인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

이 절차의 전반적인 목표는 성인 골격근에서 순수한 인간 근아세포 집단을 얻는 것입니다. 이 세포는 근육 분화 평가 및 상점에서 운영되는 칼슘 유입 측정과 같은 기능 연구에 사용됩니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 1차 근아세포를 빠르고 간단하며 재현 가능하게 분리할 수 있다는 것입니다.

이 근아세포는 근육 재생 중 칼슘 신호를 연구하기 위한 새로운 생체 외 세포입니다. 이 방법은 근육 분화 중에 관련된 이온 채널 및 전사 인자 식별과 같은 근육 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 인간의 근육 분화 동안 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

또한 근육 이영양증을 치료하기 위해 근육 줄기 세포를 사용할 가능성과 같은 다른 연구에 적용될 수 있습니다. 근육 샘플을 멸균 된 6cm 플레이트로 옮기고 PBS로 샘플을 두 번 씻습니다. 남아 있는 지방 조직을 제거하고 샘플의 무게를 잰다.

다음으로 트립신을 넣고 근육을 2mm 미만의 작은 조각으로 다집니다. 다진 후에는 10ml 피펫을 사용하여 조직을 교반 막대가 들어 있는 200ml 해리 병에 옮긴 다음 해리 병이 90ml로 채워질 때까지 트립신 용액에서 다진 조직을 계속 수집합니다. 이제 섭씨 37도의 수조에서 60분 동안 부드럽게 저어주면서 조직을 배양합니다.

한 시간 후 10ml의 FCS를 첨가하여 반응을 중지하고 분쇄를 사용하여 혼합물을 균질화합니다. 이제 70미크론 스트레이너를 두 개의 50밀리리터 튜브에 로드하고 현탁액을 필터에 피펫으로 삽입하여 각 스트레이너를 통해 셀 현탁액의 절반을 통과시킵니다. 다음으로, 성장 배지에서 세포의 현탁액을 만들고 4 밀리리터의 배지를 가진 6 센티미터 플레이트에 200, 000 세포를 플레이트합니다.

플레이트를 배양하고 3일에 한 번씩 배지를 교체하십시오. 5-7일 후에 세포는 70-80% 융합되어야 하며 염색해야 합니다. 먼저 PBS로 합류 세포의 플레이트를 헹굽니다.

그런 다음 트립신 용액 1ml를 넣고 효소가 3분 동안 작용하도록 한다. 2ml의 배지를 첨가하여 반응을 중지하고 15ml 튜브에 세포를 수집합니다. 그런 다음 세포를 스핀다운하고 1ml의 배지에 다시 현탁시킵니다.

다음으로, 얼음 위에 세포를 보관하는 동안 세포 수를 계산합니다. 사실 분석을 위해, 각각 100, 000개의 세포를 가진 7개의 관을 적재하십시오. 분류를 위해 나머지 셀을 여덟 번째 튜브에 로드합니다.

1ml의 콜드 팩스 버퍼로 세포를 세척한 다음 튜브를 원심분리하고 상층액을 흡인하여 버립니다. 적절한 항체와 함께 200마이크로리터의 팩스 버퍼를 다시 추가하고 세포가 얼음 위에서 30분 동안 배양되도록 합니다. 30분 후 세포를 다시 세척하고 500마이크로리터의 팩스 버퍼에 다시 현탁시킨 다음 유세포 분석기를 사용하여 세포를 분류합니다.

CD45 양성 조혈 세포를 배제한 후, CD56 발현에 따라 CD45 음성 세포를 분리합니다. 그런 다음 CD34, CD144 및 CD146에 대한 CD56 양성 모집단을 게이트합니다. 순도를 확인하기 위해 정렬된 모집단의 일부를 다시 분석합니다.

이제 인간 근 아세포를 당겨 5 밀리리터의 배지로 씻으십시오. 그런 다음 1 밀리리터의 매체에 다시 매달아 놓습니다. 현탁액을 4밀리리터의 매체가 있는 6cm 플레이트로 옮기고 섭씨 37도에서 플레이트를 7%의 이산화탄소로 배양합니다.

이 절차를 위해 근아세포를 배양하고 새로운 형질주입 배지를 만듭니다. 배지를 실온에서 15-20분 동안 배양합니다. 배지 배양 중에 근아세포를 준비합니다.

먼저 PBS로 한 번 헹굽니다. 그런 다음 부착 세포를 트립신화합니다. 2ml의 배지를 추가하여 반응을 중지합니다.

그런 다음 세포를 50ml 튜브에 모은다. 스핀다운하고 1밀리리터의 매체에 다시 매달아 놓습니다. 각 transvection를 위해, 매체의 200 microliters에 있는 500, 000의 세포를 준비하십시오.

각 500마이크로리터의 transvection medium에 200μl의 세포 분취액을 추가한 다음 피펫 건을 두 번만 사용하여 혼합합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 반응을 진행하십시오. 5분 후, 각각 하나의 유리 커버 슬립이 들어 있는 3.5cm 배양 접시에 반응을 옮깁니다.

다음으로, 1.3ml의 배지를 추가하여 최종 부피 2ml를 만들고 접시를 배양합니다. 48시간 분화 후 세포를 면역염색하거나 칼슘 이미징을 사용하여 분석할 수 있습니다. 두 옵션 모두 먼저 실온 PBS 1ml를 사용하여 세포를 두 번 조심스럽게 세척하여 세척합니다.

근관을 분리하지 않도록 하십시오. 칼슘 이미징을 위해 세척된 세포를 칼슘 함유 배지에 2개의 마이크로몰 푸라-2 AM과 1개의 마이크로몰 트레온산으로 덮습니다. 그런 다음 섞기 전에 약 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 변형되지 않은 칼슘 함유 배지로 세포를 두 번 세척한 다음 에스테르화를 위해 10-15분 동안 배양합니다. 이제 배양 플레이트에서 커버 슬립을 제거하고 실험실에 설치하십시오. 챔버에 칼슘 함유 매체를 로드하고 현미경 아래에 놓은 다음 데이터 기록을 시작합니다.

Fura-2는 340 및 380 나노 미터에서 교대로 여기됩니다. 방출광은 510나노미터에서 수집됩니다. 340 나노미터 이미지를 380 이미지로 다이빙하여 변동 및 칼슘 농도가 상대적으로 낮기 때문에 이미지 비율을 제공하고 2초에 한 번씩 이미지 비율을 획득합니다.

2-3분 후에 배지를 칼슘이 없는 배지로 교체하십시오. 그런 다음 1-2분 동안 세포에서 저장으로 작동하는 칼슘의 활동을 모니터링합니다. 다음으로, 세포에 1마이크로몰 탑시가르진을 첨가하여 내부 칼슘 저장량을 고갈시킵니다.

8-10분 정도 기다린 다음 배지를 칼슘 함유 배지로 빠르게 교체하고 칼슘이 suc e 채널을 통해 세포에 들어가는 동안 5분 동안 기록합니다. 실험을 종료한 후 이미지를 분석합니다. 배경을 정의하는 영역 1에 대해 셀이 없는 영역을 선택한 다음, 영역 2에 대한 세포질에서 영역을 선택합니다.

두 영역은 시리즈의 모든 이미지에 그릴 수 있습니다. 그런 다음 run experiments(실험 실행) 탭으로 이동하여 340 및 380 채널에 대한 참조 이미지를 선택하고 영역 1을 선택한 다음 subtract background(배경 빼기)를 클릭합니다. 이제 전체 실험을 실행하여 모든 이미지에서 배경을 제거합니다.

완료되면 로그 데이터 옵션을 클릭하여 시간과 비율 데이터가 기록된 스프레드시트를 엽니다. 근육 세포를 성장시키고 증식시키고 팩스를 사용하여 분류했습니다. 근아세포는 분석된 인구의 60% 이상을 차지했습니다.

그런 다음 1차 인간 근아세포를 분화 배지에서 배양하고 MEF2 및 미오신 중쇄 단백질의 전사 인자에 대해 면역염색했습니다. 대다수의 세포는 미오신 중쇄를 발현하고 융합 지수 값이 약 60%인 근관을 형성했으며, 나머지 40%의 세포는 예비 세포라고도 하는 미분화 단핵 세포로 남아 있었습니다. 설명된 매장 운영 칼슘 진입 실험은 분화된 세포에 대해 성공적으로 수행되었습니다.

TRPC 계열의 칼슘 투과 채널에 대해 지시된 작은 간섭 RNA로 transveced 세포에 대해 동일한 실험을 수행하면 knockdown이 상점에서 작동하는 칼슘 유입에 측정 가능한 영향을 미쳤음을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 성인 골격근에서 인간 근아세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 우리는 이 세포를 사용하여 근육 분화의 연속적인 단계, 특히 전사 인자와 칼슘 채널의 비활성화를 연구합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이는 인간 근아세포의 수율을 얻는 빠르고 간단하며 재현 가능한 방법입니다. 이 절차를 시도하는 동안에는 원치 않는 자발적 분화가 발생하므로 근아세포 배양이 완전한 신뢰에 도달하는 것을 방지하는 것이 중요합니다.