Name: 인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 학습하세요 성인 골격근에서 인간 마이오블라스트를 분리하고 근원성 분화를 평가하며 저장 운영 칼슘 항목을 측정하는 방법을. 이 기술은 근육 재생 과정에서 칼슘 신호 전달을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (부여 번호 310030-166313), &quot;Fondation Suisse la recherche sur les les maladies musculaires&quot;, &quot;Foundation Marcel Levaillant&quot;및 &quot;Fondation pour la recherche ostéo articulaire&quot;에 의해 지원되었습니다.

건강한 환자의 정형 외과 수술 중에 수술 용 폐기물로 인간 근육 샘플 (반결질 근육에서 얻은 조직)을 채취했습니다. 인체 연구와 관련된 모든 방법은 스위스 규정 보건 당국의 지침 및 규정에 따라 수행되었으며 스위스 제네바 당국 (Commission Cantonale d&#39; Ethique de la Recherche)의 승인을 받았다 (프로토콜 CER 번호 12-259) . 이 연구에 참여한 모든 성인 피험자로부터 정보 및 서면 동의를 얻었습니다. 1. 인간 골격근으로부터 근섬유의 분리 <ol><li> 모든 절차 동안, 수준 II 조직 배양 후드에서 작업하고 멸균 배지 및 멸균 완충액을 사용하여 멸균 상태를 유지하십시오. 참고 :이 절차는 많은 인간 골격 근육에 적용 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 해리 프로토콜 <ol><li> 근육 샘플 (2 - 3g)을 무균 6cm플레이트. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS) 5 - 10 ML로 근육 샘플을 씻으십시오. 세척을 반복하십시오. </li><li> 굽은 가위와 클램프를 사용하여 결합 조직과 지방 조직을 제거합니다. </li><li> 근육 샘플을 계량하고 (2.13 단계 참조) 새로운 무균 6cm 플레이트로 옮깁니다. </li><li> 5 mL의 0.05 % Trypsin-EDTA를 첨가한다. </li><li> 가위를 사용하여 근육 조직을 잘라 내고 작은 조각 (2mm 미만)을 만듭니다. </li><li> 10 ML 혈청 피펫을 사용하여 자기 막대를 포함하는 200 ML 해리 병에 다진 근육을 전송하십시오. 0.05 % 트립신 - EDTA 90 ML가 모든 다진 근육과 함께 해리 상자로 전송 될 때까지이 단계를 반복합니다. 해리 병을 닫고 온화한 교반하에 60 분 동안 37 ° C에서 품어 라. </li><li> 가열 욕조에서 해리 병을 제거하고 해리 병에 태아 송아지 혈청 (FCS; 10 % 최종 부피) 10 ML을 추가하여 효소 반응을 중지합니다. 혼합물을 피펫으로 균질화하십시오. </li><li> 예습각각에 70μm 셀 스트레이너가있는 두 개의 50mL 튜브입니다. 현탁액이 통과 할 때까지 필터 위에서 위아래로 pipetting하여 각 튜브에 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액의 절반을 전달하십시오. </li><li> 튜브를 200 xg 및 20 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 흡인하고 상등액을 버린다. </li><li> 성장 매체 (GM; 표 1 ) 10 ML로 세포를 Resuspend하고 한 50 ML 튜브에 배치 40 μm의 세포 스트레이너를 통해 세포를 전달하십시오. 튜브를 200 xg 및 20 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 흡인하고 상등액을 버린다. </li><li> GM 10 ML와 세포를 Resuspend하고 5 분 200 XG와 20 ° C에서 튜브를 원심 분리기; 흡인하고 상등액을 버린다. </li><li> GM 1 ML와 세포를 Resuspend하고 Neubauer 챔버를 사용하여 셀을 계산합니다. 참고 : 일반적으로 근육의 g 당 3 × 10 5 세포의 수율은 수확해야한다. 수확량은 세포 수를 근육 생체의 무게로 나누어 계산합니다sy (단계 2.4). </li><li> 37 ° C와 7 % CO 2 에서 4 ML의 GM 및 부화가 들어있는 멸균 6cm 플레이트에 2 X 10 5 세포를 넣으십시오. 필요한만큼의 번호판을 준비하십시오. </li><li> 3 일 후에 GM을 변경하십시오. 참고 : 갓 해체 된 세포는 배양 판에 부착 할 시간이 필요합니다. 또한, 첫 번째 근육 세포 배증 시간은 약 50 - 60 시간입니다. 첫 번째 분열 후 두 배의 시간은 약 20 시간입니다. </li><li> 셀 (70)에 도달하면 7일 - - 5 후 (약 1.5 × 10 6 세포 / 6cm 플레이트 당) 80 % 컨 플루 언스, 항체 염색 및 세포 분류 (단계 3)를 시작한다. </li></ol> 3. 항체 얼룩과 세포 분류 <ol><li> PBS로 한번 세척 한 후, 37 ℃에서 0.05 % 트립신 EDTA 1 ㎖와 (6 cm 플레이트)를 접착 세포 배양 7 % 3 분간 CO 2 (또는 5 % CO에서 배양 2). GM 2 mL를 첨가하여 반응을 멈추고 15 mL 튜브에 세포를 수집한다. 원심 분리 후 (200 xg, 5 분), resGM 1 mL에 세포를 첨가한다. </li><li> Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 세십시오. </li><li> 얼음 위에서 다음 절차를 수행하십시오. 참고 : cytometer에 올바른 형광 보상을 설정하는 절차는 필수적이며 모든 cytometer에서 유사해야합니다. 튜브 1과 2는 음성 대조군으로 사용됩니다. 튜브 3 - 7은 첫 번째 실험에서 cytometer의 보정량을 설정하는 데 사용됩니다 ( 표 2 ). 각 항체 및 해당 이소 형에 사용 된 최종 농도는 동일해야합니다 (약 1 μg / 10 6 세포). </li><li> 1 - 7 튜브 (5 ML 튜브) 당 1 X 10 5 세포를 파견 ( 표 2 ). 세포 정렬을 위해 튜브 8에 남아있는 세포 현탁액을 놓습니다. </li><li> 차가운 FACS 버퍼 (PBS - 5 % FCS) 1 ML로 세포를 씻으십시오. 5 분 동안 200 xg 및 4 ° C에서 튜브를 닫고 원심 분리하십시오. 흡인하고 상등액을 버린다. </li><li> 튜브 당 FACS 버퍼의 200 μL를 추가합니다. th에 항체를 추가하십시오표 2 에 따른 e 튜브. 얼음 위에서 30 분 동안 품어 낸다. </li><li> 세포를 씻으십시오 : 각 튜브에 FACS 버퍼 1 ML을 추가합니다. 5 분 동안 200 xg 및 4 ° C에서 튜브를 닫고 원심 분리하십시오. 흡인하고 상등액을 버립니다. 이 단계를 한 번 더 반복하십시오. </li><li> FACS 버퍼 500 μL에 세포를 Resuspend. 튜브를 닫고 셀 정렬까지 얼음에 보관하십시오. 세포 분별하는 동안 세포를 수집하는 데 필요한 GM의 500 μL를 각각 포함 1.5 ML의 4 튜브를 준비합니다. 얼음 위에 보관하십시오. </li><li> 유동 세포 계측법 ( 그림 1 )에 의해 인간 myoblasts를 정렬합니다. CD45 양성 조혈 세포를 배제 한 후 CD56 발현을 기준으로 CD45 음성 세포를 분리합니다. 그런 다음 CD34, CD144 및 CD146 (인간 근섬유는 CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- 세포로 정의 됨)에 대한 CD56 양성 집단을 게이트하십시오. 순도를 확인하기 위해 정렬 된 세포 집단의 작은 부분을 재분석합니다. </li><li> 인간 myobla가 들어있는 튜브를 풀다.1 개의 15 mL 튜브에 넣고 한 번 씻으십시오. 5 mL의 GM을 넣으십시오. 튜브를 200 xg 및 20 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 흡인하고 상등액을 버린다. </li><li> GM 1 mL에 세포를 Resuspend하고 GM (접시 당 2 X 10 5 셀) 4 ML을 포함 uncoated 6cm 플레이트에 세포를 접시. 37 ° C 및 7 % CO 2 에서 배양하십시오. </li></ol> 4. 셀 유지 관리 <ol><li> 2 일마다 배양액의 절반을 교체하십시오. 배양 접시에서 2 mL의 GM을 제거하고 2 mL의 GM을 첨가한다. 참고 : Myoblast는 배양 조건에 도움이되는 성장 인자를 생성합니다. </li><li> 그들은 pre - differentiation을 피하기 위해 70 - 80 % 합류에 도달하면 세포를 trypsinize. PBS로 한 번 헹구어 준 후 3 분 동안 37 ℃에서 7 % CO 2 에서 0.05 % Trypsin-EDTA 1 mL로 부착 세포 (6-cm 플레이트에서)를 배양합니다. GM 2 mL를 첨가하여 반응을 멈추고 15 mL 튜브에 세포를 수집한다. 원심 분리 후 (200 xg, 5 분), resusGM 1 mL에 세포를 고정 시키십시오. </li><li> 세포 수를 세고 GM 4 mL에 2 x 10 5 세포 / 6 cm 플레이트를 준비하십시오. </li><li> 6 개 통로 인간 근육 아세포를 유지하거나 GM은 10 % DMSO, 용액 당 1 × 106 세포를 함유하는 그들 동결. 점진적 동결 상자 (1 ° C / 분)에서 세포를 고정 시키십시오; 장기간 보관하려면 액체 질소를 넣으십시오. </li></ol> 5. siRNA와 인간 Myoblasts의 Transfection 참고 : Myoblast는 차별화 유도 2 일전에 상업용 형질 전환 시약을 사용하여 형질 감염됩니다. 특정 siRNA가 유전자에 미치는 영향은 항상 대조 siRNA의 효과와 비교됩니다. siRNA는 얼음 위에 보관하고 장갑으로 조작해야하는 이중 가닥 RNA입니다. <ol><li> 6 cm 플레이트 (약 1.5 × 106 세포) 인간 근육 아세포의 80 % 컨 플루 언트 단일 층 - 70를 구합니다. 참고 : 형질 당 5 × 10 개 5 세포는 죄수를 얻기 위해 필요하다GM에서 2 일 후에 transfected myoblasts의 유창한 monolayer. </li><li> 유리 coverslips을 준비 (7 단계에서 칼슘 이미징에 대해 설명). </li><li> 웜 GM, 0.05 % 트립신 -EDTA 및 PBS 37 ° C. </li><li> 불임을 유지하기 위해 레벨 II 조직 배양 후드에서 다음 단계를 모두 수행하십시오. </li><li> 1.5 mL 튜브에서 500 μL의 환원 된 혈청 배지, 3 μL의 형질 전환 시약 및 1 μL의 siRNA를 20 μM로 보내십시오. 부드럽게 혼합하고 실온 (RT)에서 15 ~ 20 분간 유지합니다. </li><li> 이 부화 시간 동안, transfection에 대한 myoblasts를 준비합니다. PBS로 한 번 헹구어 준 후 3 분 동안 37 ℃에서 7 % CO 2 에서 0.05 % Trypsin-EDTA 1 mL로 부착 세포 (6-cm 플레이트에서)를 배양합니다. GM 2 mL를 첨가하여 반응을 멈추고 15 mL 튜브에 세포를 수집한다. 원심 분리 후 (200 xg, 5 분), GM 1 mL에 세포를 재현 탁한다. </li><li> Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 세십시오. </li><li> 5 x 10 5 세포 재현각 transfection ( 즉, 2 transfections, 400 μL에 resuspend)에 대한 GM의 200 μL에서. </li><li> siRNA - transfectant 혼합물의 각 500 μL에 세포 현탁액 200 μL를 추가합니다. 위아래로 두 번 피펫과 RT에서 5 분 품어. </li><li> 유리 coverslip을 포함 3.5cm 문화 요리에 700 μL (세포 + siRNA - transfectant)를 추가합니다. 2 mL의 최종 부피를 얻기 위해 GM을 첨가하십시오. </li><li> 37 ° C 및 7 % CO 2 에서 24 시간이 지난 후 배지를 완전히 신선한 GM 2 mL로 교체하십시오. 또 다른 24 시간 후, 형질 전환 된 세포의 합류 단층이 일반적으로 존재한다; 그렇다면 GM을 2 mL의 분화 배지 (DM; 표 1 )로 대체하여 myoblast 분화를 유도하십시오. </li><li> 분화 유도 후 또는 근섬유를 증식시킨 후 24 - 48 시간 후에 칼슘 이미징 실험을 수행하십시오. 참고 : Immunofluorescence는 일반적으로 분화 유도 후 48 시간에 수행됩니다. </li></ol> 6. Imm분화 마커의 무 형광 형광 염색 참고 : Immunofluorescence 얼룩은 DM에서 48 시간 후에 수행되지만 다른 분화 시간에 수행 할 수도 있습니다. Myogenin과 MEF2는 분화 된 세포에서만 발현되는 핵 단백질로 (myotubes에 융합되기 전), 이들의 염색은 분화 과정을 평가할 수있게합니다. Myosin 중쇄 (MyHC)는 myotubes에서만 발현되며 myotube 크기와 융합 지수 (myotubes에서 핵의 수 / 총 핵의 수)를 추정하는 데 사용됩니다. <ol><li> 48 시간 후, RT에서 PBS 1 mL로 분화 된 세포의 합류 단층을 두 번 씻는다. myotubes를 분리하지 않도록주의 깊게하십시오. </li><li> RT에서 15 분 동안 4 % paraformaldehyde (PFA) 1 ML로 세포를 고정. 5 분 각각 두 번 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 45 분 동안 0.25 % 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 1 mL로 세포를 투과시키고 PBS 1 mL로 3 회 세척한다. </li><li> uns 블록RT에서 30 분 동안 0.2 % Tween-10 및 2 % 염소 혈청 (블록 용액)으로 보충 된 PBS에서 세포를 인큐베이션시킴으로써 비특이적 결합 부위를 제거 하였다. </li><li> 블록 솔루션 (3.5cm 플레이트 당 600μL)으로 희석 한 기본 항체를 준비합니다. 참고 : 다음과 같은 기본 항체가 사용됩니다 : 마우스 anti-myogenin (1 : 600), 토끼 anti-MEF2 (1 : 300) 및 마우스 anti-MyHC 항체 (MF20, 1 : 1,000). 마우스 anti-myosin 중쇄 또는 마우스 anti-myogenin과 같은 차단 용액을 토끼 항 -MEF2와 혼합하는 것이 가능합니다. </li><li> 블록 솔루션을 제거하고 3.5cm 판 당 1 차 항체 용액 600 μL를 첨가하고 밤새도록 4 ℃에서 가온 처리하십시오. </li><li> PBS 1 ML와 세포를 세 번 씻으십시오. 염소 안티 - 마우스 알렉사 488 (1 : 1,000), 염소 안티 - 토끼 알렉사 546 (1 : 1,000), 다음과 같이 블록 솔루션에서 준비 보조 항체 600 μL와 어두운 챔버에서 실온에서 1 시간 품어. 및 DAPI (1:50, 15 μM에서 스톡 용액). CAUTION : DAPI는 장갑으로 처리해야하는 독성 화합물입니다. </li><li> 흡인하고 PBS 1 ML와 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 안티 유리 솔루션과 폴리 비닐 알코올 마운트 매체를 사용하여 유리 coverslips를 탑재. 4 ° C에 보관하고 세포를 영상화 할 때까지 빛으로부터 보호하십시오. </li></ol> 7. 칼슘 이미징 <ol><li> 이전 문화, 직경 25mm 유리 coverslips를 준비합니다. 48 시간 동안 70 % 에탄올에 coverslips을 넣어 커버 슬립에 세포 준수를 줄이는 표면에서 기름과 먼지를 제거합니다. </li><li> 물로 coverslips 여러 번 rinsing 후, 물에 다시 넣고 (autoclaved) 그들을 소독. </li><li> 3.5cm 배양 플레이트 당 하나의 coverslip을 넣고 말리십시오. 더 많은 실험을 위해 페트리 접시를 보관하거나 즉시 사용하십시오. </li><li> 유리 coverslip에 transfected myoblasts (5 - 6 X 10 5 세포)를 추가합니다. 참고 : 실험은 24 시간 - 48 시간 후에 수행됩니다.에, 또는 증식하는 myoblast에. </li><li> 칼슘 2 + 이미징을 수행하려면 실험에 사용되는 매체 (칼슘 함유 매체, 표 3 )와 PBS 또는 직접 매체로 세포를 두 번 씻으십시오. RT에서 어둠 속에서 약 30 분 동안 2 μM Fura-2 / AM plus 1 μM pluronic acid로 세포를 적재하십시오. 참고 : Pluronic acid는 Fura-2를 용해하는 데 도움이됩니다. Fura-2 / AM과 pluronic acid는 calcium-containing medium에 용해되어있다. </li><li> Fura-2 / AM 및 pluronic acid가없는 동일한 배지에서 두 번 세포를 씻고 Fura-2 / AM의 탈 에스테르 화를 고려하여 추가로 10 - 15 분간 어두운 곳에 두십시오. </li><li> Fura-2의 적재 효율이 너무 낮 으면 Fura-2 ( 예 : 4 μM)를 추가하거나 세포를 더 오랫동안 ( 예 : 40 분) 배양하십시오. </li><li> 배양 플레이트에서 coverslip을 제거하고 실험 챔버에 설치합니다. 칼슘 함유 배지 1 mL를 추가하십시오 (실험 물의 부피에 따라 다름)정신 챔버). 현미경 스테이지에 설치하고 녹음을 시작하십시오. 참고 : 형광 칼슘 2 + 감수성 프로브 Fura - 2는 340 nm와 380 nm에서 교대로 여기되며 방출 빛은 510 nm에서 수집됩니다. Ca 2+ 농도의 변동이 비교적 느리기 때문에 2 초마다 1 비율을 획득하십시오. </li><li> SOCE를 활성화하기 위해 다음과 같은 고전적인 thapsigargin / Ca 2+ 재 첨가 프로토콜을 사용합니다. 칼슘이 함유 된 배지에 2-3 분 동안 세포를 남겨 둡니다. 1-2 분 동안 칼슘이없는 배지로 배지를 교체하십시오. <ol><li> 1 μM thapsigargin을 첨가하여 내부 칼슘 저장고를 고갈시킵니다. 참고 : Thapsigargin은 세포질 소포체 Ca 2+ ATPase (SERCA) 펌프 활성의 돌이킬 수없는 차단제입니다 .8 - 10 분 후에는 신속하게 배지를 칼슘 함유 배지로 교체하십시오. Ca 2+ 는 SOCE 채널을 통해 세포에 들어갑니다. 실험을 종료하기 전에 약 5 분간 기다리십시오. 주의 : Thapsigargin은 장갑으로 처리해야하는 독성 화합물입니다. </li></ol></li></ol> 8. 칼슘 2+ 측정 분석 참고 : 수집 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하십시오. <ol><li> 실험을 엽니 다. 세포 (배경 영역)가없는 영역에 영역 1을 그리고 분석 할 세포의 세포질에 다른 영역을 그립니다 (영역은 모든 이미지에서 그릴 수 있습니다 : 340 nm, 380 nm, 또는 비율 이미지). &#39;실험 실행&#39;&gt; &#39;참조 이미지&#39;로 이동하십시오. 340 및 380 채널에서 &quot;지역 1&quot;을 선택한 다음 &quot;배경 빼기&quot;를 클릭하십시오. </li><li> 백그라운드 영역을 통과하는 형광 분진과 같이 백그라운드 영역을 방해하지 않도록 실험 전체를 실행 (F4 : 앞으로)하고 실험 중에는 세포가 움직이지 않도록하십시오. 참고 : 선택한 관심 영역어두운 영역을 포함해서는 안됩니다. 그렇지 않으면 배경의 일부가 측정에 포함되므로 비율 값이 시끄 럽습니다. </li><li> &#39;로그 데이터&#39;를 클릭하고 전체 실험을 다시 재생하십시오. 참고 : 그러면 시간과 비율이 기록되는 스프레드 시트가 열립니다. 340nm 및 380nm 파장을 개별적으로 저장할 수도 있습니다. </li><li> SOCE에 관한 정보를 얻으려면 실험에서 두 가지 중요한 매개 변수 인 Ca 2+ 재 첨가의 진폭과 Ca 2+ 진입 단계의 기울기 ( 그림 3 )를 추출하십시오. </li><li> 칼슘 2 + 상승의 최대 진폭에서 칼슘 2 + 다시 추가 직전의 비율 값을 빼서 진폭을 구하십시오. Ca 2+ 재 첨가 후 첫 번째 초의 선형 회귀 분석을 적용하여 최대 기울기를 얻습니다. 참고 : thapsigargin 반응의 곡선 아래 영역은 또한 extrac에 대한 유익한 매개 변수입니다그것은 SR에 저장된 자유 칼슘의 양을 반영하기 때문이다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.

성체 골격근으로부터의 인간 myoblasts의 분리 및 배양은 근육 분화 및 근육 재생을 연구하는 in vitro 모델을 제공합니다. 이 논문에서, 우리는 간단하고 비용 - 제한된 방식으로 인간 myoblasts의 높은 수율의 정화를 허용 프로토콜을 제공합니다. 또한,이 기술은 고립 된 myoblasts의 비율과 myogenic 차별화의 효율성 측면에서 신뢰성과 재현성 결과를 제공합니다. 사실, 우리는 세포 정렬 후 인간 myoblasts의 약 60 %를 얻었다. 이 세포는 최대 6 계통 (약 30 배)의 배양 조건에서 유지되고 차별화 된 능력을 유지할 수 있습니다. 또한 DM에서 2 ~ 3 일 후에 myoblast 융합이 최대가되어 GM에서 DM으로 배지를 바꾸면 근원적 인 분화가 빠르게 일어난다. 이 모델에서 DM의 2 일 후에 myoblasts의 약 60 %가 myotubes 안으로 융합됩니다. 또 다른 이점은 이들 1 차 사람 세포l 배양은 si...

인간 골격근은 근원 전구 세포의 융합으로 인한 수축성 다핵 근육 섬유 군으로 구성됩니다. 골격 근육은 근섬유 (원형질막)의 원형질 막과 기저 층 (basal lamina) 사이에 위치한 골격근 줄기 세포 인 SC의 존재로 인해 손상 후 재생성 할 수 있습니다. 손상되지 않은 근육에서 SC는 주로 정지 상태에 있습니다. 기계적 스트레스 나 부상에 반응하여 SC는 활성화되고 (myoblast), 증식하고, SC pool 1 , 2 를 보충하기 위해 새로운 myofibers를 형성하기 위해 분화되거나 자체 갱신됩니다. 수년에 걸쳐 골격근 생검에서 SC 및 그 자손 인 myoblast를 분리하기위한 몇 가지 기술이 개발되었습니다. 이 세포들에 표현 된 세포 표면 마커들과 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS) 3 의 방법론에 대한 더 깊은 이해로, 4 , 5 , 이제 근육 샘플로부터 인간 근섬유의 순수 집단을 분리하는 것이 가능합니다. 칼슘 시그널링은 골격근 발달, 항상성 및 재생을 조절합니다. 특히, SOCE라는 세포 내 저장 고갈 다음 활성화되는 칼슘 2 + 항목은 이러한 프로세스에 대한 중요성 6이다. 세포 자극시 endo / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)의 Ca 2+ 수준이 감소하고 세포막 칼슘 이온 채널을 활성화시켜 Ca 2+ 유입을 허용하여 ER / SR 7 을 충전합니다. SOCE에 관여하는 두 가지 주요 단백질은 ER / SR Ca 2+ - 감지 간질 상호 작용 분자 1 (STIM1) 단백질과 원형질막 Ca 2+ 채널 Orai1입니다. 골격 근육은이 두 단백질과 같은 가족의 다른 단백질을 풍부하게 표현합니다 (STIM2 and Orai2-Orai3) 8 , 9 및 transient receptor potential canonical (TRPC) 계열 10 , 11 , 12 , 13의 Ca 2+ 투과성 채널. SOCE 경로를 통한 Ca 2+ 유입은 근육 형성 / 재생에 매우 중요합니다 14 . STIM1 Orai1 또는 단백질 돌연변이 근육 긴장 저하 (15)을 중심으로 이어지는 근육 기능에 해로운 영향을 미친다. SOCE 손상이있는 동물 모델은 또한 근육 질량과 힘을 감소시키고, 피로도를 6 , 16 , 17 로 향상시킵니다. 언급 한 바와 같이, 다른 TRP 채널뿐만 아니라 다른 STIM 및 Orai 단백질은 골격근에서 발현되며, 각각의 역할은 지금까지 결정되지 않았다. 노크 d함으로써그들의 발현 수준을 소유하고 있기 때문에 SOCE에서의 함의와 인간 골격근에서의 역할을 조사 할 수 있습니다. SOCE 측정은 전기 생리 학적 전류 기록과 Ca 2+ 측정의 두 가지 접근법을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 전기 생리학은 확실히 현재의 관심과 그에 관련된 전기 생리 학적 신호를 측정하기 때문에보다 직접적인 방법입니다. 그러나,이 기술은 근육 세포에 적용하기가 매우 어렵습니다. 주로 근육 세포의 크기가 크고 내인성 SOCE 전류가 작기 때문입니다. 세포질 칼슘 촬상 기술적으로 매우 접근이지만, 세포질에서 측정 된 Ca2 + 수준의 칼슘의 유입 2+ 및 재 펌핑 셀로부터 또는 내부 저장에 모두 반영 같이 측정은 간접적이다. 인간의 뼈의 작은 조각으로부터 myoblasts를 분리하는 것을 포함하는 방법론효소 소화, 증폭 및 FACS 후 etal 근육이이 종이에 설명되어 있습니다. 시간이 지남에 따라 차별화 마커의 표현을 따르는 근육 차별화 및 면역 형광 프로토콜의 과정은 18 에 설명되어 있습니다. 마지막으로, SOCE의 측정과 칼슘 2 + 신호 및 골격근 분화에 다른 이온 채널의 역할이 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>햄' s F10</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31550-023</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>Lot 41G5532K</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>O5482</td><td></td></tr><tr><td>fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Corning</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethansone</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴</td><td>시그마</td><td>27900</td><td></td></tr><tr><td>피루브산</td><td>시그마</td><td>P4562</td><td></td></tr><tr><td>우리딘</td><td>시그마</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 0.05%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&nbsp; mL 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15&nbsp; mL 튜브</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5&nbsp; mL tube (FACS)</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Culture medium: OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Transfectant reagnt: RNAiMax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1756064</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 배지</td><td>Fluka</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MyHC *</td><td>DSHB</td><td>MF20&nbsp;</td><td>농축액</td></tr><tr><td>마우스 안티 마이오게닌</td><td>BD Pharmigen</td><td>556358</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티 MEF2</td><td>산타 크루즈 생명공학</td><td>C-21</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 Alexa488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 Alexa 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 휴먼 CD56-Alexa488</td><td>BD Pharmingen</td><td>557699</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 휴먼 CD146-PECy7</td><td>BD Pharmingen 562135</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 휴먼 CD45-PE-CF594</td><td>BD Pharmingen 562279</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 휴먼 CD34-APC</td><td>BD Pharmingen 345804</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 휴먼 CD144-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>560410</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 마우스 IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557702</td><td></td></tr><tr><td>PECy7 마우스 IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 마우스 IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>APC 마우스 IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>550854</td><td></td></tr><tr><td>PE 마우스 IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>556650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>주의:&nbsp; 독성 화합물</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Fluka</td><td>762400</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>주의&nbsp;: 독성 화합물&nbsp;</td></tr><tr><td>비율 이미징 수집 소프트웨어: Metafluor 6.3</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>*&nbsp;: MF 20은 Fischman, D.A.에 의해 DSHB에 기탁되었습니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 myoblast의 분리, myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

위성 세포 (SC)는 근섬유의 원형질 막과 주변 기저 층 사이에 위치한 근육 줄기 세포입니다. 그들은 근육 재생에 필수적입니다. 골격근에서 자주 발생하는 부상시 SC가 활성화됩니다. 그들은 근육 아세포로 증식하고 근육 병변을 치료하기 위해 분화합니다. 근육 분화 동안 일어나는 많은 사건 중에서, 세포질 Ca 2+ 신호는 매우 중요합니다. Ca 2+ 신호는 Ca 2+ 가 내부 Ca 2+ 저장소에서 방출 될뿐만 아니라 세포 외부 공간에서 칼슘 2+ 가 들어간 것, 특히 상점 운영 Ca 2+ 입구 (SOCE)에서 발생합니다. 이 논문은 정형 외과 수술 후 수집 된 근육 샘플로부터 인간 근섬유의 순수한 집단을 얻기 위해 사용 된 방법을 설명합니다. 조직은 기계적 및 효소 적으로 소화되며, 세포는 증폭되어 speci의 존재에 따라 유동 세포 계측법에 의해 분류된다fic 막 마커. 일단 얻은 인간의 myoblasts 확장 및 배양 매체에서 성장 인자를 제거하여 차별화에 전념. 특정 전사 인자 및 시험 관내 면역 형광의 발현 수준은 대조 조건 및 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 정지시킨 후에 근원적 인 분화 과정을 평가하는데 사용된다. 마지막으로, Fura-2의 비율을 SOC의 신뢰성 있고 재현성있는 측정을 제공하는 비율 계 Ca 2+ 프로브로 사용합니다.

인간 근육 샘플의 효소 해리 후, 세포는 GM에서 증폭되었다. CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- 세포로 정의 된 사람의 myoblasts는 FACS 후에 얻어졌다. Myoblast는 분석 된 인구의 60 % 이상을 차지했습니다 ( 그림 1 ). 일차 인간의 myoblasts는 재결합, 합류로 성장하고, DM에서 48 시간 동안 배양했다. 전사 인자 MEF2와 근육 특이 적 단백질 myosin heavy chain (MyHC)의 발현에 대한 면역 염색 후 융합 지수가 60.9 ± 1.3 % 인 세포가 대다수의 세포 에서 Myotubes in MyHC 양성 세포 (MyHC 양성 세포) (n = 5, 그림 2 ). 우리는 예비 세포라고 불리는 인간 근섬유의 약 40 %가이 말단 분화를 피하고 미분 화 단핵구 세포로 남아 있음을 관찰했다. 기능적 연구를 위...

여기, 우리는 성인 근육 조직에서 인간 myoblasts의 순수 인구를 얻기위한 방법을 설명합니다. 이 세포들은 생체 외 골격근 분화를 연구하고, 특히 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 연구하는데 사용됩니다.

인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

이 절차의 전반적인 목표는 성인 골격근에서 인간 근모세포의 순수 집단을 얻는 것입니다. 이 세포들은 근분화 평가 및 저장소 작동 칼슘 유입 측정과 같은 기능 연구에 사용됩니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 일차 근모세포를 신속하고 간단하며 재현성 있게 분리할 수 있다는 점입니다.이 근아세포들은 근육 재생 과정 중의 칼슘 신호 전달을 연구하기 위한 새로운 ex-vivo 모델입니다. 이 방법은 근육 분화 과정에 관여하는 이온 채널과 전사 인자를 식별하는 것과 같이 근육 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 방법은 인간 근원성 분화 과정 중의 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.또한 근이영양증 치료를 위한 근원성 줄기세포 활용 가능성과 같은 다른 연구에도 적용할 수 있습니다. 근육 샘플을 멸균된 6cm 플레이트로 옮기고, PBS로 샘플을 두 번 세척합니다. 남아 있는 지방 조직을 제거하고 샘플의 무게를 측정합니다.다음으로, trypsin을 첨가하고 근육을 2 mm 미만의 크기로 잘게 다집니다. 다진 후, 10 mL 피펫을 사용하여 조직을 교반 바가 들어 있는 200 mL 해리 병에 옮기고, 해리 병의 내용물이 90 mL가 될 때까지 trypsin 용액에 다진 조직을 계속 수집합니다. 이제 조직을 37 °C의 항온 수조에서 부드럽게 교반하며 60분 동안 배양합니다.1시간 후, 반응을 중단시키기 위해 10 milliliters의 FCS를 첨가하고 트리튜레이션(trituration)을 통해 혼합물을 균질화합니다. 이제 두 개의 50 milliliter 튜브에 70 micron 스트레이너를 장착하고, 세포 현탁액의 절반씩을 피펫팅하여 각 스트레이너에 통과시킵니다. 그다음, 성장 배지에서 세포 현탁액을 만들고 6 centimeter 플레이트에 4 milliliters의 배지와 함께 200, 000개의 세포를 분주합니다.배지를 3일마다 교체하며 플레이트를 배양합니다. 5~7일 후, 세포의 밀도가 70%~80% 정도 되었을 때 염색을 진행합니다. 먼저, 합류된 세포가 있는 플레이트를 PBS로 헹굽니다.그 다음, trypsin 용액 1 mL를 첨가하고 효소가 작용하도록 3분 동안 둡니다. 배지 2 mL를 첨가하여 반응을 중단시키고 세포를 15 mL 튜브에 수집합니다. 그런 다음, 세포를 원심 분리하여 가라앉히고 1 mL의 배지에 다시 부유시킵니다.다음으로, 세포를 얼음 위에 보관하면서 세포 수를 측정합니다. 분석을 위해, 7개의 튜브에 각각 100,000개의 세포를 분주합니다. 나머지 세포는 분리를 위해 8번째 튜브에 담습니다.차가운 fax buffer 1 mL로 세포를 세척한 다음, 튜브를 원심분리하고 상층액을 흡입하여 제거합니다. 적절한 항체가 포함된 fax buffer 200 µL를 다시 첨가하고 세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 세포를 다시 세척하고 500 µL의 fax buffer에 재현탁한 다음, 유세포 분석기를 사용하여 세포를 분류합니다.CD45 양성 조혈 세포를 제외한 후, CD56 발현을 기준으로 CD45 음성 세포를 분리하십시오. 그런 다음, CD56 양성 집단에서 CD34, CD144 및 CD146을 게이팅하십시오. 순도를 확인하기 위해 분리된 집단의 일부를 다시 분석하십시오.이제 인간 근아세포를 꺼내어 5 mL의 배지로 세척합니다. 그다음 1 mL의 배지로 다시 현탁합니다. 이 현탁액을 4 mL의 배지가 들어 있는 6 cm 플레이트로 옮기고 37 °C, 7% CO2 조건에서 배양합니다.이 절차를 위해 배양된 근아세포를 준비하고 신선한 형질전환 배지를 제조하십시오. 배지를 실온에서 15분에서 20분 동안 배양하십시오. 배지가 배양되는 동안 근아세포를 준비하십시오.먼저, PBS로 한 번 헹굽니다. 그런 다음, 부착 세포를 트립신 처리합니다. 배지 2 mL를 첨가하여 반응을 중단시킵니다.그 다음, 세포를 50 mL 튜브에 수집합니다. 원심분리하여 침전시킨 후 1 mL의 배지로 재현탁합니다. 각 형질전환당 200 µL의 배지에 500,000개의 세포를 준비합니다.각 500 µL의 transvection 배지에 세포 200 µL 분량을 첨가한 후, 피펫 건을 두 번만 작동시켜 혼합합니다. 그런 다음, 실온에서 5분 동안 반응이 진행되도록 둡니다. 5분 후, 유리 커버슬립이 하나씩 들어 있는 3.5 cm 배양 접시에 반응액을 옮깁니다.다음으로, 최종 부피가 2 mL가 되도록 배지 1.3 mL를 추가하고 디쉬를 배양합니다. 48시간의 분화 후, 세포를 면역 염색하거나 칼슘 이미징을 통해 분석할 수 있습니다. 두 방법 모두 먼저 상온의 PBS 1 mL를 사용하여 세포를 두 번 조심스럽게 세척합니다.근관(myotube)이 떨어지지 않도록 주의하십시오. 칼슘 이미징을 위해, 세척된 세포에 2 µM fura-2 AM과 1 µM threonic acid가 포함된 칼슘 함유 배지를 처리합니다. 그 후, 혼합하기 전 약 30분 동안 배양합니다.다음으로, 변형되지 않은 칼슘 함유 배지로 세포를 두 번 세척한 후, 에스테르화를 위해 10~15분 동안 배양합니다. 이제 배양 플레이트에서 커버슬립을 제거하여 실험 챔버에 장착합니다. 챔버에 칼슘 함유 배지를 채우고 현미경 아래에 놓은 다음, 데이터 기록을 시작합니다.Fura-2는 340 및 380 nm에서 교대로 여기됩니다. 방출광은 510 nm에서 수집됩니다. 340 nm 이미지들을 380 nm 이미지들로 나누어 이미지 비율을 구하며, 변동과 칼슘 농도가 비교적 낮으므로 2초마다 한 번씩 이미지 비율을 획득합니다.2~3분 후, 배지를 칼슘이 없는 배지로 교체합니다. 그런 다음 1~2분 동안 세포 내 저장성 칼슘(store operated calcium)의 활성을 모니터링합니다. 이어서, 세포 내 칼슘 저장고를 고갈시키기 위해 1 µM thapsigargin을 세포에 첨가합니다.8분에서 10분 동안 대기한 후, 배지를 칼슘 함유 배지로 신속하게 교체하고 칼슘이 suc 채널을 통해 세포 내로 유입되는 동안 5분 동안 기록합니다. 실험을 종료한 후 이미지를 분석합니다. 배경을 정의하는 영역 1로는 세포가 없는 영역을 선택하고, 영역 2로는 세포질 내의 영역을 선택합니다.두 영역은 시리즈 내의 어떤 이미지상에서도 지정할 수 있습니다. 다음으로, '실험 실행(run experiments)' 탭으로 이동하여 340 및 380 채널의 참조 이미지를 선택하고, 영역 1을 선택한 후 '배경 제거(subtract background)'를 클릭하십시오. 이제 전체 실험을 실행하여 모든 이미지에서 배경을 제거합니다.완료되면 데이터 기록(log data) 옵션을 클릭하여 시간과 비율 데이터가 기록되는 스프레드시트를 엽니다. 근세포를 배양하여 증식시킨 후 FACS를 사용하여 분리하였습니다. 분석된 세포 집단의 60% 이상이 근아세포(Myoblasts)였습니다.이후 일차 배양된 인간 근아세포를 분화 배지에서 배양하고, 전사 인자인 MEF2 및 마이오신 중쇄 단백질에 대해 면역 염색을 실시하였습니다. 대다수의 세포에서 마이오신 중쇄가 발현되었으며, 약 60%의 융합 지수 값을 갖는 근관을 형성하였습니다. 나머지 40%의 세포는 예비 세포로 알려진 분화되지 않은 단핵 세포 상태로 남아 있었습니다. 서술된 저장성 작동 칼슘 유입 실험이 분화된 세포에서 성공적으로 수행되었습니다.TRPC 패밀리의 칼슘 투과성 채널을 표적으로 하는 소간섭 RNA가 형질전환된 세포에서 동일한 실험을 수행한 결과, 넉다운이 저장고 작동 칼슘 유입(store operated calcium entry)에 측정 가능한 영향을 미쳤음을 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 성인 골격근에서 인간 근아세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 우리는 이 세포들을 사용하여 근육 분화의 연속적인 단계, 특히 전사 인자와 칼슘 채널의 불활성화를 연구합니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이는 인간 근아세포(myoblasts)의 수율을 얻을 수 있는 신속하고 간단하며 재현 가능한 방법입니다. 이 절차를 수행할 때는 근아세포 배양물이 완전한 합류(full confluence) 상태에 도달하지 않도록 하는 것이 중요한데, 그렇지 않으면 원치 않는 자발적 분화가 일어나기 때문입니다.

isolation-human-myoblasts-assessment-myogenic-differentiation-store

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

근육 세포는 가장 복잡한 진핵 세포 중 하나입니다. 우리는 모든 발달 단계에서 유전자 조작과 명확한 이미징을 가능하게 하는 고도로 성숙한 근섬유의 체외 분화를 위한 프로토콜을 제시합니다.

라이브 영상에 대한 성숙한 근섬유의 체외 분화

근세포는 다핵근화 된 myotubes를 형성하고 결국 골격 근섬유를 형성하기 위해 분화 전구세포를 증식시. 여기에서, 우리는 젊은 성인 마우스 골격 근육에서 1 차적인 근분의 능률적인 격리 그리고 문화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 배양에서 근육 세포의 분자, 유전 및 대사 연구를 가능하게합니다.

마우스 골격 근 이식에서 기본 근구의 격리 및 분화

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&amp;50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

여기서 엡스타인 바 바이러스에서 내인적으로 발현된 RYR1 돌연변이의 기능적 효과를 연구하는 데 사용되는 방법은 인간 B-림프구및 근육 생검 유래 위성 세포가 심투로 분화되어 설명된다.

내인성 표현 인간의 RYR1 변종의 기능적 특성화

이 원고는 수축력 및 칼슘 취급 분석을 포함하여 기능분석에서 3D 인간 골격 근 미세 조직 및 최소 침습 다운스트림의 배열을 생성하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 골격 근육 미세 조직에서 골격 근육 건강의 기능 메트릭 평가

우리는 성인 마우스의 6개 근육에서 다양한 길이와 유형의 효소로 해리된 섬유를 얻기 위한 프로토콜을 설명합니다: 그 중 3개는 이미 설명되었고(flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) 그 중 3개는 처음으로 성공적으로 해리되었습니다(extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

생쥐의 6개 뒷다리 근육의 효소 해리로 얻은 온전한 짧은, 중간 및 긴 골격근 섬유: Beyond Flexor Digitorum Brevis

이 프로토콜은 조직 해리, 순차적 여과, 사전 플레이트 및 정의된 배양 조건을 통해 성체 및 신생아 마우스 골격근에서 1차 근모세포를 분리하고 농축하는 표준화된 방법을 제공하여, 위성 세포 유래 근아세포 배양을 하위 실험 응용으로 구축하고 유지할 수 있게 합니다.

시험관 내 근형성 연구를 위한 골격근 위성 세포 분리

학습하세요 성인 골격근에서 인간 마이오블라스트를 분리하고 근원성 분화를 평가하며 저장 운영 칼슘 항목을 측정하는 방법을. 이 기술은 근육 재생 과정에서 칼슘 신호 전달을 연구하는 데 활용됩니다.

인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

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