Name: 급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 학습하세요 소량 재활용 ACSF에서 산소 수준을 안정화하고 형광 현미경 하에서 급성 해마 조각의 장기 시냅스 가소성을 기록하는 방법을. 이 기술은 신경가소성 연구의 비용 효율성을 높입니다.

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트 면 실시, 분석, 실험을 설계 하 고 원고를 썼다. D.X. 및 C.P. 그림 준비에서 원조 하 고 실험을 실시. 이 작품은 NSFC (31320103906)에 의해 지원 되었다 결핵을 111 프로젝트 (B16013)

동물 동물 보호의 설립된 기준 및 뇌 과학 연구소 및 상태 키 실험실의 의학 신경 생물학의 복 단 대학, 상해, 중국의 절차에 따라 유지 되었다.
1. 솔루션 준비
주: 자료의 테이블을 참조 하십시오.
<ol>
	<li>조각화 버퍼 (수정된 Gey 솔루션) 준비: 92 m m NaCl, 2.5 m m KCl, 1.25 m m NaH2포4, 30 mM NaHCO3, 25 mM 포도 당, 20 mM HEPES, 3mm 나+-pyruvate, 10mm MgSO4및 0.5 m m CaCl2.</li>
	<li>Carbogenation 없이 1 M NaOH를 사용 하 여 7.6에 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 버퍼 저장 참고: 적정 흐린 액체를 명확히. osmolality 305-310 mOsm입니다. Carbogen21 5% 이산화탄소와 95% 산소를 포함합니다.</li>
	<li>실제의 최종 조성 주는 중 탄산염과 포도 당을 포함 하지 않는 실제의 재고 솔루션 x 10를 diluting 하 여 준비: 124 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 2.5 m m CaCl2, 2 mM MgCl2및 1.25 m m KH2포4.</li>
	<li>중 탄산염 및 10 mM 포도 당 및 26 m m NaHCO3에 도달 하는 포도 추가 합니다.</li>
	<li>Carbogenate NaHCO3를 추가한 후 즉시 차단 엔드와 천공된 실리콘 튜브를 통해 실제.</li>
	<li>Carbogenating (pH 7.3-7.4) 동안 pH를 측정 합니다. 참고: 버퍼 용량 NaHCO3의 금액을 변경 하 여 약간 조정할 수 있습니다. 결과 pH 온도 의존 하는 때문에, 그것은 작동 온도 (예, 30 ° C)에서 carbogenating 동안 결과 pH를 확인 하는 데 필요한.</li>
</ol>
2입니다. 급성 Hippocampal 조각의 준비
주: 자료의 테이블을 참조 하십시오.
<ol>
	<li>급성 뇌 조각에 대 한 보육 챔버를 슬라이스 잡고 메쉬 장소, 실제, 및 carbogenate (4-6 L/h) 적어도 30 분22 28-30 ° c.에 대 한 챔버를 채우기</li>
	<li>2-4 ° c.까지 수술 도구 쿨</li>
	<li>감기와 carbogenated 버퍼 (2-4 ° C), 유지 하는 vibratome 근처 얼음/물 혼합물을 깔 끔 히 가득 유리 비 커를 놓습니다.</li>
	<li>각 막 반사 (30-50 s) 사라질 때까지 쥐 또는 쥐를 anesthetize 2 L 유리 용기 또는 50 mL 튜브에 12.5 µ L에 500 µ L를 취하여 isoflurane를 사용 하 여.</li>
	<li>설명 및 매 티 스 외 의 간행물에 자세히 시각화 방법을 사용 하 여 뇌를 분리 (2011 년) 23 , Yuanxiang 외. (2014) 24.</li>
	<li>2-4 ° c 뇌 소 뇌를 해 부하 고 반구를 분리 하기 전에 (적어도 2 분)에 대 한 차가운 조각화 버퍼에 멋진.</li>
	<li>차가운 수술 블레이드를 사용 하 여 그림 1C 는 복 부와 해 마의 중간 부분에서 가로 분할 영역을 각 반구25 의 등 쪽 가장자리를 따라 70 ° 각도로 지 피 조각 해 부 그리고 E.</li>
	<li>감기 치과 시멘트 주걱으로 짧게 만든된 표면 (1-2 s) 건조 필터 종이의 조각에 반구를 전송.</li>
	<li>갓 잘라 표면 두 반구 빠른 연기 접착제 접착제;를 사용 하 여 차가운 조각화 플랫폼에 탑재 반구 면 면도날 (그림 1D)의 꼬리 끝을 있다.</li>
	<li>vibratome의 냉각 챔버도 조각화 플랫폼을 놓고 조각화 버퍼 (2-4 ° C)와 그 챔버를 입력 합니다. Carbogenate 구멍된 실리콘 튜브를 사용 하 여입니다.</li>
	<li>적절 한 vibratome 설정을 사용 하 여 350 µ m 조각 잘라 (예를 들어, 블레이드 앞으로 속도: 1.2 m m/s, 블레이드 진폭: 1mm).</li>
	<li>분리는 subiculum를 사용 하 여 두 개의 주입 뉼 entorhinal 외피가 hippocampal 형성 (&#62; 28 G)가 위로.</li>
	<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 이전 준비 보육 상공의 슬라이스 잡고 메쉬에서 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>인큐베이션 챔버의 메쉬에 조각화 플랫폼에서 지층 pyramidale에서 몇 가지 투명도 있는 분할 영역을 전송 합니다. 모든 폴딩, 스트레칭, 중복, 및 큰 입 파스퇴르 피 펫으로 실제와 슬라이스를 발음에 의해 부동 하지 마십시오. 참고: 모든 절차 (단계 2.5-2.14) 5-10 분; 걸릴 수 있습니다. 따라서, 그것은 4 ° c.에 그것을 유지 하는 시간이 지남에 따라 버퍼 솔루션의 온도 확인 하는 것이 중요</li>
	<li>보육 실에서 적어도 1.5-2 h 30 ° C에서 슬라이스를 품 어 고 carbogen 4-6 L/h에서 제공 합니다. 참고: 버퍼는 인큐베이터에 순환 하지만 부동에서 슬라이스를 방지 carbogen의 유량을 조정 합니다.</li>
</ol>
3. 수정은 실제에 대 한 Carbogenation의 작은 저수지의 재활용
<ol>
	<li>재활용 시스템 (그림 2B)의 유출에 3 방향 튜브 커넥터를 추가 합니다.</li>
	<li>Carbogen 공급 튜브 3 방향 튜브 커넥터의 가운데 팔을 연결 하 고 공기 흐름 미터 (3-4 L/h,D 그림 2및 그림 4C) 유량을 조절.</li>
	<li>재활용 시스템의 유입에 두 번째 3-방향 튜브 커넥터를 추가 합니다. 중간 팔 (로우-패스 필터; 저수지에서 유입 튜브를 인라인 히터, 얇은 실리콘 튜브 (10 ㎝ 길이), 상 완 및 더 낮은 팔을 직면 하는 튜브를 연결 그림 4 C)입니다.</li>
	<li>얇은 실리콘 튜브 튜브 압착 기 장소 (OD: 2mm) 튜브 연동 펌프에 의해 생성 된 조각 챔버에 실제의 맥의 최소한은 한 위치에서. 참고: 유출-carbogenation (유출-수화물.) 수정 실제 저수지, 재활용 율, 실제의 볼륨을 carbogenation 레벨의 감도 감소 시키고 상대 튜브 작은 실제 저수지 내 위치 (&#60; 50 mL; 그림 3)입니다. 로우-패스 필터에 관한 얇은 실리콘 튜브에 공기의 일정 금액의 실제 흐름; 맥 동 감소 따라서, 튜브 공기도 주로 가득 한다.</li>
</ol>
4입니다.침수 슬라이스 챔버에 시 냅 스의 응답을 기록
주: 자료의 테이블을 참조 하십시오.
<ol>
	<li>미리 따뜻한 물 목욕 약 28-30 ° c (이것은 녹음 실에서 거품 형성 방지)에서 실제 솔루션.</li>
	<li>재활용 시스템 (4-5 mL/min)를 시작 하 고 적어도 1 시간을 위한 시스템을 equilibrate 하 인라인 히터를 활성화.</li>
	<li>렌즈 종이 나일론 메쉬 (그림 4) 몇 분 동안 침수 슬라이스 챔버에 U 자 모양의 백 금 철사에 고정을 청소의 작은 조각을 presoak합니다</li>
	<li>U 자 모양의 백 금 철사를 제거 합니다.</li>
	<li>재활용 전환 하 고 종이 청소 하는 렌즈에 슬라이스를 놓습니다.</li>
	<li>즉시 조각 위에 슬라이스 잡고 메쉬, 스위치는 펌프를 놓고 슬라이스는 실제 목적은 찍기에 없이 30 분 동안 equilibrate 하자.</li>
	<li>실제와 붕 micropipette (즉, 녹음 전극)를 작성 (저항 팁: 1-2 m ω, 1/3 실제 가득) 피 펫 홀더에 탑재.</li>
	<li>NaHCO3 솔루션으로 그것을 배치 하 여 금속 자극 전극의 절연 제를 확인 (&#62; 40 mM). DC 전압 발생기의 부정 극 전극 연결 (1-2 V, 긍정 극: 은색 또는 백 금 선), 해 부 현미경 아래 끝에 거품의 형성을 관찰 하 고 (&#62; 60 배 확대).</li>
	<li>조작 홀더에서 테스트 에폭시 절연 텅스텐 자극 전극을 놓고 슬라이스 챔버에 전선 참조.</li>
	<li>두 번째 참조 전극 챔버를 추가 하 고 기록 전극(그림 4)의 headstage의 참조 소켓에 연결.</li>
	<li>앰프 제어 소프트웨어에서 "제로 클램프 모드" 상자에서 클릭 하 고 "출력 이득 목록" 상자를 두 번 클릭 하 여 진행 합니다. 이득 선택 "100 년"의 "높은 통과 필터 목록 상자 (베셀)"를 두 번 클릭 "0.1 Hz,"를 선택 하 고 "3로"를 선택 하는 "낮은 패스 필터 목록 상자 (AC)"를 두 번 클릭</li>
	<li>클릭 기록 소프트웨어에는에 "취득 | 프로토콜을 엽니다. " 설정이 자동으로 에피소드 stimulations 고 50-100 ms에 대 한 10-20 kHz에서 증폭 된 잠재력의 디지털화에 대 한 허용 하는 프로토콜의 에피소드 녹화 시작 후 10 ms 자극 아이 솔 레이 터를 트리거를 선택 합니다.</li>
	<li>자극 및 기록 전극 선과 평행한 지층 pyramidale의 예 (그림 4B 및 그림 5)에 배치 합니다.</li>
	<li>클릭 "취득 | "프로토콜 편집 하 고 (팝업 창)에서"트리거"탭을 선택 합니다. 트리거 소스 "트리거 소스" 상자 및 선택 "스페이스 바" 클릭 합니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다. 인수를 시작 하 고 트리거 버튼으로 팝업 창에 "기록" 버튼을 클릭 합니다.</li>
	<li>자극 아이 솔 레이 터 소프트웨어에서 "전압 제어" 상자를 클릭 하 고 "0" 입력 "다운로드" 버튼을 클릭 합니다. "소프트웨어"를 녹음 창에 클릭 하 고 스페이스바를 누릅니다. 입력 하 여 순차적으로 값 1에서 8, 예를 들어 "전압 제어" 상자에서 1 mV 단계에이 주기를 반복 합니다.</li>
	<li>FEPSP 경사 값 자극 강도 연관 하 고 최대 fEPSP 슬로프의 40%를 얻을 하는 데 필요한 자극 강도 결정 합니다. "전압 제어 상자"를 클릭 하 고 결정된 된 값을 입력 합니다. "다운로드" 버튼을 클릭 합니다. 참고: 자극 아이 솔 레이 터는 뇌 조직에 간단한 전압 또는 전류 펄스를 적용 하는 데 사용 됩니다. 복 형 펄스 위상 당 100 µs를 가질 수 있습니다.</li>
	<li>레코딩 소프트웨어에서 정지 버튼을 누른 다음 "취득" 메뉴를 클릭 합니다. "편집 프로토콜"에 클릭 하 고 팝업 창에서 "트리거" 탭을 선택 하십시오. 트리거 소스 트리거 소스 상자 및 선택 "내부 타이머" 클릭 합니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다. 모든 30 필드 전위의 자동 녹음 시작 기록 단추를 클릭 예를 들면 s. 30-60 분 후 "정지" 버튼을 클릭 합니다.</li>
	<li>"취득" 메뉴에서 클릭, "개방형 프로토콜," 클릭 시 냅 스가 소성의 원하는 유도 프로토콜을 선택 하 고 "확인" 버튼을 클릭 합니다. 자동으로 활성화-고주파 자극 및 기록에 "기록" 버튼을 클릭 합니다. "정지" 버튼을 클릭 합니다. 참고: 경우 시 냅 스가 소성에 관한 연구, 적용 장기 potentiation 또는 장기간된 초기 녹음 후 장기 불황에 대 한 표준 유도 패러다임 중 하나. 시 냅 시스 전송의 결과 변조의 대표적인 예는 그림 7 과 그림 8에 묘사 된다.</li>
	<li>레코딩 소프트웨어에서 클릭 "취득 | 프로토콜 "열고 단계 4.12는 동일한 프로토콜을 선택 합니다. "확인" 버튼을 클릭 한 다음 "기록 합니다."를 클릭 자동으로 예를 들면 2-4 h에 대 한 필드 잠재적인 녹음을 실행 하십시오. 녹음을 종료 하려면 "stop" 버튼을 클릭 합니다.</li>
	<li>제약 연구 시 적용 화합물 직접는 실제 저수지 영구 복합 관리 경우 원하는 (그림 6).</li>
</ol>
5. 청소 설치 및 힌트
참고: 일반 팁에 대 한 아래 참조.
<ol>
	<li>더 이상 20 분, 이온 H2o. 세척 하 여 다음에 대 한 10% H2O2 를 재활용 하 여 매주 시스템 청소 참고: 에탄올 청소에 대 한 권장 하지 않습니다. 그것은 마찬가지로 바람직하지 몰입할 참조 전선 및 H2O2에 목표.</li>
	<li>렌즈 또는 0.1 N HCl와 다음 물 약 실 주변의 표면에 침전 된 소금을 제거 합니다.</li>
	<li>Carbogen bubbler 증류수 또는 0.1 N HCl을 씻어.</li>
	<li>담가 5 분 동안 10% H2O2 에 슬라이스 인큐베이션 챔버 일주일에 한 번 그리고 후 철저 하 게 린스 이온 H2o. 보육 실</li>
	<li>금속 자극 전극의 경우 각 실험 후 이온된 수로 자극 전극 팁을 린스 하 고 잔여 조직을 제거 하는 에탄올과 젖은 면봉으로 자극 전극 팁을 부드럽게 닦아 내십시오.</li>
	<li>샌드 페이퍼로 조심 슬쩍 통해 끝 단을 제거 하 여 상용 금속 자극 전극의 저항을 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>소계 튜브 실리콘 튜브를 대체 하 여 튜브를 통해 재활용 하는 동안은 실제에서 carbogen 손실을 줄일.</li>
	<li>양식에 AgCl 와이어 표면에 표 백제 몇 일 동안 기록 전극 및 참조 전극은 전선 유지.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.

인터페이스 슬라이스 챔버 더 강력한 시 냅 스 응답25,26,,2728전시, 침수 챔버 패치 클램프 기록 및 형광에 대 한 추가 편의 제공 이미지입니다. 따라서, 우리 신경17,18, 형광 프로브의 이미지를 쉽게 확장할 수 있는 상업 잠수 슬라이스 챔버를 사용 하 여 급성 hippocampal 조각에서 필드 잠재적인 녹음의 여러 측면을 설명 했습니다. 19. 조각 준비25, 외 많은 시간 후에 녹음 실에서 지속적인 carbogen 레벨의 유지 보수 장애물의 하나를 나타냅니다. Carbogen ...

1951 년에 처음 보고 급성 뇌 조각 실험 실시1했다. Piriform 피2,3 , hippocampal 신경 해 마4, 중 septotemporal 축 transversely 상호는 발견에서 성공적인 생체 외에서 녹음 후 1971 년에는 첫 체 외에 녹음 hippocampal 신경 활동의 달성된5이었다. Vivo에서 그리고 생체 외에서 조건 하에서 뉴런의 신경 생리학 또는 neurostructural 매개 변수의 유사성은 여전히6의 일부 토론 주제 하지만 1975 년에, Schwartzkroin7 표시는 기저 뉴런의 속성은 체 외에서 고 hippocampal 형성에 afferents의 그 높은-주파수 자극 (즉, tetanization)의 시 냅 스 전위8오랫동안 촉진 유도. 신경 활동의 기록 electrophysiological 생체 외에서 크게 확장 활동-종속 시 냅 스가 소성9,10, 블 리스에 의해 1973 년에 발견 했다 세포 메커니즘의 연구 외. 11 vivo에서 토끼로 실험.
신호 경로 뇌 조각, 그리고 급성 hippocampal 조각, 특히 신경 활동의 연구는 이제 표준 도구입니다. 그러나, 의외로, 실험 체 외에 는 아직 표준화 될 준비 및 급성 hippocampal 조각의 유지 보수에 대 한 여전히 존재 하는 여러 방법에 의해 입증. 리드 외. (1988) 12 조각 챔버의 다른 유형과 매체, pH, 온도 및 산소 레벨 목욕의 선택에 급성 뇌 조각의 유지 보수에 대 한 방법론 문제 검토. 이러한 매개 변수는 여전히 조각-녹음 설정 생체 외에서 의 맞춤 요소 때문 녹음 실에서 제어 하기 어렵다. 게시는 설명할 수 있습니다. 극복 하는 데 도움이 방법론 도전과 그의 일부 침수 슬라이스 챔버, 중간 3D microperfusion 시스템13, 향상 된 층 류 및 산소 챔버의 새로운 유형을 찾을 수 있습니다. 14, 컴퓨터 온도 제어15, 시스템 및 다중 챔버 녹음 시스템16공급 한다. 이러한 챔버 구축 하기 쉬운 이므로, 대부분의 과학자 들은 상업적으로 사용 가능한 슬라이스 챔버에 의존 합니다. 이 챔버는 전기 생리학 및 형광 이미징17,,1819의 조합에 대 한 되므로 현미경 시스템에 장착할 수 있습니다. 이 약 실은 뇌 조각 인공 척수 (실제)에 빠져들 계속, 버퍼 솔루션의 높은 유량 필요 유지, 약물 응용 프로그램의 비용을 증가 합니다. 이 위해, 우리는 유출-carbogenation 침수 슬라이스 챔버는 상대적으로 작은 실제 볼륨을 사용 하 여 필드 전위의 장기 기록에 대 한 충분 한 안정성을 제공 하는 재활용 관류 시스템을 통합 했습니다. 또한, 우리는이 실험 carbogenation/관류 시스템의 사용 활동-종속 시 냅 스가 소성10 의 결과 미치는 영향 및 진 핵 신장 요인 2 키 니 아 제 (eEF2K)의 억제 시 냅 스 변조 방법 요약 전송20.

<table><tbody><tr><td>< 강력 > 시약 필요 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm 화학 시약, 중국</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm 화학 시약, 중국</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>KH 2 PO 4 </td> <td>Sinopharm 화학 시약, 중국</td><td>10017618</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &미드닷; 6H < 이하> 2 < / 하>O</td><td>시노팜 화학 시약, 중국</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td> <td>Sinopharm 화학 시약, 중국</td><td>10005861</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO 3</td><td>Sinopharm 화학 시약, 중국</td><td>10018960</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>시노팜 화학 시약, 중국</td><td>10010518</td><td></td></tr><tr><td>NaH 2 PO4</td><td>Sinopharm 화학 시약, 중국</td><td>20040718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>시그마</td><td>A4043</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sinopharm 화학 시약, 중국</td><td>20025118</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm 화학 시약, 중국</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>해부</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decapitators</td>용 도구 및 재료 <td>Harvard 장치</td><td>55-0012</td><td>쥐 참수용</td></tr><tr><td>붕대 가위</td><td>SCHREIBER</td><td>12-4227</td><td>마우스 참수</td></tr><tr><td>양날 블레이드</td><td>Flying Eagle, 중국</td><td>74-C</td><td></td></tr><tr><td>홍채 가위</td><td>RWD, 중국</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>뼈 Rongeurs</td><td>RWD, 중국</td><td>S22002-14</td><td></td></tr><tr><td>숟가락</td><td>Hammacher&nbsp;</td><td>HSN 152-13</td><td></td></tr><tr><td>치과 시멘트 주걱</td><td>Hammacher&nbsp;</td><td>HSN 016-15</td><td></td></tr><tr><td>치과 더블 엔드 굴삭기</td><td>대장장이 외과, 미국</td><td>BS-415-017</td><td></td></tr><tr><td>진동 마이크로톰</td><td>라이카, 독일</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>수술용 칼날&nbsp;</td><td>RWD, 중국</td><td>S31023-02</td><td></td></tr><tr><td>수술 홀더</td><td>RWD, 중국</td><td>S32007-14</td><td></td></tr><tr><td><강력>전기생리학 장비 및 재료</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수직 피펫 풀러</td><td>Narishige, 일본</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>방진 테이블</td><td>Meirits, 일본</td><td>ADZ-A0806</td><td></td></tr><tr><td>수중형 기록 챔버</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>4축 마이크로매니퓰레이터</td><td>서터, 미국</td><td>MP-285, MP-225</td><td></td></tr><tr><td>플래티넘 와이어</td><td>세계 정밀 기기</td><td>PTP406</td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>분자 장치, 미국</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 시스템</td><td>분자 장치, 미국</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>분석기 소프트웨어</td><td>분자 장치, 미국</td><td>Clampex 10.2</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon, 일본</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>LED 광원</td><td>Lumen Dynamics Group, 캐나다</td><td>X-cite 120LED</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫</td><td>하버드 장치</td><td>GC150TF</td><td>세포 외 기록</td></tr><tr><td>붕규산 마이크로 피펫</td><td>Sutter, 미국</td><td>BF150-86</td><td>패치 클램프</td></tr><tr><td>텅스텐 전극</td><td>AM 시스템, 미국</td><td>575500</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>긴, 연동</td> 펌프용 <td>중국 BT00-300T</td><td></td></tr><tr><td>튜브</td><td>ISMATEC, Wertheim, 독일</td><td>SC0309</td><td>1x 유입, ID: 연동 펌프용 1.02mm</td></tr><tr><td>튜브</td><td>ISMATEC, Wertheim, 독일</td><td>SC0319</td><td>유출용 2x 튜브, ID: 2.79mm</td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>PCO, 독일</td><td>pco.edge sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>렌즈 청소지</td><td>Kodak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL 원추형 원심 분리기 튜브</td><td>Thermo scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Prechamber</td><td>Warner Instruments</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>인라인 히터</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

급성 hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

비록 뇌 조각에 실험 1951 년부터 사용 되었습니다, 문제는 필드 잠재적인 또는 세포내 녹음을 수행할 때 시 냅 시스 전송의 조음의 안정적이 고 성공적인 분석을 달성의 가능성을 감소 시키는 남아 있다. 이 원고는 상용 침수 챔버에 필드 흥분 성의 postsynaptic 잠재력 기록에 대 한 급성 뇌 조각의 유지 보수에 대 한 실험 조건 개선에 도움이 될 수 있는 방법론 기능을 설명 합니다. 와 유출 carbogenation 단위. 유출 carbogenation 약물 실험의 비용 효율성을 향상 시키기 위해 작은 버퍼 저수지의 재활용에 의존 하는 실험에서 산소 수준 안정화에 도움이 됩니다. 또한, 원고는 시 냅 시스 전송의 활동-종속 시 냅 스가 소성에 다른 carbogenation 모드와 자극 패러다임의 효과 검사 하는 대표적인 실험을 선물 한다.

프로토콜 섹션에서 우리는 조각의 급성 hippocampal hippocampal 형성 (그림 1)의 복 부와 중간 부분에서 남성 C57BL/6 마우스 및 남성 Wistar 쥐 (5-8 주)의 준비를 설명. 슬라이서 플랫폼에 반구의 위치 그들을 안정적으로 유지 하는 데 도움이 하 고 안정화 한 천 또는 agarose의 필요를 제거 합니다. 관류 시스템 자체 운영 하는 액체의 필요한 유량을 주고 높은 회전에 연동 펌프를 기반으로 합니다. 따라서, 펌프 내에서 표준 튜브의 급속 한 노후화 만든 우리 비 실리콘 튜브를 사용 하 여 극복 하는 상당한 문제 (ID: 1.02 m m). 유출에 대 한 부정적인 압력 2.79 m m 내부 직경 두 병렬 연결 된 관에 의해 만들어집니다. 이 두 관 액체(그림 4)의 열망에 대 한 수 있도록 녹음 실에서...

이 프로토콜 산소 수준 재활용된 버퍼의 작은 볼륨과 침수 급성 hippocampal 조각 활동 종속 시 냅 스가 소성 녹음의 방법 론 적 측면에서의 안정화를 설명 합니다.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

본 절차의 전반적인 목표는 소량의 재순환 ACSF를 간편하게 카보겐화(carbogenation)하는 방법을 제공하고, 형광 현미경에 장착된 기록 챔버를 사용하여 장기간의 장 전위(field potentials) 기록을 달성하는 것입니다. 이 방법은 세포 수준의 학습 및 기억에서 시냅스 전달과 기억 형성을 조절하는 근본적인 리간드 경로와 관련된 신경가소성 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소규모 바이오 저장조의 산소 수치를 안정화하여 특정 길항제 또는 효능제를 사용하는 실험의 비용 효율성을 높이는 것입니다.급성 해마 슬라이스 준비 과정은 본 실험실의 박사 과정 학생인 Xia와 Weiguang이 시연합니다. 이 절차를 시작하기 위해, 차가운 수술용 칼을 사용하여 각 뇌 반구의 등쪽 가장자리를 따라 70도 각도로 등쪽 피질 조각을 절개합니다. 차가운 치과용 시멘트 스패튤러를 사용하여 각 뇌 반구를 거름종이 조각으로 옮겨 표면을 잠시 건조시킵니다.갓 절단된 표면을 가진 두 뇌반구를 속건성 접착제를 사용하여 얼음처럼 차가운 절단 플랫폼에 고정하며, 이때 뇌반구의 미측 끝이 면도날을 향하도록 합니다. 그다음, 절단 플랫폼을 진동 절편기의 냉각 챔버에 넣습니다. 챔버를 2~4 °C의 절단 완충액으로 채우고 카보젠 처리를 합니다.그 후, 적절한 바이브로톰(vibrotome) 설정을 사용하여 350 µm 두께의 절편을 만듭니다. 두 개의 주입 캐뉼라를 가위처럼 사용하여 하마구(hippocampal formation)를 하구(subiculum) 및 내후각 피질(entorhinal cortices)로부터 분리합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 미리 준비한 배양 챔버의 절편 유지 메쉬에서 기포를 제거합니다.그 다음, 입방층(stratum pyramidal)에 어느 정도 투명도가 있는 절편들을 광구 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이싱 플랫폼에서 배양 챔버의 메쉬 위로 옮깁니다. 이 단계에서 순환 시스템의 유출구에 3방향 튜브 커넥터를 추가합니다. 3방향 튜브 커넥터의 중간 암을 카보젠(carbogen) 공급 튜브에 연결하고 공기 유량계로 유량을 조절합니다.그 후, 재순환 시스템의 유입구에 두 번째 3방향 튜브 커넥터를 추가합니다. 중간 암은 인라인 히터를 향하는 튜브에, 상단 암은 얇은 실리콘 튜브에, 하단 암은 저장조에서 나오는 유입 튜브에 각각 연결합니다. 그런 다음, 연동 펌프에 의해 생성된 슬라이스 챔버 내 ACSF의 맥동이 최소가 되는 지점의 얇은 실리콘 튜브에 튜브 스퀴저를 설치합니다.이제 렌즈 세정 종이의 작은 조각과 U자형 백금선에 고정된 나일론 메쉬를 침지 슬라이스 챔버 내에서 몇 분 동안 미리 적십니다. 그 후, U자형 백금선을 제거하십시오. 재순환 장치를 끄고 렌즈 세정 종이 위에 슬라이스를 배치합니다.그다음, 즉시 슬라이스 고정용 메쉬를 슬라이스 위에 놓습니다. 펌프를 켜고 대물렌즈를 ACSF에 담그지 않은 상태에서 슬라이스를 30분 동안 평형화합니다. 그동안 기록 전극을 ACSF로 채우고 피펫 홀더에 장착합니다.금속 자극 전극을 탄산수소나트륨 용액에 넣어 절연 상태를 확인합니다. 전극을 DC 전압 발생기의 음극에 연결하고, 해부 현미경 하에서 전극 끝에 기포가 형성되는지 관찰합니다. 그다음, 테스트를 마친 에폭시 절연 텅스텐 자극 전극을 매니퓰레이터 홀더에 배치하고 기준 전선을 슬라이스 챔버에 넣습니다.챔버에 두 번째 기준 전극을 추가하고 이를 기록 전극 헤드 스테이지의 기준 소켓에 연결하십시오. 증폭기 제어 소프트웨어에서 zero clamp mode 상자를 클릭한 다음, output gain 목록 상자를 더블 클릭하십시오. gain을 100으로 선택하고, high pass filter 상자를 더블 클릭하여 3 kHz를 선택한 후, low pass filter 목록 상자 AC를 더블 클릭하여 0.1 Hz를 선택하십시오.녹화 소프트웨어에서 acquire를 클릭하고 protocol을 엽니다. 에피소드식 자극과 10~20 kHz의 속도로 50~100 ms 동안 증폭된 전위의 디지털화를 허용하는 설정이 포함되어 있으며, 에피소드 기록 시작 10 ms 후에 자극 절연기를 자동으로 트리거하는 프로토콜을 선택하십시오. 자극 및 기록 전극을 피라미드층(stratum pyramidal)과 일직선이 되도록 평행하게 배치하십시오.이어서, acquire를 클릭하고 edit protocol을 선택한 후 팝업 창에서 trigger 탭을 선택합니다. trigger source 상자를 클릭하고 trigger source로 space bar를 선택합니다. 그런 다음, okay 버튼을 클릭하고 record 버튼을 클릭하여 획득을 시작합니다.자극 격리 소프트웨어에서 전압 제어 상자를 클릭하고 0을 입력하십시오. 다운로드 버튼을 클릭하십시오. 그 후, 기록 소프트웨어 창을 클릭하고 스페이스 바를 누르십시오.1000에서 8000까지의 값을 순차적으로 입력하여 이 사이클을 반복하십시오. 자극 강도와 FEPSP 기울기 값을 상관 분석하여, FEPSP 기울기 최대치의 40%를 얻는 데 필요한 자극 강도를 결정하십시오. 전압 제어 상자를 클릭하고 결정된 값을 입력하십시오.그런 다음 다운로드 버튼을 클릭합니다. 녹화 소프트웨어에서 정지 버튼을 클릭한 후 획득 메뉴를 클릭합니다. 프로토콜 편집을 클릭하고 팝업 창에서 트리거 탭을 선택합니다.그 후, 트리거 소스 상자를 클릭하고 트리거 소스로 내부 타이머를 선택하십시오. 확인 버튼을 클릭한 다음, 60초마다 장 전위(field potentials)를 자동으로 기록하는 기록 버튼을 클릭하십시오. 30분에서 60분 후에 정지 버튼을 클릭하십시오.녹화 소프트웨어에서 acquire를 클릭하고, open protocol을 선택한 다음 베이스라인 녹화와 동일한 프로토콜을 선택하십시오. 확인 버튼을 누른 후 record를 클릭하십시오. 2~4시간 동안 전위 기록을 자동으로 계속 실행하십시오.작업이 완료되면 정지 버튼을 클릭하여 기록을 종료합니다. 이 그림은 유출 카보겐 처리(outflow carbogenation)와 소량의 ACSF 저장조를 재순환시키는 저장조 카보겐 처리(reservoir carbogenation)를 이용한 시냅스 전달의 활동 의존적 강화의 대표적인 기록을 보여줍니다. 강화는 시점 0 이후에 100 Hz의 자극 열을 3회 가하여 유도되었습니다.이 그림은 소량의 ACSF 저장소를 재순환시키는 유출 카보젠화(outflow carbogenation) 방식이 저장소 단독 카보젠화 실험에 비해 LTD 유도를 개선했음을 보여줍니다. 숙달되면 슬라이스 제작은 5분에서 10분 내에 완료할 수 있으며, 적절하게 수행될 경우 수 시간 동안 안정적인 전위 기록을 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 사용하는 장비의 특성에 맞춰 카보젠화 수준, 관류 속도, 전극 위치 및 자극 강도를 조정하는 것이 중요합니다.본 절차 이후, 활동 의존적 시냅스 가소성 유도에 반응하는 ravin 프로브의 세포 내 국소화 및 수지상 돌기 세포의 남성화와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 패치 클램프나 포렌식 현미경 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발된 이 기술은 신경 가소성 분야의 연구자들이 야생형 및 형질전환 마우스 유전자의 in vitro 해마 절편에서 학습과 기억의 세포적 양식으로서 활동 의존적 시냅스 가소성을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 측두 해마로부터 급성 절편을 준비하는 방법과 소량의 재순환 ACSF를 사용하여 시냅스 전달의 장기 기록을 위한 안정적인 조건을 확보하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.동물 및 화학 화합물을 취급하는 것은 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용 및 적절한 소독과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

recording-synaptic-plasticity-acute-hippocampal-slices-maintained

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서는 뇌의 노화 및 알츠하이머 질환 같은 나이와 관련된 neurodegenerative 질병와 관련된 시냅스 변경의 연구를위한 유전자 변형 쥐 및 생쥐에서 hippocampal 조각 준비 절차를 설명합니다.

노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

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이 비디오는 시냅스 활동을 기록하기 위해 침수실에서 뇌 절편을 설정하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 렌즈 종이에 슬라이스를 고정하고, 신경 세포의 생존력을 보장하기 위해 인공 뇌척수액(aCSF)의 지속적인 흐름을 유지하고, 관심 있는 특정 뇌 영역과 관련된 자극 및 기록 전극을 정확하게 배치하는 것이 포함됩니다. 이 설정을 통해 기준선 시냅스 활동과 전기 자극의 영향을 정밀하게 모니터링할 수 있습니다.

Recording Neuronal Field Excitatory Postsynaptic Potentials in Acute Hippocampal Slices(급성 해마 절편에서 신경 필드 흥분성 시냅스 후 전위)

이 비디오는 쥐 해마 절편에서 CA3-CA1 시냅스 반응을 기록하는 방법을 보여줍니다. 해마 절편에 자극 및 기록 전극을 배치하고 시냅스 반응 강도를 평가하기 위해 fEPSP(field excitatory postsynaptic potential)를 측정하는 단계를 간략하게 설명합니다.

쥐 해마 절편에서 CA3-CA1 시냅스 반응 기록

이 비디오는 고립된 해마에서 세타 진동이라고도 하는 리드미컬한 뉴런 네트워크 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 전극은 세타 진동을 감지하고 분석하기 위해 다양한 층과 공간 위치에 삽입됩니다. 이것은 독특한 뉴런 구성과 해마의 여러 층에 걸친 뉴런 네트워크의 연결성을 보여줍니다.

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이 논문은 준비하고 유지하는 완벽한 방법을...

장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존

이 비디오 기사는 설치류의 급성 해마 절편을 사용하여 CA1 피라미드 뉴런에서 시냅스 태깅, 캡처 및 교차 태깅과 같은 장기 가소성과 연관 과정을 연구하기 위한 실험 절차를 설명합니다.

설치류에서 급성 해마 조각을 사용하여 시냅스 태그 / 캡처 및 크로스 캡처 조사

우리는 세로 해마 뇌 슬라이스에 기록 및 자극 전극을 사용하고 세포 외 후유증 전위를 불러 일으키고 입증하기 위해 생체 내 등도 해마에서 세로 로 배치 된 기록 및 자극 전극을 사용했습니다. 세로 인터라멜라 CA1을 따라 장기 시냅스 가소성.

전기 생리학 필드 기록에 의하여 인터라멜라 해마 CA1에 있는 장기 시냅스 가소성 조사

제시된 프로토콜은 잠재적인 항질 물질에 대한 전임상 평가 도구로 중요한 두뇌 조각을 사용하는 궁극적인 목표를 가진 절제된 인간 해마 조직의 수송 그리고 준비를 기술합니다.

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

이 프로토콜은 자발적인 날카로운 파도 잔물결 활동을 나타내는 마우스에서 수평 해마 내톨리날 피질 (HEC) 슬라이스의 준비를 설명합니다. 슬라이스는 단순화 된 인터페이스 보유 챔버에서 배양되고 기록은 조직의 산소화와 네트워크 수준의 활동의 자발적출현을 촉진하기 위해 빠르게 흐르는 인공 뇌척수액과 침수 된 조건에서 수행됩니다.

급성 마우스 뇌 슬라이스 자발적인 해 마 네트워크 활동을 조사

학습하세요 소량 재활용 ACSF에서 산소 수준을 안정화하고 형광 현미경 하에서 급성 해마 조각의 장기 시냅스 가소성을 기록하는 방법을. 이 기술은 신경가소성 연구의 비용 효율성을 높입니다.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

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