인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

이 원고는 타우 hyperphosphorylation, 타우에 바인딩 microtubules, 및 약물 치료에 따라 세포내의 지역화를 측정을 측정 하기 위한 표준 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 약물 또는 다른 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩 대상 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 결장직장암 세포에서 컨포칼 현미경을 사용하여 타우 인산화, 타우의 미세소관 결합 능력 및 타우의 국소화를 연구하는 것입니다. 이 방법은 대부분의 생물학 연구 분야, 특히 인산화와 미세소관 결합이 중요한 요소인 암 및 치매 연구에 효과적일 수 있습니다. 제시된 포스포라타제 분석법의 주요 장점은 단백질 샘플의 전체 인산화를 쉽게 인식할 수 있는 방법을 제공한다는 것입니다.

미세소관 결합 분석법의 주요 장점은 미세소관 결합 단백질을 비결합 분획에서 분리하는 간단한 절차라는 것입니다. 그러나 타우 국소화 기법의 주요 이점은 상대적으로 적은 양의 1차 및 2차 항체가 필요하다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 시약을 준비합니다.

약 100만 개의 HCT 116 세포를 10%의 소 태아 혈청과 1%의 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 최소한의 필수 배지가 포함된 배양 접시로 전달합니다. 세포가 65% 합류점에 도달하면 흡인기를 사용하여 FBS 보충 배지를 제거합니다. 그런 다음 커큐민 또는 염화리튬을 함유한 무혈청 MEM을 추가합니다.

섭씨 37도의 이산화탄소가 5%인 가습 분위기에서 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 10ml의 차가운 PBS로 세포를 씻으십시오. 얼음처럼 차가운 PBS 1ml를 추가한 다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 셀을 긁어내고 1.5ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.

1800 회 G 및 섭씨 4도에서 4 분 동안 원심 분리기. 우리는 세포 펠릿을 섭씨 4도에서 100마이크로리터의 완전한 RIPA 완충액에 20분 동안 현탁시키고 튜브를 정기적으로 두드려 세포를 용해시킵니다. 그런 다음 10%의 진폭으로 샘플을 잠시 초음파 처리하여 0.2초 동안 펄스를 켜고 0.2초 동안 끄면 총 2초 동안 됩니다.

세포를 22, 570회 G, 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 라벨링된 새 튜브로 옮긴 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Bradford 분석으로 단백질 농도를 측정합니다. 총 단백질 20마이크로그램을 함유한 샘플을 준비한 후 각각 2마이크로리터의 알칼리 인산가수분해효소 완충액과 10마이크로리터의 알칼리성 인산가수분해효소를 추가합니다.

그런 다음 각 샘플의 최종 부피가 20마이크로리터가 되도록 증류수를 추가합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플이 배양하는 동안 동일한 농도로 추가 샘플을 준비하되 비교를 위해 포스파타아제는 준비하지 않습니다.

1시간 후 최종 농도 50mmol에서 EDTA를 첨가하거나 최종 농도 10millimolar에서 오르토바나데이트나트륨을 첨가하여 반응을 중지합니다. 400 밀리몰 DTT를 함유 한 갓 준비된 4XSDS 젤 로딩 버퍼를 추가합니다. 열 블록을 사용하여 섭씨 100도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다.

샘플을 와류로 만든 다음 실온에서 10-15분 동안 식히십시오. 다음으로, 웰당 13마이크로리터의 샘플과 분자 계량 사다리를 10% 폴리아크릴아미드 겔에 로드합니다. 전기영동 시스템을 전원에 연결하고 전압을 20분 동안 70볼트로 설정하여 단백질 샘플을 적층 겔에서 분해 겔로 이동합니다.

그런 다음 125볼트로 높이고 샘플과 단백질 래더가 겔 끝에 도달할 때까지 약 70-120분 동안 겔을 실행합니다. 습식 전기블로팅 시스템을 사용하여 약 100분 동안 100볼트의 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인에 겔을 옮깁니다. 다음으로, 멤브레인을 배양하여 실온에서 90분 동안 4% 소 혈청 알부민을 블롯아웃시킵니다.

블롯을 섭씨 4도의 1차 항체 용액에서 밤새 배양합니다. 다음 날, PBST에서 얼룩을 세 번 씻고 매번 7 분 동안 씻습니다. 불확실한 2차 항체 용액에서 실온에서 90분 동안 배양합니다.

그런 다음 PBST로 4회 세척하고 각 세척은 7분 동안 지속됩니다. 제조업체의 지침에 따라 화학발광 키트를 사용하여 블롯을 현상합니다. 현상된 블롯을 투명 플라스틱 랩으로 덮은 다음 시판되는 화학발광 이미징 시스템으로 블롯의 화학발광 이미지를 획득합니다.

신선한 샘플을 준비한 후 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 초원심분리기 100, 000배 G 및 25°C에서 60분 동안 샘플을 가열합니다. 다음으로, 결합되지 않은 타우를 포함하는 각 상등액 120마이크로리터를 분리하고 세척하고 라벨링된 튜브로 옮깁니다.

120마이크로리터의 Fibic 샘플 버퍼를 결합된 tau가 포함된 펠릿에 추가합니다. 와류와 피펫팅을 통해 철저히 혼합한 후 혼합물을 레이블이 표시된 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 동등한 단백질 농도의 샘플을 준비한 후 400 밀리몰 DTT를 포함하는 새로운 4XSDS 겔 로딩 버퍼를 추가합니다.

열 블록을 사용하여 섭씨 100도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 샘플을 볼텍스한 다음 실온에서 10-15분 동안 식힙니다. 웰당 13마이크로리터의 샘플과 분자량 래더를 10% 폴리아크릴아미드 겔에 로드합니다.

전기영동 시스템의 양극과 음극을 전원에 연결한 다음 전압을 70분 동안 20볼트로 설정합니다. 그런 다음 125볼트로 높이고 샘플과 단백질 래더가 겔 끝에 도달할 때까지 약 70-120분 동안 겔을 실행합니다. 습식 전기블로팅 시스템을 사용하여 약 100분 동안 100볼트의 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인에 겔을 전사합니다.

멤브레인을 배양하여 실온에서 90분 동안 4% 소 혈청 알부민을 블롯아웃시킵니다. 그런 다음 섭씨 4도의 1차 항체 용액에서 밤새 배양합니다. 다음 날, PBST로 얼룩을 4번 씻고 각 세척은 7분 동안 지속됩니다.

세척된 블롯을 해당 2차 항체 용액에 실온에서 90분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBST로 7분 동안 세척하고 총 4회 세척을 반복합니다. 화학발광 키트를 사용하여 블롯을 현상합니다.

투명 플라스틱 랩으로 덮고 화학발광 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득합니다. 시작하기 위하여는, 6 우물 조직 덮개 판의 우물로 덮개 미끄러짐을 두고, 그 후에 추천한 배양 매체에 있는 각 우물로 250의 000의 세포를 씨를 뿌린다. 24시간 후 PBS로 세포를 두 번 헹굽니다.

커큐민을 함유한 무혈청 MEM을 첨가하고 5%의 이산화탄소를 함유한 가습 분위기에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 그 후, 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 다시 씻으십시오. 어둠 속에서 섭씨 37도의 인큐베이터에서 3.7%포름알데히드의 세포를 고정합니다.

PBS로 세포를 세척 한 다음 섭씨 20도에서 15 분 동안 얼음처럼 차가운 메탄올에 세포를 고정시킵니다. 그 후, 3% BSA의 얼음과 0.1% Triconex 100의 PBS에서 10분 동안 세포를 배양합니다. PBS로 세포를 세척한 다음 실온에서 1시간 동안 차단 버퍼에서 배양합니다.

다음으로, 60마이크로리터의 1차 항체 용액을 각 웰의 절단된 폴리비닐리덴 플루오라이드 조각에 추가합니다. 커버를 놓으면 세포가 항체 용액과 접촉할 수 있습니다. 어둡고 습한 챔버에서 섭씨 4도의 온도에서 밤새 배양합니다.

다음 날, PBS로 세포를 4번 씻는다. 80마이크로리터의 2차 항체 용액을 각 폴리비닐리덴 플루오라이드 조각에 첨가하고 세포가 항체 용액과 접촉하도록 커버 슬립을 배치합니다. 어둡고 습한 챔버에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 PBS로 세포를 4번 씻습니다. DAPI를 사용하여 장착 매체에 샘플을 장착한 다음 유리 슬라이드에 커버 슬립을 고정합니다. 그런 다음 실온의 어두운 챔버에서 1시간 30분 동안 배양합니다.

컨포칼 현미경을 사용하여 슬라이드를 검사합니다. 이 연구에서는 인산-타우 항체를 사용하여 특정 타우 인산화를 평가합니다. 커큐민으로 처리된 세포는 커큐민의 농도가 증가함에 따라 감소된 타우를 발현하는 것으로 보입니다.

반면에 포스포-타우 발현은 커큐민의 농도가 낮을 때 증가하며 매우 높은 농도에서만 감소하는 것으로 나타났습니다. 그런 다음 염화 리튬으로 처리된 세포를 검사합니다. 보시다시피, 타우(tau)와 포스포-타우(phospho-tau)의 발현은 염화리튬 처리에서 현저히 감소합니다.

그런 다음 전체 인산화는 인산가수분해효소 분석법으로 평가됩니다. Tau는 처리되지 않은 대조군 샘플에 비해 포스포타아제 처리된 샘플에서 더 빠르게 이동하는 것으로 보이며, 이는 대조군 샘플이 인산화되었음을 나타냅니다. 커큐민 처리된 세포 샘플은 매우 유사한 결과를 보였는데, 이는 치료 대장암 세포주가 타우 인산화를 감소시키지 않았음을 나타냅니다.

포스파타아제(phosphatase) 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플 모두 염화리튬으로 처리된 세포 샘플에서 거의 동일한 범위의 전기영동을 보였으며, 이는 타우 인산화(tau phosphorylation)의 감소를 나타냅니다. 다음으로, 세포 샘플의 미세관 결합 분석은 tau 352를 양성 대조군으로 사용하여 성공적으로 확립되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 커큐민과 낮은 농도의 염화리튬 처리는 모두 미세소관 결합 활성을 억제합니다.

그런 다음 컨포칼 현미경 검사를 수행합니다. 커큐민 치료 후 타우는 핵으로 전위되는 것으로 보입니다. 이는 핵 타우가 신경 DNA 보호의 핵심 플레이어라고 보고한 이전 연구를 뒷받침합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 단백질 샘플의 전체 인산화를 결정하기 위해 포스포타아제 분석을 수행하는 방법과 미세소관 결합 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 다양한 소량의 항체를 사용하여 컨포칼 현미경 검사로 면역형광 분석을 실행하는 방법을 알아낼 수 있어야 합니다. 여기에 제시된 절차는 비용 효율적이며 다양한 타우포레스 및 암을 치료하기 위한 새로운 치료제의 발견 및 개발에 잠재적으로 도움이 될 것입니다.