Name: 인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 배우세요 타우 단백질의 인산화 및 미세소관 결합 분석 방법을 대장암 세포에서 공초점 현미경으로 수행하는 기술입니다. 이 프로토콜은 암 및 치매 연구에 활용됩니다.

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이 연구 프로젝트의 일환 '개발 및 해양 미세에서 높은 가치 화장품 원료 물질의 산업화' 라는, 지원 사역의 바다와 수 산, 한국, 그리고 교내 그랜트 (2Z04930)에 의해 지원 되었다 수행 되었다 KIST 강릉 연구소 천연 제품.

1. 시 약의 준비 프로 테아 제 억제 물 칵테일 솔루션, <ol><li>추가 10 µ L (1 mM) phenylmethylsulfonyl 불 소 솔루션, 10의 µ L (1 x 100 x 사진에서)와 인산 가수분해 효소의 10 µ L (1 x 100 x 사진에서) 완전 한 RIPA 세포의 용 해 버퍼 준비 1 x radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼의 1 mL에 억제 물 칵테일 솔루션.</li>
	<li>준비 10 일반 tubulin 버퍼 (PEM) 버퍼 x.
	<ol><li>추가 800 mM (6.0474 g) piperazine-N-N &#39;-두번째-2-ethanesulfonic 산, 10 m m (95.1 mg) 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N &#39;, N &#39;-tetraacetic 산, 10 m m (51 mg) MgCl 2 및 50 mL 튜브에 1.25 M (10 M 3 mL) NaOH 15 mL 증 류 물으로 혼합 하 고 소용돌이 사용 하 여 해산. PH (6.9 이어야 한다)을 확인 합니다. 만약 pH &#62; 6.9, 버퍼를 삭제 하 고 신선한 많은 리 메이크. 
		참고: NaOH를 pH 6.9 오버 슈트 하지 않습니다 보장 하기 위해 1.25 M 미만 이어야 합니다. HCl을 사용 하 여 pH를 조정 하는 권고 하지 않습니다 &#62; 6.9.</li>
		<li>추가 NaOH pH 6.9까지에 dropwise입니다. 증류수 10 X PEM 버퍼의 최대 25 mL을 추가 합니다. 마지막으로, 주사기와 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 필터링 합니다. 1.5 mL 튜브에 aliquots로이 버퍼를 분할 하 고 저장 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>준비 5 환 원제와 염료 샘플 버퍼 x.
	1의 <ol><li>믹스 300 µ L (60 밀리미터) M Tris-HCl (pH 6.8), 50% 글리세롤, 10% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 및 1.2 mL 증 류 물 1 mL (2%)의 2.5 mL (25%) SDS 샘플 버퍼 x 5의 5 mL을 만들기 위해. 에 저장 &#8722; 20 ° c. 
		참고: 글리세롤 점성 때문에 1.25 mL 측정 글리세롤이 어렵습니다. 100% 글리세롤의 1 mL 1.26 g 무게. 따라서, 100% 글리세롤의 1.575 g의 무게 (는 100%의 1.25 mL 같음 또는 50% 글리세롤의 2.5 mL) 15 mL 튜브. 다른 구성 요소와 잘 혼합.</li>
	</ol></li></ol> 2. 세포 문화, Curcumin와 치료 또는 LiCl 치료 및 검사의 단백질 표정 <ol><li>추가 1 ~ 10 6 HCT 116 셀 x 100 m m로 조직 문화 요리는 최소 필수 미디어 (MEM) 10% 태아 소 보충 혈 청 (FBS) 그리고 1% 페니실린-스. 경작의 어느 날, 후 셀 60-70%의 합류를 도달할 것 이다. 
	참고: 필요한 격판덮개의 수는 아래에서 설명 하는 치료의 수에 따라 다릅니다.</li>
	<li>셀 ~ 65% 합류 (현미경 검사 법을 사용 하 여 접근)에 도달, MEM 보완 매체를 제거 하 고 혈 청 무료 메모리와 5 µ M, 10 µ M, 그리고 30 µ M curcumin 또는 25 m m, 50mm, 100mm LiCl 추가 하는 때. 포함 된 5% CO 2 습도 분위기에서 24 h 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>치료 후 24 h 1 mL 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 셀 세척 하 고 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 다쳤어요. 1.5 mL로 긁힌 것된 셀 튜브 원심과 1800 x g 세포 알갱이를 4 ° C에서 4 분 동안 원심 전송.</li>
	<li>는 정기적으로 튜브를 도청 하는 동안 20 분에 4 ° C에서 완전 한 RIPA 버퍼의 100 µ L에 펠 릿을 일시 중단 하 여 세포를 lyse. 간단히 샘플을 sonicate.</li>
	<li>4 시 20 분에 대 한 22,570 x g에서 벤치탑 원심 분리기에 셀 homogenates 원심 ° c.를 피 펫을 사용 하 여 다른 레이블된 튜브는 supernatants 전송.</li>
	<li>상업 단백질 분석 실험 키트를 사용 하 여 Bradford 분석 결과 45는 supernatants의 단백질 농도 측정.</li>
	<li>4 세포 lysates의 동일한 단백질 농도 (10 µ g 단백질/13 µ L 샘플)의 준비 샘플 X SDS 겔-로딩 버퍼입니다. 4 x 400 m m dithiothreitol (DTT) 포함 된 신선한 SDS 겔-로딩 버퍼 준비. 
	참고:이 단계에서 샘플에 저장 될 수 &#8722; 필요한 경우 20 ° C.</li>
	<li>품 5 분 100 ° C에서 열 블록에 샘플 소용돌이 사용 하 여 샘플을 혼합 하 고 10 ~ 15에 대 한 그들을 기다리는 분</li>
	<li>어셈블 전기 시스템입니다.
	<ol><li>부하 10 µ g 단백질 (13 µ L 샘플) 10% SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 대 한에 잘 당. 로드 한 차선에 젤에 분자 무게 사다리. 
		참고: 전기 시작, 단백질 사다리의 명백한 분자 무게 단백질 밴드에 해결 됩니다. 이 밴드를 사용 하 여 알 수 없는 단백질 밴드의 분자 무게를 예측할.</li>
		<li>샘플을 로드 한 후 일정 한 전압을 유지 하기 위해 전원에 전기 시스템의 긍정 및 부정적인 전극 연결. 처음, 해결 젤으로 겹쳐 쌓이는 젤에서 단백질 견본 이동 70 V 20 분에 시작 합니다. 그런 다음, 샘플 및 단백질 사다리 젤의 끝에 도달할 때까지 약 70-120 분 125 V로 전압을 증가.</li>
		<li>젖은 electroblotting 시스템을 사용 하 여 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 젤 전기 이동 법의 완성 후 전송. 전송 블록 대 100 ~ 100 분 약 25의 상 온에서 90 분 동안 4% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 블로킹 버퍼에 막 ° c.</li>
	</ol></li> <li>분자 무게 사다리 옆에 그것을 절단 하 여 오 점 표시. 투명 한 플라스틱 시트와 날카로운 커터를 사용 하 여 절단 오 점. (1:5, 000에서 안티 타우, 안티-인-타우 1:4, 000에서) 1 차 항 체 솔루션을 준비 하 고 하룻밤 4 ° C에서이 솔루션에 오를 품 어.</li>
	<li>하룻밤 부 화 후 7 분 오 점 4 번에에서 씻어 인산 염 버퍼 식 염 수-트윈-20 (PBST) 솔루션.</li>
	<li>관련 2 차 항 체 솔루션 (염소 안티 토끼 또는 반대로 마우스 IgG 1:5, 000에서), 준비 하 고 4 시간, 7 분 PBST에 약 25 ° C. 세척의 실 온에서 90 분 동안이 솔루션에서 얼룩을 품 어.</li>
	<li>개발 제조 업체에 따르면 화학 키트를 사용 하 여 오 &#39; s 권고. 투명 한 비닐 포장을 사용 하 여 얼룩을 커버. 이미징 시스템 관련 소프트웨어와 화학을 위한 화학에 의해 이미지를 수집.</li>
</ol> 3. 인산 가수분해 효소 분석 결과 <ol><li>알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼에 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 (2.5 단계)에서 세포 lysates 치료.
	<ol><li>모두 제어 및 치료 샘플, 준비 20 µ L 포함 20 µ g 총 단백질을 샘플링 합니다. 20 µ g 총 단백질, 2 µ L 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼 및 10 µ L 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 포함 하는 세포 lysates의 볼륨을 추가 합니다. 증류수 20 µ L을 만들기 위해 추가.</li>
	</ol></li> <li>1 h. 50 m m의 최종 농도에 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 추가 하 여 또는 10 m m의 최종 농도에 나트륨 orthovanadate (나 3 VO 4) 추가 하 여 반응을 중지에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어. 반응 5 분에 75 ° C에 난방에 의해 중지 됩니다 수</li>
	<li>인산 가수분해 효소와 부 화 완료, 전에 인산 가수분해 효소 처리 샘플 비교에 대 한 인산 가수분해 효소를 추가 하지 않고 같은 농도의 샘플을 준비.</li>
	<li>추가 갓된 4 X SDS 겔-로딩 버퍼 400mm DTT를 포함.</li>
	<li>는 소용돌이 사용 하 여 샘플 5 분 믹스 100 ° C에서 열 블록에 샘플을 품 어. 멋진 대 한 실 온에서 ~ 10-15 분</li>
	<li>SDS 페이지 10 %polyacrylamide 젤을 실행 하기 위한 전기 영동 시스템 조립.
	<ol><li>10 %polyacry 잘 당 부하 10 µ g 단백질 (13 µ L 샘플)lamide 젤입니다. 분자 무게 사다리 로드.</li>
		<li>샘플을 로드 한 후 일정 한 전압을 유지 하기 위해 전원에 전기 시스템의 긍정 및 부정적인 전극 연결. 처음, 해결 젤으로 겹쳐 쌓이는 젤에서 단백질 견본 이동 70 V 20 분에 시작 합니다. 그런 다음 125 V로 전압을 증가 하 고 약 70-120 분 젤 샘플 및 단백질 사다리 젤의 끝에 도달할 때까지 실행.</li>
		<li>전송 젖은 electroblotting 시스템을 사용 하 여 PVDF 막에 젤 전기 이동 법의 완성 후. 대 100 ~ 100 분에 대 한 전송</li>
		<li>분자 무게 사다리에 잘라 작은 함으로써 오 점을 표시 합니다. 투명 한 플라스틱 시트와 날카로운 커터를 사용 하 여 오 점 절단.</li>
	</ol></li> <li>실 온에서 90 분 동안 4 %BSA 블로킹 버퍼에 막 차단.</li>
	<li>하룻밤 4 ° C에서 1 차 항 체 용액 (1:5, 000에서 안티 타우)에 오를 품 어. 7 분 PBST에 오 점 4 번 씻어.</li>
	<li>관련 2 차 항 체 솔루션 (염소 반대로 마우스 IgG 1:5, 000에서), 준비 하 고 실 온에서 90 분 동안 오를 품 어. PBST에 4 시간, 7 분 세척.</li>
	<li>개발 제조 업체에 따르면 화학 키트를 사용 하 여 오 &#39; s 권고. 투명 한 플라스틱 포장 내 오 점 커버. 이미징 시스템 관련 소프트웨어와 화학을 위한 화학에 의해 이미지를 수집.</li>
</ol> 4. Microtubule 바인딩 분석 결과 <ol><li>microtubule 바인딩 분석 결과 대 한 단계를 반복 2.1 2.6.</li>
	<li>준비 1 (2 mL) PEM 10 X PEM 버퍼에서 버퍼 X 4 ° C에서 20 µ M (40 µ L) paclitaxel 1 m m (20 µ L) GTP를 추가 하 여 저장. 박을 microtubule (MT)에서 &#8722; 80 ° C 냉동 고에서 대장균 타우 작업 재고 &#8722; 20 ° C 냉장고.</li>
	<li>표 1에 의하여 샘플 준비.</li>
	<li>100000 x g에서 60 분 동안 25 ° C에서 30 분 Ultracentrifuge에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>전송 120 µ L 포함 supernatants의 언바운드 타우, 청소 하 고 튜브.</li>
	<li>5 X의 추가 120 µ L (상쾌한와 동일한 볼륨) 버퍼를 포함 하는 바인딩된 타우 펠 릿을 시음 하 고 철저 하 게 혼합. 레이블이 지정 된 튜브를 청소 하 여 철저 하 게 혼합 솔루션 전송.</li>
	<li>단백질 농도 측정 (단계 2.6 참조). 
	참고: 샘플을 준비 하는 동안 사용 하 여 솔루션 (단계 4.6)의 볼륨 펠 릿과 상쾌한 샘플 준비.</li>
	<li>해당 단백질 농도의 샘플을 준비 하 고 갓된 4 SDS 겔-로딩 버퍼 DTT (400mm)를 포함 된 배 추가. 
	참고: 샘플에 저장 될 수 있다 &#8722;이 단계에서 20 ° C.</li>
	<li>3.5-3.10 단계 반복.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>샘플</td> <td colspan="2"> 이름</td> <td colspan="2"> Microtubule 필요 </td> <td colspan="2"> 주요 단백질 필요</td> <td colspan="2"> PEM-GTP-PTX</td></tr> <tr><td>1</td> <td colspan="2"> HCT 116-제어 (6.21 μ g/μ)</td> <td colspan="2"> 2 μ</td>
			<td colspan="2"> 9.66 μ (60 μ g)</td>
			<td colspan="2"> 108.34 μ</td></tr>
		<tr><td>2</td> <td colspan="2"> HCT 116-Curcumin 10 μ M (4.81 μ g/μ)</td> <td colspan="2"> 2 μ</td> <td colspan="2"> 16.63 μ (80 μ g)</td> <td colspan="2"> 101.37 μ</td></tr> <tr><td>3</td> <td colspan="2"> HCT 116-Curcumin 20 μ M (3.28 μ g/μ)</td> <td colspan="2"> 2 μ</td> <td colspan="2"> 30.49 μ (100 μ g)</td> <td colspan="2"> 87.51 μ</td></tr> <tr><td>4</td> <td colspan="2"> HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μ g/μ) </td> <td colspan="2"> 2 μ</td> <td colspan="2"> 18.42 μ (100 μ g)</td> <td colspan="2"> 99.58 μ</td></tr> <tr><td>5</td> <td colspan="2"> 대장균 타우</td> <td colspan="2"> 2 μ</td> <td colspan="2"> 1 μ 타우-352</td> <td colspan="2"> 117 μ</td></tr> <tr><td>6</td> <td colspan="2"> MT만</td> <td colspan="2"> 2 μ</td> <td colspan="2"> X</td> <td colspan="2"> 118 μ</td></tr> <tr><td></td> <td colspan="2"></td> < td colspan = " 2"></td> <td colspan="2"></td> <td colspan="2"> 120 μ</td></tr></tbody></table> 표 1: 샘플 microtubule 바인딩 분석 결과 대 한 준비.
 5. 지역화 및 Curcumin와 세포 치료 후 타우 식 <ol><li>coverslip 70% 에탄올을 사용 하 여 깨끗 하 고 건조 한 실험실 티슈를 사용 하 여. 단일 coverslip 레이블이 6 잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 삽입 합니다. 접시에 생물 안전 캐비닛 놓고 적어도 3 h. 위해 자외선에 전환</li>
	<li>Subculture 셀 10 5 셀/잘 권장된 문화 매체에서 x 2.5에서 씨앗 6 잘 플레이트의 관련 웰 스도 하는 고.</li>
	<li>~ 24 h 후 세포질 형태학 변화에 대 한 확인을 10 배 및 40 X 목표를 사용 하 여 거꾸로 현미경을 사용 하 여 셀을 검사. 필요한 경우 사진 기록.</li>
	<li>는 PBS를 사용 하 여 두 번 셀 린스. 어둠 속에서 37 ° C 배양 기에서 3.7% 포름알데히드에 셀 수정. 
	참고: 실 온에서 포 름 알 데히드에 의해 고정 잘 작동, 너무 합니다. 포 름 알 데히드를 처리할 때 적절 한 개인 보호 장비를 착용.</li>
	<li>씻어 PBS에 셀. 셀에 얼음 처럼 차가운 메탄올에 수정 &#8722; 15 분 동안 20 ° C는 세포를 Permeabilize 0.1%와 3 %BSA 그들을 배양 하 여 10 분에 대 한 얼음에 PBS에 Triton X-100 PBS로 세포 세척.</li>
	<li>블로킹 버퍼에 셀을 품 어 (0.1%와 3% BSA PBS 솔루션에서 트윈-20) 실 온에서 1 h. 
	참고: 4 ° C에서 2 시간에 대 한 보육 작용도.</li>
	<li>3 %BSA 0.1%에서 1 차 항 체 (1: 200에서 안티 타우) 솔루션 준비 PBS (예를 들어, 0.4 mL 버퍼에서 2 µ L 타우-13 항 체)에 트윈 20.</li>
	<li>는 PVDF의 작은 조각을 잘라 막 조각; 6 잘 플레이트의 각 잘 제대로 맞게 되도록 물에 담가 5 분 장소에 대 한 각 잘에서 컷 PVDF.</li>
	<li>추가 60 µ L 컷을 1 차적인 항 체 솔루션의 PVDF 조각에 각 잘. 장소는 coverslips 셀 주 항 체 솔루션을 만질 수 있는 그런. 어두운, 습 한 챔버에 4 ° C에서 밤새 품 어. PBS에서 4 번 씻어.</li>
	<li>준비 3 %BSA 0.1%에서 이차 항 체 솔루션 (fluorescein 활용 594 반대로 마우스 IgG 1:400에) PBS에 트윈 20.</li>
	<li>조각과 6 잘 플레이트의 각 음을 제대로 맞게 각 잘에서 컷 PVDF 5 분 장소에 대 한 물에 담가 있도록 PVDF 막의 작은 조각을 잘라.</li>
	<li>6 잘 플레이트에 PVDF 조각의 각 이차 항 체 솔루션의 추가 80 µ L. 장소는 coverslip 셀 2 차 항 체 솔루션을 만질 수 있는 그런. 4 번 2 h. PBS로 세척에 대 한 실 온에서 어두운, 습 한 챔버에 품 어.</li>
	<li>샘플 4 장착 매체에 마운트 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 고 수정 유리 슬라이드에 coverslips.
	유리 슬라이드에 DAPI와 장착 매체의 <ol><li>하나 추가 드롭. 각 우물에서는 coverslips를 제거 하 고 DAPI와 설치 매체를 포함 하는 유리 슬라이드에 그들을 배치. 얼룩진된 셀을 포함 하는 각 coverslip의 표면에서 모은 접촉 확인해당 유리 슬라이드에 팅 매체.</li>
		<li>적용 폴란드어 밀봉 하 고 그들을 수정 각 coverslip 주위 밀폐 유리 슬라이드에 손톱. 필요한 경우이 단계를 두 번 수행.</li>
	</ol></li> <li>어두운 약 실에 있는 실내 온도에 1.5 h에 대 한 품.</li>
	<li>검사 confocal 현미경을 사용 하 여 어두운 방에 coverslip에 침수 석유를 사용 하 여 슬라이드.</li>
</ol>

저자 들은 아무것도 공개 선언 합니다.

이 원고 총 타우 감지에 대 한 서로 다른 절차 조건 고 대 장 암 세포 치료 curcumin와 LiCl 타우 phosphorylated. 단백질 견본에서의 전반적인 인 산화 상태를 평가 하기 위해 인산 가수분해 효소 분석 결과 설명 했다. 이 분석 결과 잠재적으로 어떤 단백질의 인 산화 상태 검사를 사용할 수 있습니다.
이 분석 결과 phosphorylated 단백질 이동 비 phosphorylated 상태로 보다 원칙을 기반으로 합니다. 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼는이 프로토콜에 사용 됩니다. 세포 lysates를 분석 결과 구성 요소를 추가한 후 샘플 특정 온도에서 특정 최적의 기간 동안 incubated 한다. 부 화, 후 샘플 반응을 중지 SDS 샘플 버퍼에 비등 한다. 이전에 다른 실험 프로토콜 microtubules에 타우의 바인딩을 평가 하기 위해 사용 되었습니다 수 있습니다. 여기에 제시 된 microtubule 바인딩 분석...

타우 원래 공동 tubulin1순화 했다 열 안정 microtubule 관련 단백질으로 확인 되었다. 타우는 높은 진핵생물2,,34에 독점적으로 표현 된다. 주요 기능 microtubule 어셈블리1,,56을 제어 하는 것입니다. 그것은 또한 합 microtubules7, axonal 전송8, axonal 직경9에 변화, 싱 경종 극성과 neurodegeneration10의 형성에 기여 한다. 타우는 또한 일부 신호 경로 제어 하는 단백질 비 계 역할을 합니다. 쥐 뇌 연구 제안 그 타우는 신경 및 그것은 주로 축 삭11에서 localizes. 타우 중앙 신경; axonal 개발에 중요 한 역할을 가상 했다 타우 microtubule 중 합 및 신경 발달에 필수적 이므로, 이 가설이 나중에 이었다 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험에 의해 확인. 신경, 외에도 타우 다른 비 신경 세포, 간, 신장 및 근육 세포12,13를 포함 하 여 표현 됩니다. 타우는 표현 또한 인간의 유 방, 전립선, 대 장, 위, 및 췌장암 세포 라인 조직14,15,16,17,18, 19. 타우 또한 포함 시체20꼬인된 tubulofilaments로 포함-몸 근육에서 발견.
타우는 몇 가지 포스트 번역 상 수정을 있습니다. 모든 포스트 번역 상 수정의 인 산화는 가장 일반적입니다. 증가 타우 인 산화 microtubules, 마지막으로 골격을 불안정에 대 한 선호도 감소 합니다. 85 인 산화 사이트 타우 단백질 Alzheimer의 질병이 인간의 뇌 조직에서 분리에 설명 했습니다. 이 사이트의 53% 구성 떠들고, 41% 트레오닌, 유일한 6% 티로신 잔류물21,,2223입니다. 타우 인 산화의 현지화, 기능, 바인딩, 가용성, 및 다른 포스트 번역 상 수정에의 민감성에 영향을 줍니다. 정상 범위 보다도 타우 인 산화 (또는 인산 염 그룹으로 채도가) 알 츠 하이 머 병24의 구조 및 기능적인 특성을 복제 하는 hyperphosphorylation로 알려져 있다. 타우 axonal microtubules의 적절 한 작동 하 고 생리 적 조건 하에서 정상적인 신경 기능을 보장 합니다. 그러나, hyperphosphorylated 타우 microtubule 해체 때문에 신경 손실의 원인이 조직적된 microtubule 바인딩을 유지 하기 위해 실패 합니다. 타우 인 산화의 정상 수준 기능, 적절 한 타우 필요 하지만 타우의 특성 인 산화 수준을 변경 하는 경우 및 경우 hyperphosphorylated25정상적으로 작동 하는 데 실패. Alzheimer의 질병 그리고 다른 나이 관련 된 신경 장애, 타우 hyperphosphorylated 되 고 형성 하는 대응된 나선형 필 라 멘 트 및 neurofibrillary tangles26,27. 따라서, 타우 인 산화 및 microtubule 바인딩 결정 하는 방법 중요 하다.
대 장 암, 암, 노화 관련 된 세 번째는 가장 자주 암과 세 번째 눈에 띄는 죽음을 일으키는 남성, 여성 모두28암 진단 이다. 대 장 암 서방 세계29주요 사망 원인 암 중 하나입니다. 대 장 암과 Alzheimer의 질병 노화와 관련 된 둘 다 사람들이 비슷한 식습관을 즐길 있는 선진국에서 주로 발생 하기 때문에, 두 질병 어떻게든 상관 될 수 있습니다. 또한, 타우 양수와 음수가 타우 암 세포는 화학요법 대리인, 예를 들면, paclitaxel16에 다르게 응답.
Curcumin은 longa 되더라도, 인도 향미료 심 황30의 주요 파생 상품 중 하나입니다. 수세기 동안, 남쪽 아시아 인구는 매일 그들의 규정식에 있는 심 황을 소모 하 고. Curcumin는 대 장 암, Alzheimer의 질병, 당뇨병, 낭 성 섬유 증, 염증 성 장 질환, 관절염, 혈, 동맥 경화 증 및 허 혈 성 심장 질환31, 등 다른 질병을 치료 하는 데 사용 됩니다. 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. 리튬 또한 대 장 암 세포를 죽 일 수 있다 또는39그들의 확산 방지. Alzheimer의 질병40 타우 집계를 감소 하 고 유전자 변형 마우스 모델41,,4243에 관측 된 그것의 hyperphosphorylation를 방지 치료를 위한 리튬을 사용하실 수 있습니다. 44.
이 원고를 목표로: 1) 총 타우 및 치료 세포; 인 타우 식 레벨 측정 2) 측정 전체 타우 인 산화; 인산 가수분해 효소 분석 결과 설명 3) 검사의; microtubule 바인딩 그리고 4) 타우 confocal 현미경 검사 법 대 장 암 세포 라인 curcumin와 LiCl 치료 하 여 지역화. 결과 curcumin와 세포 치료, 대 장 암에 대 한 일 걸 요 좋은 화학요법 에이전트 그리고 LiCl 치료 두 총의 식을 줄일 수 있으며, 대 장 암 세포 라인에 타우 phosphorylated 공개. 이러한 치료의 핵 전 좌를 발생할 수 있습니다. 그러나, 예기치 않게, curcumin microtubules에의 바인딩 개선 실패 합니다.

<table><tbody><tr><td>HCT 116 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td></td></tr><tr><td>MEM (EBSS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>16000044</td><td>-20 &deg에서 저장; C</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>하이클론</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 용액</td><td>WelGene</td><td>LS 015-01</td><td></td></tr><tr><td>100mm 접시</td><td>Corning</td><td>430161</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>Coster 3516</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tau 13 항체</td><td>abcam</td><td>ab19030</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Roche</td><td>10 708 984 001</td><td>저장 온도 2&ndash; 8 > C</td></tr><tr><td>마이크로리터 원심분리기</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>MIKRO 200 R</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td>저장 온도 2&ndash; 8 > C</td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>78246</td><td>저장 온도 2&ndash; 8 > C</td></tr><tr><td>미세소관 (MT)</td> <td>세포골격</td><td>MT001</td><td>4 &deg에 저장; C (건조)</td></tr> <tr>DAPI <td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>을 사용한 장착 매체</td><td>4 °C에 저장; 어둠 속의 C</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8877</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>WelGene</td><td>LB 001-02</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model 500</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100 XP</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>분자 이미저</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc XRS+</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>단백질 분석 염료 시약</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td><td>Cell signalling</td><td>2125</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td><td>Cell signalling</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tau (phospho S396) 항체</td><td>abcam</td><td>ab109390</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>실온</td></tr><tr><td>에서 보관FastAP Thermo Sensitive Alkaline Phosphatase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>-20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>실온에서 보관</td></tr><tr><td>인산가수분해효소 억제제 칵테일</td><td>세포 신호 전달</td><td>5870</td><td>4°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>세포 신호</td><td>5871</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>RIPA 버퍼</td><td>시그마</td><td>R 0278</td><td>저장 온도 2&ndash; 8 > C</td></tr><tr><td>Tau-352 인간</td><td>시그마</td><td>T 9950</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>트리톤 X-100&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>X - 100</td><td>약 25°C에 저장; C</td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG 2차 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11005</td><td>4°C에 저장; C 어둠 속에서</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 라이</td><td>카 마이크로 시스템</td><td>라이카 TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)</td> <td>Affymetrix</td><td>75819</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분석</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>4 &deg에 저장; 씨</td></tr></tbody></table>

인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 microtubule 바인딩 분석 결과

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Microtubule 관련 단백질 타우 주로 축 삭에서 localizes 신경 단백질 이다. 일반적으로 타우 그것은 microtubule 어셈블리 및 안정화에 관여 하기 때문에 정상적인 신경 기능을 위해 필수적 이다.입니다. 뉴런, 게다가 타우 인간 유 방, 전립선, 위, 대 장, 췌 장의 암 거의 비슷한 구조를 보여줍니다 하 고 신경 타우로 유사한 기능을 발휘 하는 있는으로 표현 된다. 타우와의 인 산화의 금액 microtubules, 안정제로 서의 기능을 변경 하 고 다른 신경 퇴행 성 질환, 알 츠 하이 머 병 등에서 쌍을 이루는 나선형 필 라 멘 트의 발전으로 이어질 수 있습니다. 타우와 microtubule 바인딩 특성의 인 산화 상태를 결정 하는 것이 중요 합니다. 또한, 검사의 세포내 지역화 다른 질병에서 중요 하다. 이 원고 내용 표준 프로토콜 타우 인 산화 및 대 장 암 세포 또는 curcumin와 LiCl 치료 없이 microtubules 타우 바인딩을 측정. 이러한 치료는 암 세포 증식 및 개발을 중지 사용할 수 있습니다. 세포내 지역화의 낮은 양의 항 체를 사용 하는 동안 immunohistochemistry 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 검사 합니다. 이 분석 실험 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩에 영향을 주는 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다. 다른 tauopathies에 대 한 새로운 치료제 사용 또는 관련된 항 암 에이전트 나타낼 수 있다 잠재적으로 이러한 프로토콜을 사용 하 여.

식 총 타우와 인 타우의 curcumin 또는 LiCl (그림 1)의 다른 농도와 세포 치료 후 시험 되었다. Curcumin의 3 개의 다른 농도와 세포의 치료 감소 타우 식 수준; 그러나, 인 타우 식 치료 curcumin의 낮은 농도 따라 증가 하지만 높은 curcumin 농도와 세포 치료 시 감소. 안티-인-타우 (Ser396) 인 타우의 탐지를 위해 사용 되었다. 총 타우와 인 타우 LiCl (그림 1)의 세 가지 다른 농도와 세포의 치료 시 감소합니다. 이전 연구는 타우 식 수준 다 다른 암 종류에와 같은 암 종류의 서로 다른 사이트에 표시 했다. 대 장 암에 이전 데이터는 타우 두 셀 라인 (HCT 116와 SW480) 대 장 암 또한 phosphorylated19했다 표현 했다 보여주었다. 5 µ M curc...

이 원고는 타우 hyperphosphorylation, 타우에 바인딩 microtubules, 및 약물 치료에 따라 세포내의 지역화를 측정을 측정 하기 위한 표준 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 약물 또는 다른 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩 대상 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다.

인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

이 절차의 전반적인 목적은 공초점 현미경을 사용하여 대장암 세포에서 tau 인산화, tau의 미세소관 결합 능력 및 tau의 국소화를 연구하는 것입니다. 이 방법은 인산화와 미세소관 결합이 중요한 요인인 암 및 치매 연구를 포함한 대부분의 생물학적 연구 분야에 효과적일 수 있습니다. 제시된 인산화 효소 분석법의 주요 장점은 단백질 샘플의 전체 인산화 상태를 쉽게 파악할 수 있는 방법을 제공한다는 점입니다.미세소관 결합 분석의 주요 장점은 미세소관 결합 단백질을 비결합 분획으로부터 분리하는 과정이 간단하다는 점입니다. 반면, tau 국소화 기술의 주요 이점은 일차 및 이차 항체의 요구량이 상대적으로 적다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 시약을 준비하십시오.약 100만 개의 HCT 116 세포를 10% fetal bovine serum 및 1% penicillin streptomycin이 첨가된 최소 필수 배지(minimum essential medium)가 담긴 배양 접시에 옮깁니다. 세포의 밀도가 65% confluence에 도달하면, 흡입기(aspirator)를 사용하여 FBS가 첨가된 배지를 제거합니다. 그 다음, curcumin 또는 lithium chloride가 포함된 무혈청 MEM을 추가합니다.5% 이산화탄소가 포함된 습윤한 분위기의 37°C에서 24시간 동안 배양합니다. 그 후, 10 mL의 ice-cold PBS로 세포를 세척합니다. 1 mL의 ice-cold PBS를 추가한 다음, 세포 스크래퍼를 사용하여 세포를 긁어 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.1800 ×g, 4 °C에서 4분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 4 °C의 완전한 RIPA 버퍼 100 µL에 넣고 20분 동안 현탁시키며, 세포가 완전히 용해되도록 튜브를 주기적으로 가볍게 두드립니다. 그다음, 진폭 10%에서 0.2초 간격으로 켜짐과 꺼짐을 반복하여 총 2초 동안 샘플을 짧게 초음파 처리합니다.세포 균질액을 22,570 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 라벨이 부착된 새 튜브로 옮긴 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Bradford 분석법을 통해 단백질 농도를 측정합니다. 총 단백질 20 µg이 포함된 샘플을 준비한 후, 각 샘플에 알칼라인 포스파타아제 버퍼 2 µL와 알칼라인 포스파타아제 10 µL를 추가합니다.그 다음, 각 샘플의 최종 부피가 20 microliters가 되도록 증류수를 첨가합니다. 샘플을 37 degrees Celsius에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플을 배양하는 동안, 비교를 위해 인산가수분해효소(phosphatase)를 제외하고 동일한 농도로 추가 샘플을 준비합니다.1시간 후, 최종 농도가 50 millimolar인 EDTA 또는 최종 농도가 10 millimolar인 sodium orthovanadate를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 400 millimolar DTT가 포함된 갓 조제한 4XSDS 겔 로딩 버퍼를 첨가합니다. 히팅 블록을 사용하여 샘플을 100 degrees Celsius에서 5분 동안 배양합니다.시료를 볼텍싱한 후, 실온에서 10~15분 동안 식힙니다. 다음으로, 10% polyacrylamide 겔의 각 웰에 시료 13 µL와 분자량 마커를 로딩합니다. 전기영동 장치를 전원에 연결하고, 전압을 70 V로 설정하여 20분 동안 가동함으로써 단백질 시료가 스태킹 겔에서 분리 겔로 이동하도록 합니다.그 다음, 전압을 125 V로 높여 샘플과 단백질 래더가 겔 끝에 도달할 때까지 약 70분에서 120분 동안 전기영동을 수행합니다. 습식 전기전달 시스템을 사용하여 100 V에서 약 100분 동안 겔의 단백질을 polyvinylidene fluoride 막으로 전사합니다. 이어서, 막을 4% bovine serum albumin 용액에서 실온으로 90분 동안 블로킹 처리합니다.블롯을 1차 항체 용액에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, PBST로 7분씩 세 번 세척합니다. 상온에서 2차 항체 용액에 넣고 90분 동안 배양합니다.그 다음, PBST로 7분씩 4회 세척합니다. 제조사의 지침에 따라 화학발광 키트를 사용하여 블롯을 현상합니다. 현상된 블롯을 투명 플라스틱 랩으로 덮은 후, 시판되는 화학발광 이미지 시스템으로 블롯의 화학발광 이미지를 획득합니다.신선한 시료를 준비한 후, 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 시료를 100,000 ×g, 25°C에서 60분 동안 초원심분리합니다. 그다음, 결합되지 않은 tau가 포함된 각 상청액 120 µL를 분리된 깨끗하고 라벨이 부착된 튜브로 옮깁니다.결합된 tau가 포함된 펠릿에 120 µL의 Fibic 샘플 버퍼를 추가합니다. 볼텍싱과 파이펫팅으로 충분히 혼합한 후, 혼합물을 라벨이 부착된 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 단백질 농도가 동일하도록 샘플을 준비한 후, 400 mM DTT가 포함된 신선한 4XSDS 겔 로딩 버퍼를 추가합니다.히트 블록을 사용하여 샘플을 100 °C에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 볼텍싱한 후 실온에서 10~15분 동안 식힙니다. 10% polyacrylamide 겔의 각 웰에 샘플 13 µL와 분자량 마커를 로딩합니다.전기영동 시스템의 양극과 음극을 전원 공급 장치에 연결한 다음, 전압을 70 volts로 설정하여 20분 동안 작동시킵니다. 그 후 전압을 125 volts로 높여 시료와 단백질 사다리가 젤의 끝에 도달할 때까지 약 70분에서 120분 동안 젤을 수행합니다. 습식 전기 블롯팅 시스템을 사용하여 100 volts에서 약 100분 동안 젤을 polyvinylidene fluoride 막으로 전이시킵니다.블롯팅한 막을 4% bovine serum albumin에 넣고 실온에서 90분 동안 배양합니다. 그 다음, 1차 항체 용액에서 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, PBST로 블롯을 4회 세척하며, 각 세척 시간은 7분으로 합니다.세척한 블롯을 해당 2차 항체 솔루션에 넣고 상온에서 90분 동안 배양합니다. 그 후, PBST로 7분 동안 세척하며 이 과정을 총 4회 반복합니다. 화학발광 키트를 사용하여 블롯을 현상합니다.투명 플라스틱 랩으로 덮은 후, 화학발광 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득합니다. 우선, 6-웰 조직 커버 플레이트의 웰에 커버슬립을 넣고, 권장 배양 배지 내의 각 웰에 250,000개의 세포를 파종합니다. 24시간 후, PBS로 세포를 두 번 헹굽니다.curcumin이 포함된 무혈청 MEM을 첨가하고, 5% 이산화탄소가 포함된 습윤 분위기의 37 °C 배양기에서 24시간 동안 배양합니다. 그 후, 차가운 PBS로 세포를 다시 세척합니다. 37 °C 배양기 내 암실 조건에서 3.7% formaldehyde로 세포를 고정합니다.세포를 PBS로 세척한 다음, 20°C의 얼음처럼 차가운 메탄올에서 15분 동안 세포를 고정합니다. 그 후, PBS 내의 3%BSA 및 0.1%Triconex 100 용액에 세포를 넣고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 PBS로 세척한 다음, 실온에서 블로킹 완충액에 1시간 동안 배양합니다.다음으로, 각 웰의 절단된 폴리비닐리덴 플루오라이드 조각에 1차 항체 용액 60 µL를 첨가합니다. 이때 세포가 항체 용액과 접촉하도록 커버슬립을 배치합니다. 어두운 습윤 챔버 내 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, PBS로 세포를 4회 세척합니다. 각 polyvinylidene fluoride 조각에 2차 항체 용액 80 µL를 첨가하고, 세포가 항체 용액과 접촉하도록 커버슬립을 배치합니다. 암실 습윤 챔버에서 실온으로 2시간 동안 배양합니다.그 후, PBS로 세포를 4회 세척합니다. DAPI가 포함된 마운팅 용액을 사용하여 샘플을 마운팅한 다음, 커버 슬립을 유리 슬라이드에 고정합니다. 그런 다음 암실 내 실온에서 1시간 30분 동안 배양합니다.공초점 현미경을 사용하여 슬라이드를 관찰합니다. 본 연구에서는 phospho-tau 항체를 사용하여 특정 tau 인산화를 평가합니다. 커큐민으로 처리한 세포에서는 커큐민의 농도가 증가함에 따라 tau 발현이 감소하는 것이 관찰됩니다.반면, phospho-tau 발현은 낮은 농도의 curcumin에서 증가하는 것으로 나타났으며, 매우 높은 농도에서만 감소하였습니다. 이후 lithium chloride로 처리한 세포를 검사하였습니다. 확인 결과, lithium chloride 처리 시 tau와 phospho-tau의 발현이 모두 유의미하게 감소하였습니다.그런 다음 인산화효소 분석법(phosphotase assay)을 통해 전체적인 인산화 정도를 평가합니다. 인산화효소를 처리한 시료의 Tau는 처리하지 않은 대조군 시료에 비해 더 빠르게 이동하는 것이 관찰되며, 이는 대조군 시료가 인산화되었음을 나타냅니다. 커큐민을 처리한 세포 시료에서도 매우 유사한 결과가 나타났으며, 이는 처리된 대장암 세포주에서 Tau 인산화가 감소하지 않았음을 의미합니다.염화리튬으로 처리한 세포 샘플에서 포스파타아제를 처리한 샘플과 처리하지 않은 샘플 모두 거의 동일한 범위로 전기영동되었으며, 이는 tau 인산화가 감소했음을 나타냅니다. 다음으로, tau 352를 양성 대조군으로 사용하여 세포 샘플의 미세소관 결합 분석법을 성공적으로 구축하였습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 커큐민과 저농도의 염화리튬 처리 모두 미세소관 결합 활성을 억제하는 결과가 나타납니다.그 후 공초점 현미경 관찰을 수행합니다. 커큐민 처리 후, tau가 핵으로 이동하는 것이 관찰됩니다. 이는 핵 내 tau가 뉴런의 DNA 보호에 핵심적인 역할을 한다는 이전 연구 결과들을 뒷받침합니다.이 영상을 시청하신 후, 단백질 샘플의 전체 인산화 정도를 결정하기 위한 포스포타아제 분석법과 미세소관 결합 분석법의 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 소량의 다양한 항체를 사용하여 공초점 현미경으로 면역형광 분석법을 실행하는 방법을 익히실 수 있습니다. 본 과정에서 제시된 절차들은 비용 효율적이며, 다양한 타우 병증 및 암을 치료하기 위한 새로운 치료제 발견과 개발에 잠재적인 도움이 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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