 8 량체 핵 주위에 감싸 진 147 염기쌍의 DNA로 구성된 뉴 소솜 (nucleosome)이다. 크로마 틴은 느슨하게 패킹 된 진균 염색체와 단단히 채워진 헤테로 크로마 틴 도메인으로 광범위하게 구성됩니다. 염색질 압축 정도는 단백질 기계가 복제, 전사 및 수리와 같은 기본적인 DNA 템플릿 공정을 수행하기 위해 기본 DNA에 접근 할 수있는 정도를 조절합니다. 염색체의 맥락에서 게놈 접근성의 주요 조절 인자는 히스톤 단백질 2 , 3 의 구조화되지 않은 꼬리와 핵심 부위의 PTM입니다. 히스톤 PTM은 염색질 4 의 구조에 직접적으로 영향을 미치고 간접적으로 기능합니다.염색질 개질, 효소 및 스캐 폴딩 활동을하는 독자 단백질 및 관련 거대 분자 복합체의 모집 5 . 지난 20 년간 히스톤 PTM 기능에 대한 연구는 세포의 운명, 유기체 발달 및 질병의 시작 / 진행을 조절하는 데 중요한 역할을한다는 것을 압도적으로 제안합니다. 질량 분석 기반 단백체 기술의 발전에 힘 입어, 80 명 이상의 서로 다른 히스톤 잔류 물에 20 개 이상의 고유 한 히스톤 PTMS는 6 발견되었다. 주목할 만하게,이 수정은 수시로 조합에서 생기고, &quot;히스톤 부호&quot;가설과 일치하여, 수많은 학문은 독자 단백질이 히스톤 PTMs의 특정한 조합의 승인을 통해 염색질의 불연속 지역에 표적으로 한 ㄴ다는 것을 건의한다 7 , 8 , 9 . 앞으로 나아갈 핵심 과제는 gr에 함수를 할당하는 것입니다.히스톤 PTM의 목록을 작성하고 히스톤 PTM의 특정 조합이 염색질과 관련된 동적 기능을 조율하는 방법을 결정할 수 있습니다. 항체는 히스톤 PTM의 검출을위한 lynchpin 시약입니다. 이와 같이, 염색질 생화학 연구에 사용하기 위해 1,000 개 이상의 히스톤 PTM 특이 적 항체가 상업적으로 개발되었습니다. 고효율 DNA 시퀀싱 기술의 급속한 발전으로이 시약은 ChIP-seq (염색질 면역 침전 및 차세대 시퀀싱)에서 개별 조사자와 대규모 후성 유전체학 &quot;로드맵&quot;이니셔티브 ( 예 : ENCODE 및 BLUEPRINT)에 광범위하게 사용되고 있습니다 ) 파이프 라인은 히스톤 PTM 분포 게놈 전체의 고해상도 공간 맵을 생성합니다 10 , 11 . 그러나 최근의 연구에 따르면 히스톤 PTM 항체의 특이성은 매우 다양 할 수 있으며 이러한 시약은 unfones<html> 오프 - 타겟 에피토프 인식, 이웃 PTM에 의한 강한 긍정 및 부정적인 영향, 특정 잔기 ( 예 : 모노 -, 디 - 또는 트리 - 메틸 리신)의 변형 순서 식별 어려움과 같은 유용한 특성 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . 따라서 히스톤 PTM 특이 적 항체 시약의 엄격한 품질 관리가 이러한 유용한 시약으로 생성 된 데이터를 정확하게 해석하는 데 필요합니다. Microarray 기술은 높은 처리량, 재현성 및 소형화 된 포맷으로 수천 개의 거대 분자 상호 작용을 동시에 조사 할 수있게합니다. 이러한 이유로, 단백질 -DNA 19 을 분석하기 위해 다양한 마이크로 어레이 플랫폼이 만들어졌으며 ,&quot;&gt; (20), 단백질 - 단백질 21 단백질 펩타이드의 상호 작용 (22). 실제로, 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이는 작가, 지우개의 높은 처리량 프로파일 링을 가능하게 염색질 생화학 연구에 대한 정보를 검색 플랫폼으로 등장, 그리고 히스톤의 독자 PTMS 15있다 , 23, 24, 또한 히스톤 항체 특이성의 분석을 위해 17, 25. 염색질과 후성 유전학 연구에 자신의 응용 프로그램을 넘어, 히스톤 펩타이드 배열은 전신성 홍 반성 루푸스 등의자가 면역 질환에 대한 진단 / 예후 테스트 잠재적 인 유틸리티가 어디 방지 염색질자가 항체가 생성됩니다 26 , 27 . 여기서는 설계, 제작 및 큐를 위해 개발 한 통합 파이프 라인을 설명합니다.히스톤 및 그 PTM을 인식하는 항체에 대한 특이성 프로파일을 생성하기 위해 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이를 제조한다. 파이프 라인은 ArrayNinja, 마이크로 어레이 실험 (28)의 설계 및 분석 단계를 통합하는 오픈 소스, 우리는 최근에 개발 된 대화 형 소프트웨어 응용 프로그램에 의해 촉진된다. ArrayNinja는 Google 크롬에서 가장 잘 작동합니다. 간단히 말하면, 로봇 접촉 마이크로 어레이 프린터를 사용하여 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 유리 현미경 슬라이드상의 한정된 위치에 비오틴 - 컨쥬 게이트 된 히스톤 펩타이드의 라이브러리를 침착시킨다. 그런 다음 항체 - 항원 결정기 상호 작용을 조사하기 위해 경쟁적이고 평행 한 분석 형식으로 배열을 사용할 수 있습니다 ( 그림 1 ). 펩타이드 라이브러리는 PTM (라이신 아세틸 화, 라이신 / 아르기닌 메틸화, 및 세린 / 트레오닌 인산화)이있는 수백 가지의 독특한 합성 펩타이드와 프로테오믹스 데이터 세트에서 주로 유래 된 적절한 조합으로 구성됩니다. 펩타이드 합성 및 검증 방법<html> 다른 곳에서 (23)에 자세히 설명되어 있습니다. 이 어레이 플랫폼을 사용하는 진행중인 히스톤 PTM 항체 스크리닝 작업에서 생성 된 데이터는 공개 웹 리소스 인 Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com)에 보관됩니다. 특히,이 프로토콜의 변형으로 제작 된 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이는 히스톤 PTM 판독기 도메인 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 의 활성을 특성화하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. PTM 작성자 및 지우개 활동 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이에서 항체 스크리닝을위한 Stepwise 절차의 카툰 묘사. 정의 된 번역 후 변형 (적색 및 청색 원)을 갖는 비 오티 닐화 히스톤 펩타이드는 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 유리상에 바이오틴 - 플루오 레세 인과 함께 인쇄된다. 양성 상호 작용은 적색 형광으로 시각화됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>인쇄 버퍼</td><td>ArrayIt</td><td>PPB</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Omnipure</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-coated glass microscope slides</td><td>Greiner Bio-one</td><td>439003-25</td><td></td></tr><tr><td>polypropylene 384 well plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-fluorescein</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td></td></tr><tr><td>contact microarray printer</td><td>Aushon</td><td>2470</td><td>Aushon 2470 Microarray 프린터</td></tr><tr><td>접촉 microarray 프린터</td><td>유전자 기계</td><td>OmniGrid 100</td><td>OmniGrid Microarray 프린터</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>차단 버퍼</td><td>어레이It</td><td>SBB</td><td></td></tr><tr><td>소수성 왁스 펜</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge 소수성 장벽 PAP 펜</td></tr><tr><td>실리콘 개스킷</td><td>Grace Bio-labs</td><td>622511</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Vessel</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td>또는 이와 유사한 vessel</td></tr><tr><td>형광 염료 접합 2차 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A-21244</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td></tr><tr><td>형광 염료 접합 2차 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A-21235</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td></tr><tr><td>왁스 Imprinter</td><td>ArrayIt</td><td>MSI48</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Omnipure</td><td>9490</td><td></td></tr><tr><td>마이크로어레이 스캐너</td><td>Innopsys</td><td>InnoScan 1100AL</td><td>또는 동급 마이크로어레이 스캐너</td></tr><tr><td>EipTitan 히스톤 펩타이드 마이크로어레이</td><td>에피시퍼</td><td>112001</td><td></td></tr><tr><td>AbSurance Pro 히스톤 펩타이드 마이크로어레이</td><td>Millipore</td><td>16668</td><td></td></tr><tr><td>MODified 히스톤 펩타이드 어레이</td><td>활성 모티프</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>히스톤 코드 펩타이드 마이크로 어레이</td><td>JPT</td><td>His_MA_01</td><td></td></tr><tr><td>왁스</td><td>로얄 오크</td><td>걸프 왁</td>스 <td>임프린터</td></tr><tr><td>용 왁스 가습 마이크로 어레이 슬라이드 혼성화 챔버</td><td>VWR</td><td>97000-284</td><td></td></tr><tr><td>고 처리량 현미경 슬라이드 세척 챔버</td><td>ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 원심분리기</td><td>VWR</td><td>93000-204</td><td></td></tr><tr><td>항체 1</td><td>Abcam</td><td>8898</td><td></td></tr><tr><td>항체 2</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 히스톤 펩타이드</td><td>EpiCypher</td><td>12-0001</td><td>펩타이드 예. 다양한 변형을 가진 유사한 펩타이드는 여러 상업적 출처에서 구할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>ImageMagick</td><td></td><td></td><td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td></tr><tr><td>ArrayNinja</td><td></td><td></td><td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td></tr></tbody></table>

펩티드 microarrays를 가진 histone 항체 특이성의 분석

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

히스톤 단백질에 대한 번역 후 변형 (PTMs)은 염색질 구조 및 유전자 발현 조절에서의 역할에 대해 널리 연구되고있다. 히스톤 PTM에 특이적인 항체의 대량 생산 및 분포는 이러한 표지에 대한 연구를 크게 촉진시켰다. 히스톤 PTM 항체는 많은 염색질 생화학 분야의 주요 시약이기 때문에 항체 특이성의 엄격한 분석이 정확한 데이터 해석과 현장에서의 지속적인 진보에 필요합니다. 이 프로토콜은 히스톤 항체의 특이성을 프로파일 링하기위한 펩타이드 마이크로 어레이의 설계, 제조 및 사용을위한 통합 파이프 라인을 설명합니다. 이 절차의 설계 및 분석 측면은 Microarray 인쇄 형식의 사용자 정의를 간소화하기 위해 최근 개발 한 오픈 소스 및 대화 형 소프트웨어 패키지 인 ArrayNinja를 사용하여 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이 파이프 라인은 상업적으로 이용되고 널리 사용되고있는 히스톤 PTM 항체이 실험에서 생성 된 데이터는 온라인 및 확장 Histone Antibody Specificity Database를 통해 자유롭게 사용할 수 있습니다. 히스톤을 넘어, 여기에 기술 된 일반적인 방법론은 PTM 특이 적 항체의 분석에 광범위하게 적용될 수 있습니다.

이 프로토콜은 히스톤 PTM 항체 특이성의 분석을위한 펩타이드 마이크로 어레이 플랫폼을 설계하고 제조하는데 사용되었습니다. 이 어레이는 핵심 및 변형 히스톤 단백질에서 발견되는 PTM의 많은 조합을 나타내는 300 개 이상의 고유 한 펩타이드 기능 (20-40 잔기 길이) 라이브러리를 조회합니다 38 . 이 파이프 라인은 널리 사용되고 상업적으로 이용 가능한 많은 히스톤 PTM 항체의 스크리닝을위한 작업 원이었으며, 전체 데이터 세트는 Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com)에서 이용할 수 있습니다. 17 세 우리의 파이프 라인의 백본 ArrayNinja, 마이크로 어레이 작업 <sup class="...

이 원고는 히스톤 및 그 번역 후 변형을 인식하는 항체의 특이성 프로파일 링에 펩타이드 마이크로 어레이 기술을 적용하는 방법을 설명합니다.

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

본 영상의 목적은 히스톤 항체의 특이성을 프로파일링하기 위한 펩타이드 마이크로어레이의 설계, 제작 및 사용을 위한 통합 파이프라인을 설명하는 것입니다. 히스톤과 그 다양한 번역 후 수정을 인식하는 항체는 염색질 생화학 연구의 핵심 시약입니다. 우리는 히스톤 수정 기능에 대한 이해를 넓히기 위해 이러한 도구들에 의존하고 있습니다.최근 연구들에 따르면 히스톤 항체의 거동에서 불일치하는 사례들이 나타나고 있습니다. 항체 선택은 후성유전학 실험에서 가장 중요한 요소이므로, 이러한 시약들에 대해 철저하고 포괄적인 품질 관리 조치가 요구됩니다. 본 연구에서는 히스톤 및 그 번역 후 수식(post-translational modifications)을 인식하는 항체들의 특이성 프로파일을 생성하기 위해, 펩타이드 마이크로어레이를 설계, 제작 및 분석하도록 개발한 통합 파이프라인을 제시합니다.이 파이프라인은 우리가 개발한 오픈 소스 대화형 소프트웨어 애플리케이션인 Array Ninja를 통해 촉진되며, 이는 마이크로어레이 실험의 설계 및 분석 단계를 통합합니다. 어레이 슬라이드 설계를 시작하려면, '슬라이드 레이아웃 계획(plan a slide layout)' 항목 아래에서 사용할 마이크로어레이 프린터를 선택하십시오. 그런 다음, '플레이트 로드(load plate)' 필드에 'empty'를 입력하고 엔터를 누르십시오.스팟 직경을 275 micrometers로, 스팟 간격을 100 micrometers로 설정하십시오. 실험에 맞게 나머지 파라미터를 적절히 입력하여 레이아웃에 충분한 반복 수가 확보되도록 하십시오. 생성된 레이아웃 미리보기 화면에서 슬라이드 상의 각 고유 펩타이드 피처 위에 마우스를 올린 후, 팝업 텍스트 상자에 피처 식별자를 입력하십시오.각 고유 특징(feature)의 라벨링이 완료되면 populate를 클릭합니다. 슬라이드 레이아웃의 이름을 지정한 다음, commit your plate를 클릭하여 레이아웃을 저장하고 소스 플레이트의 각 특징의 물리적 위치에 따른 맵을 생성합니다. 소스 플레이트 맵에 따라, 각 펩타이드 특징을 1~2 µL씩 하나 이상의 384-well 소량 플레이트의 지정된 well에 로드하고, 1% bovine serum albumin과 5 µg/µL fluorescin labeled biotin이 첨가된 1x protein microarray printing buffer로 각 특징을 10배 희석합니다.그런 다음, 플레이트를 상온에서 500 x G로 2분간 원심분리합니다. 이어서, 마이크로어레이 프린터의 폐액 컨테이너를 비웁니다. 가습기 컨테이너에 담긴 세척액을 멸균 증류수로 채웁니다.마이크로어레이 프린터 소프트웨어에 어레이 슬라이드 파라미터를 입력합니다. 세척 절차는 단일 침지 방식의 1초 세척으로 설정하고, 후세척은 핀을 5회 재침지하도록 설정하며, 습도는 60%로 설정합니다. 그런 다음, 코팅된 유리 슬라이드를 기판 플래티넘에 삽입합니다. 플래티넘을 플래티넘 엘리베이터에 로드합니다.소스 플레이트를 플레이트 홀더에 삽입하고 홀더를 소스 플레이트 엘리베이터에 로드합니다. 프린팅 과정을 실행한 다음, 기기에서 기판 플래티넘을 꺼냅니다. 흔들어 주면서 1x protein microarray blocking buffer로 프린팅된 슬라이드를 30분 동안 블로킹합니다.그 다음, 실온의 pH 7.6 인산염 완충 식염수(PBS)에서 슬라이드를 10분 동안 세척합니다. 새 PBS를 사용하여 세척 과정을 반복합니다. 실온에서 30초 동안 원심분리하여 슬라이드를 건조합니다.다음으로, 마이크로어레이 왁스 임프린터를 85 °C에서 30분 동안 또는 왁스가 녹을 때까지 예열합니다. 그런 다음, 슬라이드의 프린트된 면이 아래로 향하게 하여 홀더에 삽입하고 홀더를 임프린터 몰드에 맞춥니다. 몰드를 슬라이드에 접촉시킨 상태로 2초 동안 유지한 후, 슬라이드를 홀더에서 빠르게 제거하고 왁스 경계선을 검사하여 어레이가 적절하게 밀폐되었는지 확인합니다.분할된 슬라이드를 4°C의 건조하고 어두운 곳에 보관하십시오. 하이브리드화 절차를 시작하려면, 분할된 어레이 슬라이드를 플라스틱 접시에 넣고 하이브리드화 버퍼로 슬라이드를 덮습니다. 저속으로 흔들어주며 4°C에서 30분 동안 슬라이드를 평형화하십시오.실온에서 마이크로어레이 슬라이드 원심분리기로 슬라이드를 건조하십시오. 그런 다음, 각 히스톤 PTM 항체 용액 5 µL를 어레이의 최소 두 개 웰에 첨가하고 4 °C에서 1시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 항체 용액을 제거하고 차가운 PBS로 어레이를 4 °C에서 5분씩 3회 세척하십시오.다음으로, 어레이를 형광 염료가 접합된 2차 항체 용액에서 배양합니다. 빛이 없는 상태에서 4°C로 30분 동안 진행합니다. 이전과 마찬가지로 차가운 PBS로 슬라이드를 세 번 세척합니다.배열을 실온의 0.1x PBS에 담가 과잉 염분을 제거하고, 실온에서 짧게 원심 분리하여 슬라이드를 건조합니다. 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 최소 25 microns의 해상도로 슬라이드를 이미지화합니다. 분석을 시작하려면 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 마이크로어레이 스캐너에서 얻은 단일 채널 파일들을 병합합니다.그 다음, Array Ninja를 열고 이미지 정량화(quantify images) 헤더 아래에서 적절한 마이크로어레이 프린터를 선택하십시오. 플레이트 로드(load plate) 대화 상자에 동일한 슬라이드 레이아웃의 이름을 입력하고 엔터를 누르십시오. 병합된 이미지 파일을 불러온 후, 원하는 대로 대비, 밝기 및 중간값을 조정하십시오.어레이 스캐너 해상도를 입력하고, 슬라이드 레이아웃 그리드가 이미지와 일치하도록 상단 및 측면 여백을 조정하십시오. 일련의 웰을 반복 실험군으로 분석하거나 다른 선택적 분석을 수행하려면 iPin, jPin 및 subA 필드에 웰 좌표를 입력하고 엔터를 누르십시오. 줌 기능을 토글하여 커서 아래 영역의 확대 이미지를 표시하십시오.그런 다음, spot seek를 클릭하고 프로세스가 완료될 때까지 기다립니다. 그리드 원이 어레이 스폿의 중심에 오도록 필요에 따라 seek 기능을 반복합니다. R 키를 눌러 참조 스폿을 선택할 수 있으며, 찌꺼기가 보이거나 형태가 너무 넓은 스폿은 해당 스폿 위에 마우스를 올린 상태에서 A 키를 눌러 비활성화할 수 있습니다.배경 참조 스팟(background reference spots) 선택을 완료하고, 기공 형태의 변형이나 오염이 있는 스팟을 비활성화한 후, populate를 클릭하고 이어서 submit을 클릭하여 정량을 수행합니다. 새로운 페이지에 막대 그래프와 표가 표시됩니다. 이 방법을 사용하여 두 가지 히스톤 PTM 항체의 결합 특이성을 평가하였습니다.히스톤 H3의 9번 라이신 트리메틸화를 표적으로 설계된 히스톤 PTM 항체가 다른 세 개의 트리메틸화 라이신 그룹과도 결합하는 것으로 나타났습니다. 인접한 라이신 잔기의 실릴화가 H3의 9번 라이신 표적화에 긍정적인 영향을 미치는 것이 관찰되었습니다. 히스톤 H3의 4번 라이신 트리메틸화를 표적으로 하는 히스톤 PTM 항체는 H3의 단일 메틸화 및 디메틸화 라이신 4와도 상호작용하는 것으로 나타났습니다. 본 분석에서 인접한 6번 아닌의 인산화는 4번 라이신의 결합에 부정적인 영향을 미치는 것으로 관찰되었습니다.이 파이프라인은 시중에서 가장 널리 사용되는 상용 히스톤 항체들을 스크리닝하는 데 사용되었으며, 이 실험을 통해 생성된 데이터는 히스톤 항체 특이성 데이터베이스를 통해 자유롭게 이용 가능합니다. 히스톤 리더(reader), 라이터(writer) 및 이레이저(eraser) 분석을 위한 이 파이프라인의 변형 방법이 이전에 설명된 바 있으며, 이러한 플랫폼을 수정함으로써 후성유전학 연구 외에도 관심 있는 모든 프린터블 라이브러리에 쉽게 적용할 수 있습니다. 펩타이드를 합성하고 어레이를 제작하는 데 필요한 전문 장비를 갖추지 못한 사용자를 위해 여러 히스톤 펩타이드 마이크로어레이 플랫폼이 상업적으로 제공되고 있습니다.

analysis-of-histone-antibody-specificity-with-peptide-microarrays

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

이 비디오는 펩타이드 마이크로어레이 기술을 적용하여 히스톤 펩타이드에 대한 PTM(Post-Translational Modification)을 인식하는 항체의 특이성을 프로파일링하는 기술을 보여줍니다. 알려진 PTM 조합과 함께 고정된 형광단 접합 히스톤 펩타이드를 포함하는 마이크로어레이 슬라이드를 표적 PTM 특이적 항체로 처리합니다. 이 프로세스는 표적에 대한 항체의 특이성과 비표적 PTM과의 잠재적인 교차 반응을 식별하는 데 도움이 됩니다.

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

펩타이드 어레이 스크리닝은 단백질-단백질 상호 작용 부위를 식별하기 위한 고처리량 분석법입니다. 이를 통해 표적 단백질의 여러 상호 작용을 매핑할 수 있으며 단백질을 표적으로 하는 억제제의 부위를 식별하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 어레이를 스크리닝하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

생체 내 단백질-DNA 상호 작용 매핑 방법은 게놈 연구의 모든 측면에서 중요해지고 있지만 힘들고 비용이 많이 들며 시간이 많이 걸립니다. 여기에서는 제한된 양의 세포와의 생체 내 단백질-DNA 상호 작용을 매핑하기 위해 염색질 면역침전을 자동화하는 상업적으로 이용 가능한 로봇 액체 처리 시스템이 제시됩니다.

칩 서열 실험을 자동화하면 10,000 헬라 세포에 성적인 프로필을 생성합니다

SPOT 방법으로 합성된 펩타이드 어레이는 단백질 라이신 메틸전이효소(PKMT)의 기질 특이성을 분석하고 PKMT의 기질 스펙트럼을 정의하여 생물학적 역할을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 펩타이드 어레이를 합성하고, PKMT로 메틸화하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

SPOT 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 리신 Methyltransferases의 특이성 분석

여기에서 저자는 도트-블롯 하이브리드화를 통해 정제된 단클론 항체와 펩타이드 스캐닝을 사용하여 선형 항원 항원결정기를 정의하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 그런 다음 식별된 항원결정기를 치료 및 진단 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

장기 기증자와 받는 사람 쌍 사이 인간 백혈구 항 원 (HLA) 시퀀스에 불일치 장기 이식의 거부 항 체 중재의 주요 원인입니다. 여기 안티 기증자 HLA alloantibodies 기관 수령인에 프로브를 개별 기증자의 HLA 시퀀스를 기반으로 하는 사용자 지정 항 배열의 사용 선물이.

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

여기서, 우리는 고품질 면역 펩티도믹스 데이터를 제공하는 마우스 및 인간 세포주로부터 MHC 급 I 및 클래스 II 펩티드 복합체의 정화를 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 시판되는 항체를 사용하여 샘플 준비에 중점을 둡니다.

면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

최근 인간 스핀들린 가족 구성원 4(SPIN4)에서 유전적 변이가 발견되었으며, 이는 새로운 발달 장애인 골 과다증식 환자들입니다. 뉴클레오좀 내에서 SPIN4 결합 기질로서 변형된 히스톤을 생화학적 동정하는 프로토콜과 새로운 결과가 제시되었습니다.

펩타이드 배열과 천연 뉴클레오좀 풀다운을 통해 인간 스핀들린 가족 4(SPIN4)의 결합 기질로서 변형된 히스톤의 식별

배우세요 펩티드 마이크로어레이를 활용한 히스톤 항체 특이성 프로파일링 방법을. 이 통합 파이프라인은 크로마틴 생화학 및 후성유전학 연구에서 항체 품질 관리와 특이성 분석에 필수적입니다.

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

더 많은 동영상 탐색