급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

이 절차의 전반적인 목표는 소량 재활용 ACSF의 발암 수단을 단순화하고 형광 현미경에 장착된 기록 챔버를 사용하여 전위를 장기간 기록하는 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 학습과 기억의 세포 모드에서 시냅스 전달 및 기억의 형성을 조절하는 기본 리그닌 경로와 관련된 신경 가소성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 길항제 또는 작용제를 사용하여 실험의 비용 효율성을 향상시키기 위해 작은 바이오 저장소의 산소 수준을 안정화하는 데 도움이 된다는 것입니다.

급성 해마 절편의 준비는 우리 실험실의 박사 과정 학생인 Xia와 Weiguang에 의해 입증되었습니다. 이 절차를 시작하려면 차가운 수술용 칼날을 사용하여 각 반구의 등쪽 가장자리를 따라 70도 각도로 등쪽 피질 조각을 절개합니다. 차가운 치과용 시멘트 주걱으로 각 반구를 여과지 조각으로 옮겨 표면을 잠시 건조시킵니다.

속효성 접착제를 사용하여 얼음처럼 차가운 슬라이싱 플랫폼에 갓 자른 표면이 있는 두 반구를 장착하여 반구의 꼬리 끝이 면도날을 향하도록 합니다. 다음으로, 슬라이싱 플랫폼을 비브라톰의 냉각실에 놓습니다. 챔버를 섭씨 2-4도에서 슬라이싱 버퍼로 채우고 발탄시킵니다.

그런 다음 적절한 진동 설정을 사용하여 350마이크로미터 슬라이스를 자릅니다. 두 개의 주사 캐뉼라를 가위로 사용하여 해마 대형을 subiculum 및 entorhinal cortices에서 분리합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 미리 준비된 배양 챔버의 슬라이스 보유 메쉬에서 기포를 제거합니다.

그런 다음, 큰 입의 파스퇴르 피펫을 사용하여 인큐베이션 챔버의 메쉬에있는 슬라이싱 플랫폼에서 피라미드 형의 지층에서 약간의 투명도를 가진 슬라이스를 옮깁니다. 이 단계에서는 재활용 시스템의 유출에 3방향 튜브 커넥터를 추가합니다. 3방향 튜브 커넥터의 중간 암을 탄원 공급 튜브에 연결하고 기류 측정기로 유량을 조절합니다.

그런 다음 재활용 시스템의 유입에 두 번째 3방향 튜브 커넥터를 추가합니다. 중간 암을 인라인 히터를 향하는 튜브에 연결하고, 위쪽 암을 얇은 실리콘 튜브에 연결하고, 아래쪽 암을 저장소의 유입 튜브에 연결합니다. 그런 다음 얇은 실리콘 튜브에 튜브 압착기를 올려 놓고, 튜브를 따라 연동 펌프에 의해 생성된 슬라이스 챔버에서 ACSF의 맥동이 최소인 위치에 놓습니다.

이제 렌즈 청소용 종이 한 장과 U자형 백금 와이어에 고정된 나일론 메쉬를 침지 슬라이스 챔버에 몇 분 동안 미리 담급니다. 그런 다음 U자형 백금선을 제거합니다. 재활용품의 전원을 끄고 렌즈 청소용 종이 위에 한 조각을 올려 놓습니다.

그런 다음 즉시 슬라이스를 잡고 있는 메쉬를 슬라이스 위에 놓습니다. 펌프를 켜고 대물렌즈를 ACSF에 담그지 않고 슬라이스가 30분 동안 평형을 이루도록 합니다. 그 동안 기록 전극에 ACSF를 채우고 피펫 홀더에 장착합니다.

금속 자극 전극을 중탄산나트륨 용액에 넣어 절연을 확인하십시오. 전극을 DC 전압 발생기의 음극에 연결하고 해부 현미경으로 팁에 기포가 형성되는 것을 관찰합니다. 다음으로, 테스트된 아폭시 절연 텅스텐 자극 전극을 매니퓰레이터 홀더에 놓고 기준선을 슬라이스 챔버에 놓습니다.

챔버에 두 번째 기준 전극을 추가하고 기록 전극의 헤드 스테이지의 기준 소켓에 연결합니다. 에서 ampliifier 제어 소프트웨어에서 제로 클램프 모드 상자를 클릭한 다음 출력 게인 목록 상자를 두 번 클릭합니다. 게인 100을 선택하고, 고역 통과 필터 상자 용기를 두 번 클릭하고, 3킬로헤르츠를 선택하고, 저역 통과 필터 목록 상자 AC를 두 번 클릭하여 0.1헤르츠를 선택합니다.

녹음 소프트웨어에서 acquire, open protocol을 클릭합니다. 50 - 100 밀리초 동안 10 - 20 킬로헤르츠에서 일시적 자극 및 증폭된 전위의 디지털화를 허용하는 설정이 있고 에피소드 기록 시작 후 10 밀리초 후에 자극 아이솔레이터를 자동으로 트리거하는 프로토콜을 선택하십시오. 자극 및 기록 전극을 피라미드 지층과 일직선으로 평행하게 배치합니다.

그런 다음 acquire(획득), edit protocol(프로토콜 편집)을 클릭하고 팝업 창에서 트리거 탭을 선택합니다. 트리거 소스 상자를 클릭하고 스페이스 바를 트리거 소스로 선택합니다. 그런 다음 확인 버튼을 클릭하고 기록 버튼을 클릭하여 획득을 시작합니다.

자극 아이솔레이터 소프트웨어에서 전압 제어 상자를 클릭하고 0을 입력합니다. 다운로드 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 녹음 소프트웨어 창을 클릭하고 스페이스 바를 누릅니다.

1000에서 8000 사이의 값을 순차적으로 입력하여 이 주기를 반복합니다. 자극 강도를 FEPSP 기울기 값과 연관시키고 FEPSP 기울기 최대값의 40%를 얻는 데 필요한 자극 강도를 결정합니다. 전압 제어 상자를 클릭하고 결정된 값을 입력합니다.

그런 다음 다운로드 버튼을 클릭합니다. 녹음 소프트웨어에서 중지 버튼을 클릭한 다음 획득 메뉴를 클릭합니다. edit protocol(프로토콜 편집)을 클릭하고 팝업 창에서 트리거 탭을 선택합니다.

그런 다음 트리거 소스 상자를 클릭하고 내부 타이머를 트리거 소스로 선택합니다. 확인 버튼을 클릭한 다음 60초마다 필드 전위의 자동 기록을 시작하는 기록 버튼을 클릭합니다. 30분에서 60분 후에 중지 버튼을 클릭합니다.

레코딩 소프트웨어에서 acquire(획득), open protocol(프로토콜 열기)을 클릭하고 기본 레코딩과 동일한 프로토콜을 선택합니다. 확인 버튼을 클릭하고 녹음을 클릭합니다. 2-4시간 동안 필드 전위 기록을 자동으로 실행합니다.

완료되면 중지 버튼을 클릭하여 녹음을 종료합니다. 이 그림은 작은 ACSF 저장소의 재활용을 통한 유출 침탄 및 저장소 발암을 사용한 시냅스 전달의 활성 의존적 강화의 대표적인 기록을 보여줍니다. 강화는 시점 0 이후에 초당 100헤르츠 열차의 3배에 의해 유도되었습니다.

이 그림은 작은 ACSF 저류층의 재활용을 통한 유출 기질화가 저류층 발암만을 사용한 실험과 비교하여 LTD 유도를 개선했음을 보여줍니다. 일단 마스터하면 슬라이스 준비는 5분에서 10분 안에 완료할 수 있으며 적절하게 수행되면 몇 시간 동안 안정적인 필드 전위 기록도 달성할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 발암 수준, 관류 속도, 전극의 위치 및 특정 동등성의 자극 스트레스를 조정하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 패치 클램프와 같은 다른 방법, 법의학 현미경을 수행하여 활성 의존적 시냅스 가소성의 유도에 대한 응답으로 ravin 프로빙의 SAP 세포 국소화의 남성화와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 신경 가소성 분야의 연구자들이 웰 탭 및 형질전환 마우스 유전자의 체외 해마 절편에서 학습 및 기억의 세포 모드로서 활동 의존적 시냅스 가소성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 측두해마에서 급성 절편 준비를 수행하는 방법과 소량의 재활용 ACSF를 사용하여 시냅스 전달을 장기간 기록하기 위한 안정적인 조건을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

동물 및 화학 화합물과 함께 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용 및 적절한 소독과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.