Name: 기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 배우세요 기계적 조직 해리와 FACS를 이용한 포유류 수컷 생식세포 분리법. 단일 프로토콜로 네 가지 세포 집단을 동시에 정제하여 정자형성의 분자 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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저자들은 개 고환에 대한 Hillside Animal 병원 (St. Louis, MO)에 감사드립니다. 제이슨 아 랜드 (Jason Arand)와 테드 시세로 (Ted Cicero) 박사는 워싱턴 대학 (세인트 루이스 워싱톤 대학)에서 쥐의 고환 및 Brianne Tabers에게 수집을 돕기위한 실험실을 제공했습니다. Jared Hartsock과 WashU의 Dr. Salt &#39;s Lab (기니 피그 고환 검사); 소형 돼지 고환에 대한 WashU의 비교 의학 부문의 Michael Talcott 박사. 저자들은 또한 직원이 운영하는 세포 분류 서비스를 제공하는 Siteman Flow Cytometry Core의 사용을 위해 워싱턴 주립대 학교의 Alvin J. Siteman Cancer Center와 St. Louis의 Barnes-Jewish Hospital을 인정했다. Siteman Cancer Center는 부분적으로 NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842에서 지원됩니다. 이 연구는 미국 국립 보건원 (R01HD078641 및 R01MH101810 ~ D)의 보조금으로 FCT 박사 과정 (SFRH / BD / 51695 / 2011 to ACL)FC] 및 FCT 연구 계약서 [IF / 01262 / 2014 to AML]가 포함됩니다.

아래에 설명 된 모든 절차는 세인트루이스의 워싱턴 대학 동물 실험위원회의 규정을 준수했습니다. 1. 기계적 해리 프로토콜 준비 <ol><li> 전체 쥐의 고환의 해리를 위해 50 μm 일회용 티슈 분해 카트리지를 사전 습윤 처리하십시오. 참고 :이 일회용 조직 분해 카트리지에는 조직 절단 용으로 설계된 마이크로 블레이드와 약 100 개의 육각 구멍이있는 움직일 수없는 철재가 들어 있습니다. 조직 분해 카트리지를위한 다양한 크기의 메쉬를 사용하여 종 및 원하는 세포 유형에 따라이 프로토콜을 적용 할 수 있습니다. 이 종이에서 언급 된 모든 포유류 종에는 50 μm 카트리지가 사용되었습니다. <ol><li> 50 μm 일회용 조직 분해 카트리지에 얼음 찬 페놀 레드 1x Dulbecco &#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) 1 mL를 넣으십시오. 참고 : 페놀 빨강은 적색 형광 감지를 방해 할 수 있습니다FACS 기간 중. </li><li> 주사기 포트에서 일회용 3 ML 바늘이없는 주사기와 조직 해체 카트리지에서 1x DMEM를 대기음. </li></ol></li><li> &quot;ON&quot;버튼을 눌러 조직 분리 시스템을 켭니다. 이 시스템은 &quot;워밍업&quot;시간을 필요로하지 않습니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 1 x DMEM이있는 3 개의 40 μm 일회용 필터를 사전 적시십시오. 50 ML 원뿔 튜브에 각 40 μm의 일회용 필터를 놓습니다. 1X DMEM 1 mL를 피펫으로 통과 시키십시오. </li><li> 고환 조직 수집을 위해 100mm x 15mm 페트리 접시를 준비합니다. 배양 접시에 1x DMEM 500 μL를 피펫. </li></ol> 2. 기계적 해리 프로토콜을위한 고환 조직의 준비 <ol><li> 외과 용 가위 및 집게로 신생 모든 고환 또는 고환 조각 (다른 포유류 종을 다루는 경우)을 조심스럽게 제거하기 위해 수컷 마우스를 해부합니다. 참고 : 조직에 지방과 괴사가 없어야합니다. Fr<html> esh 고환 조직은 냉동 조직보다 우수한 단일 세포 현탁액 품질을 생성합니다. <ol><li> 수집 한 고환 / 조각을 1x DMEM 500 μL가 들어있는 준비된 100 mm x 15 mm 페트리 접시에 옮긴다. </li><li> 적혈구 (존재하는 경우)를 제거하기 위해 1x DMEM에서 조직을 부드럽게 헹구십시오. </li></ol></li><li> 조심스럽게 tunica albuginea를 제거하십시오. tunica albuginea의 두께는 다른 종에 따라 다릅니다. <ol><li> 포 셉스로 고환의 한쪽 끝을 잡으십시오. </li><li> 이전 단계에서 포 셉를 가진 고환의 한쪽 끝을 여전히 잡고있는 동안 메스로 고환의 다른 끝을 찔러 라. </li><li> 메스를 사용하여 정소의 한쪽 끝을 2.2.1 단계의 집게로 잡고 고환 세관을 긁습니다. </li></ol></li><li> 메스를 사용하여 고환 세뇨관을 ~ 2-3 mm 3의 조각으로 자르십시오. </li></ol> 3. 고환 조직의 기계적 해리에 의한 단일 세포 현탁액의 취득 ontent &quot;&gt; 참고 : 아래에 설명 된 해리 단계는 한 마리의 성숙한 마우스 고환에 대한 것이며, 어린 쥐 또는 비 쥐과 동물의 고환 조직의 양은 이에 따라 조정해야합니다. 정소 조직 구성은 번식기에 비 교배 계절과 비교하여 변화한다. <ol><li> 포셉을 사용하여 미리 젖은 50 μm의 조직 분해 카트리지에 작은 고환 tubule 조각을 전송하고 1x DMEM의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 조직 해체 카트리지를 조직 분해 시스템에로드하고 손잡이를 &quot;대기&quot;모드에서 &quot;실행&quot;모드로 돌린 후 5 분 동안 처리하십시오. </li><li> 조직 분해 시스템에서 조직 분해 카트리지를 제거하고 주사기 포트에서 일회용 3 ML 바늘없는 주사기로 세포 현탁액을 대기음. <ol><li> 조직 분해 카트리지에서 모든 액체를 제거하기 위해 몇 번 대기음을하십시오. 아니모든 1 mL는 조직 분해 카트리지로부터 회수 될 수있다. </li></ol></li><li> 흡인 된 세포 현탁액을 2 개의 일회용 사전 습윤 40 μm 필터에 통과시킵니다. 모든 셀 집계를 제거하려면 두 번 필터링하십시오. <ol><li> 40 mL 필터를 50 mL 원추형 튜브에 넣으십시오. 직접 40μm 필터에 주사기에 흡인 세포를 추가합니다. 일회용 피펫으로 피펫 통과 단일 세포 현탁액. </li><li> 사용 된 pre-wetted 40 μm 필터를 제거하고 50 μm 원추형 튜브에 또 다른 pre-wetted 40 μm 필터를 놓습니다. 깨끗한 40 μm의 필터에 수집 된 단일 세포 현탁액을 피펫. </li><li> 깨끗한 일회용 피펫으로 여과 된 단일 세포 현탁액을 수집하십시오. </li></ol></li><li> 피펫은 50 μm 조직 분해 카트리지에 세포 현탁액을 걸러 내고 조직 분해 시스템에서 또 다른 5 분 동안 처리합니다. </li><li> 조직 disaggregati에서 모든 액체를 복구카트리지에. </li></ol> 4. Hoechst 및 Propidium Iodide (PI)로 염색 <ol><li> 회수 된 세포 현탁액을 50 μm 조직 분해 카트리지에서 깨끗한 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 약 1-1.5 mL의 단일 세포 현탁액이 회수됩니다. </li><li> 회수 된 단일 세포 현탁액을 4 개의 1.5 mL 또는 5 mL 튜브로 나누십시오. <ol><li> 처음 세 개의 튜브의 경우, 단일 세포 현탁액 150 μL과 4 개의 튜브 (단일 세포 현탁액의 약 550 μL)의 마지막에 단일 세포 현탁액의 피펫 나머지를 피펫. 참고 : 최종 튜브의 단일 세포 현탁액의 양은 단계 3.6에서 세포 현탁액의 회복 효율에 따라 달라질 수 있습니다. </li></ol></li><li> FACS 세션을위한 unstained 컨트롤로 네 튜브의 첫 번째 튜브를 설정합니다. </li><li> 컨트롤로 단일 염료 스테인드 (PI 또는 Hoechst) 세포 현탁액을 준비합니다. 각 튜브에 2.5 ㎕의 Hoechst 또는 PI 1 μL를 넣으십시오 (두 번째와 third). </li><li> 이중으로 염색 된 튜브를 준비하십시오. 이것은 배아 세포 집단을 모으는데 사용될 것입니다. Hoechst 2.5 μL와 PI 1 μL를 마지막 튜브에 첨가하십시오. 참고 : Hoechst의 유통 기한은 2 ~ 3 개월입니다. 염료의 오래된 주식을 사용하면 FACS 세션 동안 상당한 변경이 발생할 것입니다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 품어 낸다. 튜브 회 전자에 시료를 넣거나 5 ~ 10 분 간격으로 1.5 mL 튜브를 뒤집습니다. </li><li> 미리 젖은 40 μm의 여과기로 세포 현탁액을 여과하고 여과 된 용액을 얼음과 어둠 속에서 FACS 세션까지 보관하십시오. 참고 : 여과 단계는 FACS의 세포 덩어리를 예방하는 데 필요합니다. 또한 DNase ( 그림 1 참조) 또는 2- Naphthol-6,8-disulfonic acid diotassium salt (NDA 20 )로 처리하면 세포 응집을 제한 할 수 있습니다. 연장 된 대기 기간은 FACS 동안 검출 된 형광 신호에 영향을 미치고 증가 된 세포 사멸을 초래할 수 있습니다. </li&gt; </ol> 5. 형광 활성화 세포 정렬 (FACS) 고환 세포의 설정 및 정화 <ol><li> FACS 수집 튜브를 준비하십시오. <ol><li> 세포 수집을위한 FBS 400 μL와 5 ML 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브 또는 1.5 ML 튜브를 코트. 코팅 후 과량의 FBS를 따라 내십시오. </li><li> 튜브에 FACS 수집 매체 (1x DMEM + 10 % 태아 소 혈청, FBS)를 튜브에 추가하십시오 : 5mL 튜브의 경우 1mL 또는 1.5mL 튜브의 경우 100μL. </li></ol></li><li> 셀 분류기 및 소프트웨어에서 적절한 정렬 조건을 설정하십시오. 참고 : 아래에 설명 된 것과 유사한 설정 및 게이팅 전략을 사용하여 다른 셀 분류 기계 및 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 여기에 설명 된 조건은 Gaysinskaya와 Bortvin 2 , Geisinger와 Rodriguez-Casuriaga 3 , Getun, et al. 4 <ol><li> 463/2로 자외선 레이저로드Hoechst blue를 검출하기위한 5 nm band pass filter와 Hoechst red를 검출하고 PI를 검출하기위한 680 nm LP band pass filter. </li><li> 555DLP 이색 성 거울을 사용하여 청색과 빨간색 형광을 구별합니다. </li><li> 70 μm 노즐을 사용하고 1000-2000 세포 / 초 속도로 세포를 분류하십시오. 참고 : 정렬 효율은 유량에 의해 직접적으로 영향을받습니다. 높은 유속 (&gt; 3500 events / s)은 분류의 속도를 증가 시키지만 인구의 오염을 초래합니다. 자세한 내용은 참조 12 를 참조하십시오. </li></ol></li><li> 대조 샘플을 사용하여 게이트를 설정하십시오. <ol><li> 염색되지 않은 샘플을로드하고 실행하십시오. </li><li> FSC vs SSC 플롯 패턴에 따라 세포 파편을 제외합니다. 세포 잔해가 음모의 왼쪽 아래 사분면에 나타납니다. 사용자 또는 셀 분류기 기술자가 셀 파편에 대한 임계 값을 임의로 설정합니다. </li><li> FSC 및 펄스 폭에 대한 임계 값을 조정하여 단일 셀의 게이트. 다른 세포 분류기는 서로 다른 방법으로 분배 할 수 있습니다.sing singles. 펄스 폭은 세포가 레이저를 가로 지르는 데 걸린 시간을 반영하기 때문에 단일 세포는 다세포 골재에 비해 더 낮은 값을 갖습니다. FSC 대 펄스 폭에 대한 플롯의 임계 값 조정은 싱글 렛을 선택하는 데 사용될 수 있습니다. </li><li> 최적의 광전자 증 배관 (PMT) 전압을 설정하십시오. </li><li> PI 또는 Hoechst 형광 신호의 임계 값을 확립하기 위해 염색되지 않은 염색 세포와 단일 염료 염색 세포를 사용하십시오. 참고 : 각 염료에 적절한 형광 범위를 설정하려면 관심있는 세포에 대한 기본 PTM 전압을 최적화하는 것이 중요합니다. 이는 최적의 신호 탐지 및 민감성을 위해 중요합니다. 염색되지 않은 단일 염색 대조 세포는 PI 및 / 또는 Hoechst 염료를 사용하여 음성 및 양성 염색 세포의 범위를 확립하고 신호의 잡음을 최소화하는 데 사용됩니다. 제어 셀을 사용하여 PMT 전압을 최적화하는 방법에 대한 자세한 설명은 Gaysinskaya 및 Bortvin 2 를 참조하십시오. </li><li> 살아있는 세포의 문PI 염색 (PI 음성) 및 FSC 플롯을 기반으로 하였다. 죽은 세포는 PI 형광에 대해 양성 반응을 보일 것입니다. </li><li> Hoechst blue 형광에 근거한 세포 수의 막대 그래프를 플로팅하여 DNA 내용 게이트를 설정하십시오. haploid (1C), 2 배체 (2C) 및 4 배체 (4C) 세포를 나타내는 Hoechst blue 형광 농도가 증가하는 3 개의 피크가 나타납니다. 3 개의 게이트를 설정합니다 (각 피크 당 하나씩). </li><li> 세균 세포 집단에 대한 게이팅을 진행하기 전에 적어도 50 만 건의 FSC 대 SSC 계획을 관찰하십시오. </li></ol></li><li> 게이트 다른 생식 세포 인구. <ol><li> Hoechst / PI 스테인드 시료를 넣습니다. </li><li> 모든 모집단에 공통적 인 처음 3 개의 모기지 게이트를 설정하십시오. <ol><li> FSC vs SSC 플롯을 기준으로 세포 파편을 제외합니다. FSC와 펄스 폭 플롯을 기준으로 싱글 렛을 선택하십시오. PI 음성 세포를 게이팅하여 살아있는 세포를 선택하십시오. </li></ol></li><li> spermatogonia 게이트를 정의하십시오. </li><li> Hoechst 청색 및 적색 형광에 근거한 PI 음성 세포강도. Spermatogonia는 부작용으로 나타납니다 ( 그림 1 참조). </li><li> 나머지 생식 세포 집단에 대한 문을 정의하십시오. 참고 : 자세한 내용은 그림 1과 보조 그림 2를 참조하십시오. </li><li> DNA 콘텐츠 게이트에 PI 부정적인 세포를 플롯하십시오. <ol><li> spermatids 들어 가장 낮은 Hoechst 형광 (1C)와 피크를 문. </li><li> spermatocytes II 들어, 중간 Hoechst 형광 (2C)와 피크를 게이트. </li><li> spermatocytes 들어, 가장 높은 Hoechst 형광 (4C)와 피크를 문. </li></ol></li><li> DNA 콘텐츠 게이트에서 spermatocytes 및 spermatids 집단을 정제하기 위해 Hoechst 청색 및 적색 형광 강도를 플롯합니다. </li></ol></li><li> 이전에 준비된 수집 튜브에 선택한 subpopulation 게이트를 수집합니다. 각 정소 각 모집단 약 0.5-6.0 × 106 세포를 수집하고, 1.5 시간에 45 분의 평균을 취한다. 참고 : Hoechst mA에 장기간 세포 노출y는 시간이 지남에 따라 인구의 위치를 ​​약간 이동시킵니다. FACS의 20-30 분 후 설정을 새로 고칩니다. 각 하위 집단에 대한 최대 수율은 해리 단계의 효율성에 달려있다. </li></ol> 6. 정제 된 세포의 미세한 평가 <ol><li> 4 ° C에서 10 분 동안 500-600 xg에서 세포를 스핀. </li><li> 얼음 감기 1X 인산 버퍼 솔루션 (PBS) 또는 1X DMEM의 1 ML로 세포 펠렛을 다시 중단하십시오. 참고 : 재현 현탁액은 분류 된 세포의 수와 원하는 최종 농도에 따라 조정할 수 있습니다. </li><li> 깨끗한 유리 슬라이드에 세차 세포 40 μL 피펫과 coverslip을 놓으십시오. </li><li> 4 % paraformaldehyde (PFA)로 남아있는 세포를 고정시키고 4 ℃에서 고정 된 세포를 저장하여 나중에 참조 할 수있게한다. <ol><li> 수집 튜브에 100 μL 4 % PFA를 직접 피펫에 넣습니다. </li><li> 세포 현탁액의 잘 혼합되도록 튜브 또는 피펫을 간단히 와동시킨다. </li></ol></li><li> 준비된 슬라이드를 자외선 램프가 장착 된 현미경으로 시각화하여 63X 대물 렌즈에서 Hoechst 형광을 검출합니다. 특정 배아 세포 유형을 식별하는 방법에 대한 자세한 내용은 결과 섹션 - 분류 된 배아 세포 집단의 형태 학적 평가를 참조하십시오. </li></ol>

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</ol>

모든 저자는 경쟁적 이익을 선언하지 않습니다.

포유 동물의 정자 형성 과정에서 고도로 보존 된 염색질 동역학을 고려할 때,이 연구의 목적은 다른 포유류 고환 조직과는 다른 분화 단계에서 남성 생식 세포를 분리하는 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다 ( 그림 1 ). 다른 동물 모델에 단일 작업 흐름을 적용하는 데있어 주요 장애물 중 하나는 특히 조직 해리 프로토콜과 관련하여 종별 조정이 필요하다는 것입니다. 현재의 방법은 대부분 효소 조직 소화에 의존하며 프로토콜은 종내 에서조차 다양합니다 12 . 이 문제를 극복하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 포유류 종의 고환 샘플에서 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 기계적 조직 해리를 적용하는 방법을 보여줍니다. 결과는이 시스템과 함께 새로운 고환 조직의 기계적 해리가 잘 수행됨을 나타냅니다 ( 그림 2A -2B </st...

spermatogenesis progression을 나타내는 in vitro system이 부족하고 testis에 세포 이종성이 존재한다는 점을 감안할 때 수컷 생식 세포 생물학에 대한 연구에서는 특정 세포 유형의 농축 된 개체군을 단리하기위한 강력한 기술이 필요합니다. Fluorescence-activated cell sorting (FACS)은 높은 수율과 순도를 제공하고 식별 할 수있는 배양 세포 유형의 수에서 다른 단리 방법을 능가하므로이 목적을 위해 1 , 2 , 3 , 4 , 5 로 널리 사용되었습니다. 6 , 7 , 8을 선택하십시오. 유세포 분석의 원리는 단일 세포의 레이저 빔 여기 이후의 차동 빛 패턴의 검출에 기초합니다. 세포가 레이저를 통과함에 따라 빛을 반사 / 산란시킵니다.모든 각도에서 세포 크기 (전방 산란; FSC) 및 세포 내 복잡성 (측방 산란; SSC)에 비례한다. 유동 세포 계측법에 대한 자세한 내용은 Ormerod 9 를 참조하십시오. 남성 생식 세포는 정자 형성의 여러 단계에 걸쳐 DNA 함량, 염색질 구조, 크기 및 모양에 특별한 변형을합니다. 따라서 뚜렷한 세포 집단은 형광 염료 10 , 11로 빛의 산란과 DNA 염색을 결합하여 확인하고 분리 할 수 ​​있습니다. 몇몇 염료는 종종 10 지난 십 1, 2, 4 고환 세포의 유동 세포 계측법 분석에 사용 된 이러한 목적 등의 Hoechst-33342 (헥스)로서, (Geisinger 그리고 로드리게스-Casuriaga 3에서 검토)에 사용될 수있다 , 12 . 우포UV- 빛을 이용한 여기 Hoechst는 세포 DNA의 내용에 비례하여 청색 형광을 방출하는 반면, 원적외선 형광은 염색질 구조 및 압축 1 , 13 , 14의 가변성을 반영합니다. 그 결과, 분화의 다양한 단계에서 남성 생식 세포는 훽스트 염색 단일 세포 현탁액 FACS 동안 특정 패턴을 나타낸다 (호 FACS-1, 12). 흥미롭게도, 정자 단계에서만 활성화되는 색소 유출의 메커니즘으로 인해, Hoechst blue 형광의 강도는이 세포의 염색질 함량에 비례하지 않으며, Ho-FACS 15 동안 부작용으로 분류됩니다. 또한 Hoechst 염색을 비 침투성 염료 propidium iodide (PI)와 결합하면 사용자가 FACS 1 &lt; 1 일 때 죽은 (PI 양성) 세포와 생체 (PI 음성)를 구별 할 수 있습니다.2 , 10 , 12 이다. 이전 유세포에서 사용되고 이러한 전략은 고환 생식 세포의 분석 및 감수 I 1, 2, 4, 16의 4 가지 단계의 세포를 포함 9 개 생식 세포 유형까지 판별 마우스에서 광범위하게 최적화. 이 작품의 목적을 위해, Hoechst 염색법은 세 가지 주요 장점이 있습니다. 먼저, Ho-FACS는 마우스 모델 1 , 2 , 12 및 기타 쥐 (rat 및 쥐 돼지 17 , 18 , 19) 의 남성 생식 세포의 분리에 성공적으로 적용되었습니다. 둘째, Hoechst는 세포 투과성 염료이며 막 투과성을 필요로하지 않으므로 보존제가됩니다ves cell integrity. 마지막으로 Hoechst가 poly (d [AT]) DNA 서열 1 , 20 에 우선적으로 결합하기 때문에 RNase 처리가 필요하지 않다. RNA가 보존되고 DNA와 단백질 이외에 세균의 추가 하류 분자 연구에 사용될 수 있음을 의미한다 세포 분화. 포유류 종의 유동 세포 계측법 분석 (Geisinger and Rodriguez-Casuriaga 3 에서 검토 됨)에서 관찰 된 DNA 배수성 및 / 또는 염색성의 유사성에도 불구하고, 유동 세포 계측법에 의한 수컷 배아 세포 분리에 대해 설명 된 프로토콜에는 상당한 다양성이있었습니다. 여러 연구에서 조직 해리에 대한 특정 프로토콜을 사용하고 주로 마우스, 쥐 및 기니피그 등 다양한 모델 유기체에서 별개의 DNA 결합 염료 (단독 또는 조합)와 FACS 게이팅 전략을 사용했습니다. 따라서 서로 다른 종에 대해 수집 된 자료를 직접 비교하는 것은 unacco의 영향을받을 수 있습니다방법론 사이의 다양성으로 인한 기술적 인 유물이 없습니다. 중요한 것은 포유류 정자 형성 (2N - 4N - 2N - 1N)에 걸쳐 염색질 동력학의 놀라운 보존은 표준화 된 프로토콜이 다양한 포유류 종에 횡 방향으로 적용될 수 있음을 시사합니다. 이 연구의 목표는 결합하고, 20 이전에 출판 기술 (2)를 적용하여, 다른 포유 동물 종에 적용 할 수있는 하나의 워크 플로우를 개발하는 것이 었습니다. 조직 처리하기위한 방법의 표준화는 효소 분해에 필요한 5 종 특이 조정에 대한 필요성을 해결하기 위해 기계적 분해를 수행함으로써 달성되었다. 설치류 고환 조직의 기계적 해리가 두 가지 방법으로 생성 된 단일 세포 현탁액의 효소 조직 소화 20 및 Ho-FACS보다 우수한 것으로 나타났습니다그것과 비교 가능한 결과 5 . 원칙 증명으로이 프로토콜은 최대 5 개의 생식 세포 집단을 분리하는데 사용 된 설정을 기술합니다 : spermatogonia (SPG); 1 차 (SPC I) 및 2 차 spermatocytes (SPC II) 및 spermatids (SPD) - 라운드 (rSPD) 및 연장 (eSPD). 중요한 것은 조직 해부 및 UV 레이저가 장착 된 셀 분류기에 대한 액세스 시스템이 주요 요구 사항 인 실험실에서 쉽게 구현할 수 있다는 것입니다. 이 작업 흐름 ( 그림 1 )은 빠르고 간단하며 2 시간 이내에 새로운 고환 조직에서 4 개의 배아 세포 집단을 동시에 격리 할 수 ​​있습니다. 감소 된 처리 시간은 추가 다운 스트림 절차를 위해 셀룰러 무결성을 유지하는 데 중요합니다. 더욱이 5 종의 다른 종에서의 성공적인 수행은 포유 동물의 clade 내에 광범위하게 적용될 수 있음을 시사하며 포유 동물의 남성 생식 기관의 비교 연구를 위해 생식 세포를 분리하는 이상적인 방법으로 만든다ogy. 이 프로토콜은 준비 단계를 제외하고 세 가지 주요 섹션으로 구성되어 있습니다 : (1) 고환 조직의 기계적 해리 및 (2) Hoechst 및 PI와의 고환 세포 염색, (3) 관련 정자 세포의 FACS 분류. 일단 포집되면, 다양한 포유류 고환 세균 세포의 이러한 풍부한 개체군은 광범위한 적용 분야에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 많은 다른 포유 동물 종에서 남성의 배아 세포를 정화하는 &quot;모든 크기에 맞는&quot;해리 방법을 설명합니다. 격리 된 생식 세포로 수행하고자하는 연구 유형에 따라 다른 배지 또는 완충액을 사용할 수 있습니다. 다음 프로토콜 단계는 하나의 전체 쥐의 정소에서 단일 세포 현탁액을 생성하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>VWR</td><td>#15710</td><td>4% PFA, 분류된 세포 고정용</td></tr><tr><td>Medimachine</td><td>BD Biosciences</td><td>#340588;</td><td>고환 해리 시스템</td></tr><tr><td>1X Dulbecco modified Eagle medium</td><td>Life Technologies</td><td>#31053</td><td>DMEM, 고환 해리용</td></tr><tr><td>Medicon</td><td>BD Biosciences</td><td>#340591</td><td>고환 해리용 분해 카트리지</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo Scientific</td><td>#10082139</td><td>FBS, FACS 수집용</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>#H3570</td><td>Hoecsht, FACS 염색용</td></tr><tr><td>40 & 마이크로; m 세포 여과기</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>#89508-342</td><td>고환 해리용</td></tr><tr><td>100x 15mm 페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>#351029</td><td>고환 박리용</td></tr><tr><td>5mL 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td>#352063</td><td>FACS 컬렉션용</td></tr><tr><td>1.5mL Eppendorf 튜브</td><td>VWR</td><td>#20170-650</td><td>FACS 컬렉션용</td></tr><tr><td>3mL 불필요한 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>#309657</td><td>고환 해리</td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>MIDSCI</td><td></td>#C50R <td>고환 해리 용&nbsp;</td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>Invitrogen</td><td>#L7011</td><td>PI, FACS 염색용</td></tr><tr><td>MoFlo Legacy 세포 분류기</td><td>Beckman Coulter</td><td>#ML99030</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Summit 세포 분류 소프트웨어</td>용 <td>Beckman Coulter</td><td>#ML99030</td><td>FACS</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td>용 <td>Thermo Scientific</td><td>#AM9625</td><td>PBS, 현미경 검사용</td></tr><tr><td>현미경 유리 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-544-4</td><td>현미경용</td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-548-87</td><td>현미경용</td></tr><tr><td>일회용 전사 피펫(3mL)</td><td>Samco Scientific</td><td>#225</td><td>고환 해리용</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>#10104159001</td><td>고환 해리용</td></tr><tr><td>탄소강 수술용 블레이드</td><td>Miltex</td><td>#4-111</td><td>고환 박리용</td></tr><tr><td>Countess 자동 세포 계수기</td><td>Invitrogen</td><td>#C10227</td><td>자동 세포 계수용</td></tr><tr><td>트리판 블루 용액(0.4%)</td><td>Sigma</td><td>#T8154</td><td>생존율 염색용</td></tr></tbody></table>

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS)은 포유류 고환 세균 세포의 풍부한 개체군을 분리하는 방법 중 하나였습니다. 현재, 그것은 높은 수율과 순도로 9 마리의 쥐과세 세포 집단의 차별을 허용합니다. 이 차별화와 정화의 고해상도는 정자 형성을 통한 염색질 구조와 양의 독특한 변화로 인해 가능합니다. 이러한 패턴은 Hoechst-33342 (Hoechst)와 같은 형광 DNA 결합 염색 물로 염색 된 수컷 생식 세포의 유동 세포 계측법으로 포착 할 수 있습니다. 포유류 고환 세균 세포를 분리하기 위해 최근 개발 된 프로토콜에 대한 상세한 설명이 여기에있다. 간단히 말해, 단세포 현탁액은 기계적 해리에 의해 고환 조직으로부터 생성되고, 호 에스트 (Hoechst) 및 요오드화 프로피 듐 (PI)으로 이중 염색되고 유동 세포 계측법에 의해 처리된다. 상이한 DNA 함량 (Hoechst 강도)을 갖는 살아있는 세포 (PI 음성)의 선택을 포함한 일련의 게이팅 전략, 즉FACS 분류 과정에서 5 개의 배아 세포 유형을 구별하기 위해 사용됩니다. spermatogonia (66 %), primary (71 %) 및 secondary (85 %) spermatocytes 및 spermatids (90 %)를 포함하여 평균 순도 (현미경으로 평가) (87 %)의 하위 집단. 전체 워크 플로우를 실행하는 것은 간단하며 적절한 FACS 시스템으로 4 가지 세포 유형을 동시에 분리 할 수 ​​있으며 2 시간 이내에 수행 할 수 있습니다. 처리 시간 단축은 생체 내 생체 의 생리학을 보존하는 데 중요 하므로이 방법은 남성 생식 세포 생물학에 대한 하류 고 처리량 연구에 이상적입니다. 또한, 포유류 배아 세포의 다중 종 (multispecies) 정화를위한 표준화 된 프로토콜은 방법 론적 변수의 출처를 제거하고 상이한 동물 모델에 대해 단일 세트의 시약을 사용할 수있게한다.

고환 조직의 기계적 해리로 인한 단일 세포 현탁액 도 2 는 상이한 조건 하에서 마우스 고환 조직의 기계적 해리에 의해 얻어진 단일 세포 현탁액을 비교한다. ( 그림 2A ) 또는 Hoechst ( 그림 2B )로 얼룩진 신선한 조직을 처리하여 얻은 샘플은 다양한 분화 단계에서 단일 세포의 존재를 보여 주며, 중요하게는 세포 구조가 정자의 편모를 포함하여 보존 된 것으로 보입니다. 해동 후 DNase를 첨가함으로써 감소 된 염색 된 샘플에서 약간의 응집 및 파편이 관찰되었지만 ( 도 2D ), 이러한 결과는 Hoechst 염색이 단일 세포 현탁액의 품질을...

이 연구는 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터 정제 된 배아 세포 집단을 얻는 방법의 표준화를 기술한다. Hoechst-33342 및 propidium iodide로 염색하는 기계적 고환 해리와 남성 생식 생물학의 비교 연구에서 폭넓게 응용할 수있는 FACS 분류법을 결합한 간단한 프로토콜입니다.

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

이 표준화된 절차의 전반적인 목표는 단일 프로토콜을 사용하여 다양한 포유류 종으로부터 서로 다른 수컷 생식 세포 유형을 분리하는 것입니다. 이 방법은 서로 다른 생식 세포 유형의 고처리량 분석을 통해 정자 형성의 분자적 연구를 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 시약 세트를 다양한 포유류 종에 적용하여 네 가지 서로 다른 수컷 생식 세포 집단을 동시에 분리할 수 있다는 점입니다.우리는 서로 다른 포유류에서 특정 유전자 발현 조절 패턴의 진화를 조사하기로 결정했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. Siteman Flow Cytometry Core의 임상병리사인 Chris Holley가 세포 분리기를 작동하고 게이트를 설정하는 방법을 시연할 것입니다. 먼저 마우스의 고환 하나를 캡슐에서 분리한 다음 조직을 작은 조각으로 자르는 것으로 시작하십시오.그 후 핀셋을 사용하여 작은 조직 조각들을 미리 적신 50 micrometer 조직 분해 카트리지로 옮깁니다. 카트리지에 DMEM 배지 1 mL를 넣고, 조직 분해 카트리지를 조직 분해 시스템에 장착합니다. 노브를 standby에서 run으로 돌려 조직을 5분 동안 처리합니다.그 다음 카트리지를 제거하고, 3 mL 일회용 주사기를 사용하여 주사기 포트에서 세포 현탁액을 흡입합니다. 모든 액체를 회수한 후, 세포 응집물을 제거하기 위해 미리 적신 40 µm 일회용 필터 2개에 세포를 각각 통과시킨 다음, 현탁액을 다시 해리 카트리지에 넣습니다. 그런 다음 세포를 5분 동안 더 처리합니다.형광 활성 세포 분별(fluorescence-activated cell sorting)을 위해 세포를 염색하려면, 해리된 세포 현탁액을 1.5 milliliter 튜브에 수집하십시오. 그다음, 150 microliters의 세포를 새로운 1.5 milliliter 튜브 3개에 각각 옮기고, 남은 부피는 네 번째 1.5 milliliter 튜브에 넣으십시오. 첫 번째 튜브는 미염색 대조군으로 두고, 두 번째 튜브에는 Hoechst 2.5 microliters를, 세 번째 튜브에는 propidium iodide 1 microliter를, 네 번째 튜브에는 Hoechst와 propidium iodide를 모두 추가하십시오.암실 내 실온에서 30분 동안 천천히 회전시키며 반응시킨 후, 세포 현탁액을 미리 적셔둔 개별 40 micron 스트레이너를 통해 5 mL 라운드 바텀 튜브에 여과합니다. 다음으로 FBS가 보충된 DMEM이 담긴 수집 튜브 4개를 유세포 분석기의 소팅 스파우트 아래에 배치하고, 분석을 위해 염색되지 않은 대조군 튜브를 로드합니다. 전방 산란광(forward scatter) 대 측방 산란광(side scatter) 플롯을 사용하여 세포 파편을 제외하고, 단일 세포를 게이팅할 수 있도록 전방 산란광 임계값과 펄스 폭을 조정합니다.수집된 샘플의 품질을 최적화하려면 엄격한 게이팅이 매우 중요합니다. 세포 파편과 다세포 응집체를 제외하여 단일 세포가 선택되도록 하십시오. 단일 염색된 세포를 사용하여 염색되지 않은 샘플과 비교하여 Hoechst 및 propidium iodide 형광 강도의 임계값을 설정하십시오.그다음 이중 염색된 실험 시료를 로드하고, 방금 시연한 것과 같이 세 개의 부모 게이트를 설정합니다. 세 개의 부모 게이트 설정이 완료되면, propidium iodide 염색이 되지 않은 것을 기준으로 살아있는 세포를 선택하고, Hoechst blue 형광에 따른 세포 수 히스토그램을 작성하여 DNA 함량을 설정합니다. haploid, diploid 및 tetraploid 세포를 나타내는, Hoechst blue 형광 농도가 증가하는 세 개의 피크 각각에 대해 게이트를 설정하고, forward versus side scatter 플롯에서 최소 500,000개의 이벤트를 관찰합니다.propidium iodide 음성 세포들을 Hoechst blue 및 red 형광 강도에 따라 도식화합니다. 정원세포는 side population으로 나타납니다. Hoechst blue 형광 강도는 DNA 함량과 상관관계가 있습니다.따라서 Hoechst blue 및 red 플롯을 생성하기 전에 이 게이트를 설정하면 원하는 배수성을 가진 세포를 확실하게 선택할 수 있습니다. 정세포(spermatid) 분리를 위해서는 반수체 피크에 게이트를 설정하고 Hoechst blue 및 red 형광을 플롯했을 때 나타나는 세포군을 선택하십시오. 제2정모세포(spermatocytes II) 분리를 위해서는 이배체 피크에 게이트를 설정하고 Hoechst blue 및 red 형광을 플롯했을 때 나타나는 세포군을 선택하십시오.정모세포 I 분리를 위해, 4배체 피크를 게이팅하고 Hoechst 청색 및 적색 형광을 플롯했을 때 나타나는 집단을 선택합니다. 그런 다음, 선택된 하위 집단을 개별 수집 튜브로 분류하여 각 세포 하위 집단당 약 0.5 내지 6 × 10⁶개의 세포를 수집합니다. 신선한 조직을 기계적으로 해리하여 얻은 Hoechst 미염색 또는 염색 세포 현탁액에서 다양한 분화 단계에 있는 단일 세포들의 존재가 확인됩니다.중요한 점은 정자의 편모를 포함한 세포 구조가 보존된 것으로 보인다는 것입니다. 세포 파편을 제외한 후, 세포의 95~98%가 단일 세포이며, 그 중 86~93%가 살아 있습니다. FACS 과정에서 blue red Hoechst 형광 기능을 플로팅하면 특정 고환 생식 세포군을 식별하기 용이합니다.예상한 바와 같이, 반수체 정세포 집단이 가장 많았으며, 이어서 이배체 제2정모세포와 사배체 제1정모세포 순으로 나타났으며, 이러한 패턴은 여러 종에 걸쳐 유지됩니다. 분류된 세포를 현미경으로 분석한 결과, 정원세포는 Hoechst 염색 시 밝게 나타나는 뚜렷하고 작으며 둥근 중심주변 이질염색질을 보이는 것으로 나타났습니다. 정모세포는 더 크고 과립형인 세포로, 핵 식별이 용이하며, 제1정모세포 하위 집단에서는 감수분열 세포의 특성인 염색질 변이가 나타나고 제2정모세포 하위 집단에서는 핵이 형성되었거나 디아키네시스(diakinetic) 단계의 핵이 관찰됩니다.정세포(Spermatids)는 둥글거나 길쭉한 모양의 작은 반수체 세포로, 국소적인 염색질 중심체(chromocenters)의 존재를 통해 정원세포(spermatogonia)와 구별할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 Hoechst는 민감도가 높으면서도 유전독성이 있다는 점과, 필요에 따라 배양 시간을 늘리면 세포 집단의 분해능을 개선할 수 있다는 점을 유의하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, 진화적 맥락에서 포유류 종 내의 후성유전학적 변형 또는 전사체 및 단백질의 풍부도와 다양성에 관한 질문에 답하기 위해 고처리량 오믹스 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 수컷 생식 생물학 분야의 연구자들은 여러 포유류 종에서 정자 형성 진행을 유도하는 조절 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, Hoechst FACS를 위해 고환 샘플을 처리하는 방법과 Hoechst 신호를 기반으로 서로 다른 수컷 생식 세포 유형을 식별하고 분리하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.Hoechst 및 propidium iodide와 같은 DNA 결합 염료는 매우 위험할 수 있습니다. 이러한 시약을 다룰 때는 항상 개인 보호 장비를 착용하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 마우스 splenocytes의 단일 셀 suspensions를 준비하는 gentleMACS의 Dissociator를 사용하여 자동 조직 분리에 대한 간단한 시간 절약 기법을 설명합니다.

gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직의 동요에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 폐 조직에서이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

마우스 testis에서 높은 정화 가능한 meiotic 분수를 얻는 효과적인 방법은 형광 활성 세포 분류 (외과)와 세련된 세포 분리 프로토콜을 결합하는, 설명되어 있습니다. 이 방법은 DNA의 내용과 개별 meiotic 분수의 핵 밀도의 차이 활용합니다.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

효소 세제를 피 설치류 자료에서 고환 세포 현탁액의 기계적 준비를위한 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 매우 간단하고 빠르고, 재현성 및 흐름 정렬 및 RNA 추출에 적합한 좋은 품질의 세포 현탁액을 렌더링합니다.

고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

STA-PUT 방법은 크기와 밀도에 따라 정자 형성 세포의 다른 인구의 분리 할 수​​ 있습니다.

STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리

남성 생식계열의 새로운 돌연변이는 다음 세대에서 건강에 해로운 결과에 기여할 수 있습니다. 여기에서는 환경 인자에 의해 유도된 수컷 생식 세포의 돌연변이를 정량화하기 위한 형질전환 설치류 모델의 사용 프로토콜에 대해 설명합니다.

형질 전환 쥐 분석 정량화 남성 생식 세포 돌연변이 주파수에 대한

유세포 분석을 사용하여 마우스 정자에 대한 정렬 전략을 설명합니다. 정자류는 둥글게(정자형성 단계 1-9), 초기신장(정자형성 단계 10-12), 후기신장(정자형성 단계 13-14) 및 길쭉한 정자류(정자형성 단계 15-16)를 포함하여 4개의 매우 순수한 개체군으로 분류됩니다. DNA 염색, 크기 및 입도는 선택 매개변수로 사용됩니다.

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비와 불연속 소 혈청 알부민 밀도 그라데이션을 사용하여 성인 마우스 고환에서 파키틴 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자를 풍부하게하기위한 프로토콜입니다.

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

우리는 마우스 두뇌 또는 척수에서 검색된 동시에 다른 세포 모형을 확인하기 위하여 교류 세포측정 방법을 제시합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 순수 한 세포 집단을 분리하거나 특성화하거나 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 생체 내 투여 시 세포 표적화의 정도를 정량화하기 위해 악용 될 수 있습니다.

다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석

여기서, 1차 신생아 골린 고환 세포로부터 고환 오르가노이드를 발생시키는 네 가지 방법은 즉, 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM-없는 2D 및 3D 배양 환경으로 기술된다. 이러한 기술은 여러 연구 응용 프로그램을 가지고 있으며 시험관 내고 발달 및 생리학을 연구하는 데 특히 유용합니다.

추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

배우세요 기계적 조직 해리와 FACS를 이용한 포유류 수컷 생식세포 분리법. 단일 프로토콜로 네 가지 세포 집단을 동시에 정제하여 정자형성의 분자 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

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