Name: 높은 분자량 Biotinylated Dextran 아민 Thalamocortical 프로젝션 쥐에 추적에 대 한 응용 프로그램 향상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 배우세요 고분자량 BDA를 이용한 쥐 중추신경계 신경회로 추적법. 공초점 레이저 현미경으로 세포 수준의 신경 구조를 시각화하고 국소 신경회로 특성을 분석하는 정교한 프로토콜입니다.

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이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 (프로젝트 코드 번호 81373557, no. 81403327)에 의해 투자 되었다.

이 연구 윤리 위원회에는 중국의 중국 의학 과학원 (참조 번호 20160014)에 의해 승인 되었다. 모든 절차는 관리 및 실험 동물 사용 (국가 아카데미 압박, 워싱턴, D.C., 1996)에 대 한 국가 학회 건강 가이드에 따라 실시 했다. 4 성인 남성 쥐 (체중 250-280 g)이이 연구에 사용 되었다. 모든 동물에 12 h 명암 주기 제어 온도와 습도, 그리고 음식과 물에 자유 접근. 악기 및 현재 연구에 사용 된 자료 그림 1에 보였다 했다.  수술을 하기 전에 모든 장비 stereotaxic 프레임 및 유리 피 펫, 70% 에탄올을 사용 하 여 청소 했다.
1. 수술 절차
<ol><li>VPM stereotaxic 아틀라스9 (그림 2A)를 사용 하 여에 대 한 관심의 좌표 위치를 결정 합니다.</li>
	<li>1 µ L 마이크로-주사기 (약 10-20 µ m의 팁 직경)와 유리 제 micropipette 장착 준비 (그림 1D) 액체 파라핀으로 그것을 테스트.</li>
	<li>복 주입에 의해 7 %chloral 하이드 레이트 (0.7 mL/100 g)와 쥐를 anesthetize.</li>
	<li>깊은 마 취 확인 꼬리 핀치 철수 반사 페달, 전기 면도기와 동물의 머리의 면도 하 고 뒤 70% 에탄올에 각각 10 %povidone 요오드와 수술 부위의 3 번 스크럽.</li>
	<li>쥐 stereotaxic 장치에 무딘 귀 바 귀에 배치 하 여 고 입 홀더 (그림 1E)로 쥐의 위 앞 니를 장소 놓고 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>70% 에탄올을 사용 하 여 다시 수술 부위의 머리 피부를 청소. 무 균 조건 하에서 수술을 유지 하기 위해 무 균 수술 장갑과 수건을 사용 합니다.</li>
	<li>화살 봉합 (그림 1 층)에 따라 메스로 피부에 절 개를 화살을 확인 합니다.</li>
	<li>근육과 살 균 면 밀고 도포를 사용 하 여 제어 출혈 (그림 1 층)을 수술을 통해 두개골에서과 다쳤어요.</li>
	<li>아틀라스 (그림 2A)에서 미리 정의 된 좌표를 사용 하 여 craniotomy (그림 1G)의 위치 (-3.3 m m Bregma 포인트, 2.6 m m 오른쪽 중간에) 결정 합니다.</li>
	<li>Craniotomy 라운드 팁 비트 (#106) (그림 1 H)와 함께 버 드릴을 사용 하 여 수행 하 고 계속 meninges (그림 1I)에 도달할 때까지 몇 분 이내는 1 mm 깊이 대 한 드릴.</li>
	<li>Dura mater 사출 사이트 (그림 1I)을 통해 대뇌 피 질을 노출 하는 microforceps를 사용 하 여 삭제하시오</li>
	<li>10 %BDA (10000 분자량, 증류수에) 솔루션 (그림 1J) 마이크로 주사기에 액체 파라핀을 변경 합니다.</li>
	<li>Microinjection 장치에 주사기를 탑재 하 고 마이크로 펌프 (그림 1 K)와 연결 합니다. 참고: 볼륨 주입 마이크로 펌프의 속도에 따라 달라 집니다. 여기 그것은 nL/30min (그림 1 L)에 조정 되었다.</li>
	<li>stereomicroscope에서 5.8 m m (그림 1 M)의 깊이에서 뇌의 대뇌 피 질의 표면을 통해 VPM에 유리 제 micropipette microinjection 장치를 수동으로 삽입 합니다.</li>
	<li>압력 주입 100 10%의 nL 마이크로 펌프 (그림 1 L, M)와 3 분 (35 nL/min)의 기간 동안 VPM에 BDA.</li>
	<li>주입 후 추가 5 분을 위한 장소에 피펫으로 유지 하 고 천천히 철수 다음.</li>
	<li>무 균 실 (그림 1N) 상처 봉합 사전 및 수술 후 진통에 대 한 당신의 현지 동물 보호 위원회 지침을 따릅니다.</li>
	<li>의식 회복은 완 치 될 때까지 따뜻한 복구 영역에 쥐를 놓습니다.</li>
	<li>그것의 감 금 소를 다시 복구 된 쥐를 반환 합니다.</li>
</ol>2. perfusions 및 섹션
<ol><li>일반적으로 10 일의 생존 시간 후 안락사를 유도 복 주입 하 여 사용 10% 우 레 탄 (2 mL/100 g)의 과다와 동물을 주입.</li>
	<li>(그림 1O) 후드에서 실험 쥐 perfuse<ol>
<li>호흡 중지가 위, 집게를 사용 하 여 마음에 액세스 하는 쥐의 흉 강을 엽니다. 대동맥으로 좌 심 실에는 정 맥 카 테 터를 삽입 한 다음 오른쪽 auricle 엽니다.</li>
		<li>먼저 perfuse 0.9% 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 생리 적인 온도 (37 ° C)와 약 1-2 분 혈액에서에서 종료 될 때까지의 선택을 취소 한 다음 0.1 M 인산 버퍼 (PB, pH 7.4)에 250-300 mL 4 %paraformaldehyde 계속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>관류, 후 머리 피부를 incise 하 고, 두개골을 열고 쥐 뇌를 해 부. 후 해 부 뇌 실내 온도 (26 ℃), 0.1 m M PBS (pH 7.4) 두뇌 솔루션 (그림 1 P)에 몰입 될 때까지 4 ° C에서 3 일 동안에 30% 자당 다음 cryoprotect에서 2 h 4 %paraformaldehyde 수정.</li>
	<li>두뇌는 솔루션에 몰입은, 일단 뇌 매트릭스 (그림 1 분기)에 코로나 방향에 3 개의 블록으로 두뇌를 나눕니다. 중앙 블록 VPM와 s 1에 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>톰 시스템 코로나 방향으로 슬라이딩 동결 단계에 40 µ m에서 뇌의 중앙 블록을 잘라. 이러한 섹션 (인물 1R, S) 0.1 M PBS (pH 7.4)를 가진 6-잘 접시에 질서를 수집 합니다.</li>
</ol>3. 표준 ABC 얼룩
참고: 두뇌의 모든 세 번째 코로나 섹션에서 무료 부동 섹션 표준 ABC 절차10BDA 라벨 시각화 사용 되었다.
<ol><li>약 1 분 동안 0.1 M PBS에 섹션 린스.</li>
	<li>(PH 7.4) 포함 0.3%에서 0.1 M PB 1 %ABC 솔루션에서 섹션을 품 어 실 온에서 1 h에 대 한 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>워시 50 m m Tris 버퍼 (pH 7.4)에 세 번 섹션.</li>
	<li>0.02 %3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (한 덩어리) 및 실 온에서 약 2-5 분 50 mM Tris 버퍼에 0.01% H2O2 를 포함 하는 솔루션에 섹션을 얼룩.</li>
	<li>워시 50 m m Tris 버퍼 (pH 7.4)에 세 번 섹션.</li>
	<li>현미경 슬라이드 표준 조직화 학적인 기법 (1T 그림; 참조 추가 비디오 파일 III, 관류 및 섹션)를 사용 하 여 섹션을 탑재 합니다.</li>
	<li>건조 실 온에서 하룻밤 공기에 섹션.</li>
	<li>탈수 알코올 (50%, 70%, 95%, 100%) 솔루션의 일련에 간단히 섹션. 약 15 각 솔루션에 슬라이드 잠수함 s. 각 단계 사이 건조 슬라이드를 허용 하지 않습니다.</li>
	<li>크 실 렌에서 섹션 3 회, 약 20 분을 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>조각에 봉 선화의 2 또는 3 방울을 넣어 다음 coverslips 섹션에 배치 합니다.</li>
</ol>4. BDA 및 대뇌 피 질에 기본 신경 요소 더블 형광 성 얼룩
참고: 반면, 이중 형광 얼룩 실시 BDA 라벨의 상관 관계를 관찰에 대 한 위의 인접 섹션에 기본 신경 요소 streptavidin AF594와 함께 사용 하 고 형광 Nissl 얼룩 AF500/525와 counterstained.
<ol><li>약 1 분 동안 0.1 M PBS에 섹션 린스.</li>
	<li>(PH 7.4) 포함 0.3 %streptavidin-AF594 (1: 500) 및 0.1 M PBS에 AF500/525 녹색 형광 Nissl 얼룩 (1:1, 000)의 혼합 솔루션에서 섹션을 품 어 실 온에서 2 h에 대 한 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>0.1 m M PB (pH 7.4)에 세 번 섹션을 씻어.</li>
	<li>현미경 슬라이드 표준 조직화 학적인 기술을 사용 하 여 섹션을 탑재 합니다. 약 1 h 공기에 섹션을 건조.</li>
	<li>관찰 하기 전에 증류수에 50% 글 리세 린과 형광 섹션에 coverslips를 적용 합니다.</li>
</ol>5. 더블 형광 얼룩 BDA 및 대뇌 피 질에서 수
참고: 이중 형광 얼룩 BDA 라벨 및 streptavidin AF594와 태양광 발전-immunochemistry 대뇌 피 질의 대상에서 대표 섹션에 수의 상관 관계를 관찰 실시 했다.
<ol><li>약 1 분 동안 0.1 M PBS (pH 7.4)에 대표 섹션 린스.</li>
	<li>차단 솔루션 3% 정상 염소 혈 청 0.3%를 포함 하는 섹션을 품 어 30 분 0.1 M PBS에 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>전송 섹션 마우스 단일 클로 널 안티-PV IgG (1:1, 000) 0.1 M PBS (pH 7.4) 포함 1% 정상 염소 혈 청에 0.3%의 솔루션으로 4 ° c.에 하룻밤을 위해 트라이 톤 X-100</li>
	<li>다음 날, 0.1 m M PBS (pH 7.4)에 세 번 섹션을 씻어.</li>
	<li>염소 안티 mouse AF488 이차 항 체 (1: 500), 0.1 m M PBS (pH 7.4) 포함 1% 정상 염소 혈 청에서 streptavidin-AF594 (1: 500), 그리고 4' 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI, 1:40, 000) 및 0.3의 혼합 솔루션 섹션 노출 % 트리톤 1 h X-100입니다.</li>
	<li>4.5 4.3 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>6입니다. 관찰
<ol><li>VPM, 축 삭 thalamocortical, 및 corticothalamic 신경의 이미지를 가져가 라.<ol>
<li>목표 렌즈를 장착 하는 confocal 이미징 시스템으로 형광 샘플 관찰 (4 x, 나: 0.13; 10 x, 나: 0.40;와 40 x, 나: 0.95). 사용 하 여 405 (파랑), 488 (녹색)의 여기 및 방출 파장 및 559 (빨간색) nm. 참고: 여기, confocal pinhole 152 µ m (4 배, 10 배)와 105 µ m (40 x)입니다. 이미지 캡처의 공간 해상도 1024 × 1024 픽셀 (4 배, 10 배) 및 640 × 640 픽셀 (40 x).</li>
		<li>40 µ m (Z 시리즈)의 두께에 각 섹션에서 2 µ m의 연속 프레임에 20 이미지를 가져가 라.</li>
		<li>다음과 같이 3 차원 분석을 위한 소프트웨어 시스템을 처리 하는 confocal 이미지와 단일-초점 이미지에 이미지를 통합: 설정된 시작 초점 평면 → 설정된 끝 초점면 → 설정된 단계 크기 → 선택 깊이 패턴 → 이미지 캡처 → Z 시리즈.</li>
	</ol>
</li>
	<li>디지털 카메라를 갖춘 가벼운 현미경에 의해 명시 이미지를 받아 (4 x, 나: 0.13; 10 x, 나: 0.40;와 40 x, 나: 0.95 렌즈). 노출 시간의 500 양 사용 사진 편집 소프트웨어를 사용 하 여 이미지의 명암과 밝기를 조정 하 고 레이블 추가를.</li>
</ol>

<ol><li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single-+and+double-labeling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies.</a> J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).</li>
<li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).</li>
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<li>Zhang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+and+retrograde+tracing+with+high+molecular+weight+biotinylated+dextran+amine+through+thalamocortical+and+corticothalamic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways.</a> Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).</li>
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<li>Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamo-cortical+processing+of+vibrissal+information+in+the+rat.+I.+Intracortical+origins+of+surround+but+not+centre-receptive+fields+of+layer+IV+neurones+in+the+rat+S1+barrel+field+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex.</a> J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).</li>
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<li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+diffusion+of+3000+molecular+weight+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines.</a> J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

적절 한 추적 프로그램을 선택 하는 성공적인 신경 추적 실험에 대 한 중요 한 단계입니다. BDA, 높은 분자량 BDA의 가족에서 (10, 000 분자량) 저 분자 무게 BDA (분자량 3000)2,3 달리 참가자 신경 통로 통해 우선적으로 수송 될 추천 , 11 , 12 , 그러나 13., 많은 연구는 또한 그 높은 분자량 BDA도 사용 될 수 있습니다 잠재적으로1,2,3추적 참가자와 병렬로 역행 경로 추적에 대 한 제안 했다. VPM와 S1 간의 상호 신경 경로 통해 우리...

높은 분자량 BDA (10000 분자량), 매우 민감한 트레이 서 20 년 이상의1중추 신 경계에서에서 신경 경로 추적 사용 되었습니다. BDA의 사용은 일반적인 신경로 추적 기법, BDA 라벨의 품질 다양 한 요인1,,23에 의해 동물에서 달라질 수 있습니다. 우리의 최근 연구 표시 BDA 라벨의 최적의 구조는 관련 된 적절 한 후 주입 생존 시간 뿐만 아니라 또한 착 색 방법4와 상관. 지금, 기존의 avidin 비타민 b 복합체 과산화 효소 복합물 (ABC), streptavidin fluorescein isothiocyanate streptavidin-AF594까지 착 방법은 이전의 연구2,3, BDA 라벨 공개에 대 한 사용 되었다 4,5. 비교에서는, 형광 성 얼룩 BDA에 대 한 수행할 수 있습니다 쉽게.
높은 분자량 BDA의 응용 프로그램을 확장 하기 위하여 세련 된 프로토콜은 현재 연구에 도입 되었다. 쥐 뇌에서 시상의 VPM에 BDA의 주입, 따라 이중 형광 얼룩, BDA 라벨의 상관 관계를 관찰을 위해 실시 되었다 뿐만 아니라 표준 ABC 얼룩의 일반적인 방법으로 계시 고 기본 했다 BDA 라벨 신경 요소 또는 streptavidin AF594 및 형광 Nissl histochemistry 또는 PV-immunochemistry, 대뇌 피 질의 대상에 수 각각. VPM 기본 somatosensory 피 (S1)6,,78사이 상호 신경 경로 통해 우리는 BDA 예상 thalamocortical 축 삭 및 corticothalamic에 라벨에 우리의 관찰 집중 s 1에서 예상된 셀 somas입니다. 이 과정에 의해 우리는 높은 분자 무게 BDA, 신경 라벨의 높은 품질을 얻기 위해 상세한 프로토콜 뿐만 아니라 다른 형광 신경 마커 및 형광 BDA 라벨의 조합에 세련 된 프로토콜을 제공할 것으로 예상 histochemistry 또는 immunochemistry입니다. 이 접근은 로컬 신경 회로 confocal 레이저 스캐닝 현미경 아래에서 그들의 화학 특성을 공부 하는 것이 좋습니다.

<table><tbody><tr><td>Biotinylated dextran amine (BDA)</td> <td>분자 프로브</td><td>D1956</td><td>10,000 분자량</td></tr><tr><td>Streptavidin-Alexa Fluor 594</td><td>분자 프로브</td><td>S32356</td><td>빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>500/525 녹색 형광 Nissl 얼룩</td><td>분자 프로브</td><td>N21480</td><td>빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>뇌 입체 택시 기기</td><td>Narishige</td><td>SR-50</td><td></td></tr><tr><td>냉동 마이크로톰</td><td>Thermo</td><td>Microm International GmbH</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 이미징</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>시스템</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 드릴</td><td>Saeyang Microtech</td><td>Marathon-N7</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley</td><td>Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences</td><td>SCKX (JUN) 2012-004</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC 키트</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus 현미경 슬라이드</td><td>Thermo</td><td>#4951PLUS-001</td><td>25x75x1mm</td></tr><tr><td>포토샵 및 일러스트</td>레이션 <td>Adobe</td><td>CS5</td><td></td></tr></tbody></table>

높은 분자량 biotinylated dextran 아민 thalamocortical 프로젝션 쥐에 추적에 대 한 응용 프로그램 향상

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

높은 분자량 biotinylated dextran 아민 (BDA)은 많은 십 년간 동안 매우 민감한 신경 해부학 추적 프로그램으로 사용 되었습니다. 이후 그 라벨의 품질은 여기, 다양 한 요인에 의해 영향을 제공 세련 된 프로토콜 높은 분자량 BDA의 응용 프로그램에 대 한 중앙 신경 시스템에 최적의 신경 라벨을 공부 합니다. 복 부 posteromedial 핵 (VPM)의 섬세 한 유리 피 펫을 통해 쥐에 시상에 BDA의 정위 적 주입 후 BDA 형광 streptavidin-알 렉 사 (AF) 594로 얼룩진 고 형광 Nissl 얼룩 AF500/525와 counterstained. 녹색 Nissl 얼룩의 배경, 빨간 BDA 라벨, 신경 셀 시체 및 axonal 터미널을 포함 하 여 더 분명히 somatosensory 피 질에서 시연 했다. 또한, BDA에 대 한 형광 염색을 두 번 및 칼슘 묶는 단백질 parvalbumin (PV) BDA 라벨 및 로컬 신경 공부 하는 기회를 제공 하는 대뇌 피 질의 대상에 태양광 발전-긍정적인 수의 상관 관계를 관찰 하기 위해 실시 되었다 회로 및 그들의 화학 특성 따라서,이 세련 된 방법은 고품질 신경 시상과 대뇌 피 질 사이의 상호 신경 경로 통해 높은 분자량 BDA로 머릿속에 적합 하지 않습니다 하지만 또한 동시 시범 허용 됩니다. 다른 신경 마커 형광 histochemistry 또는 immunochemistry입니다.

BDA는 VPM에 10 일 포스트 주입의 생존 강렬한 신경 라벨 해당 피 질 영역에 주입 쪽 (그림 2) 동측 생산에 대 한 충분 한 했다. 기존 ABC와 BDA에 대 한 절차를 얼룩이 지기 형광 공개 anterogradely를 포함 하 여 s 1에 신경 라벨의 비슷한 패턴 thalamocortical 축 삭을 표시 하 고 retrogradely corticothalamic 신경 (그림 2C, D를 표시 ).
축 삭을 표시 하는 anterogradely에 대 한 그들은 레이어 2에서에서 레이어 6 레이어 4에 높은 밀도로 관찰 했다 그리고 thalamocortical 축 삭의 전형적인 유형 배럴 영역 (<strong class=...

여기, 선물이 효과적으로 상호 신경 통로 통해 방법 얼룩이 지기 형광으로 biotinylated dextran 아민 (BDA)를 공개 하는 세련 된 프로토콜. 그것은 미세 구조 분석 적합 BDA 라벨 및 다른 신경 요소 confocal 레이저 스캐닝 현미경 아래에서 구별의.

높은 분자량 Biotinylated Dextran 아민 Thalamocortical 프로젝션 쥐에 추적에 대 한 응용 프로그램 향상

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

이 영상의 전반적인 목표는 중추신경계의 최적의 신경 라벨링 연구를 위해 고분자 BDA를 적용하는 정교한 프로토콜을 시연하는 것입니다. 이러한 측정 방법은 신경 회로를 통한 신경 라벨링의 프레임 구조를 시각화함으로써, 신경망 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 국소 신경 회로와 그 화학적 특성을 연구할 수 있는 기회를 제공한다는 점입니다. 유리 마이크로피펫이 장착된 1 µL 마이크로시린지를 준비하고, 액체 파라핀을 흡입하여 정상 작동 여부를 테스트하십시오. 승인된 프로토콜에 따라 쥐를 마취시킨 후, 꼬리 꼬집기 자극에 반응이 없는 것을 통해 심부 마취 상태임을 확인하십시오.그런 다음 전기 면도기로 동물의 머리 윗부분을 깎고, 수술 부위를 10% povidone iodine으로 문질러 닦은 후 70% ethanol로 닦아냅니다. 둔탁한 이어 바(ear bars)를 귀에 삽입하고 쥐의 상악 절치(upper incisors)를 마우스 홀더에 고정하여 쥐를 스테레오택식 장치(stereotaxic device)에 고정합니다. 눈에는 안연고를 도포합니다.멸균 상태를 유지하기 위해 멸균 수술 장갑과 드레이프를 사용하십시오. 70% ethanol을 사용하여 수술 부위의 두피를 다시 세척합니다. 메스로 시상봉합선을 따라 피부에 시상 절개를 가한 후, 멸균 면봉을 사용하여 두개골에서 근육과 골막을 긁어 제거하십시오.아틀라스의 미리 정의된 좌표를 사용하여 두개골 절개 위치를 결정합니다. 라운드 팁 비트가 장착된 버 드릴을 사용하여 뇌수막이 보일 때까지 약 1 mm 깊이로 구멍을 뚫어 두개골 절개를 수행합니다. 마이크로 포셉을 사용하여 경막을 절제함으로써 주입 부위 위의 대뇌 피질을 노출시킵니다.마이크로시린지에서 액체 파라핀을 배출한 다음 10% BDA 용액을 흡입합니다. 시린지를 마이크로인젝션 장치에 장착하고 마이크로펌프를 연결합니다. 실체현미경 하에서 마이크로인젝션 장치를 조작합니다.충전된 유리 마이크로피펫을 뇌의 피질 표면을 통해 VPM에 5.8 millimeters 깊이까지 삽입합니다. 그런 다음, 마이크로펌프를 사용하여 10%BDA 100 nanoliters를 3분에 걸쳐 VPM에 압력 주입합니다. 5분 후에 피펫을 천천히 제거합니다.멸균사를 사용하여 상처 부위를 봉합한 후, 쥐가 의식을 되찾고 완전히 회복될 때까지 따뜻한 회복 구역에 둡니다. 쥐를 안락사시킨 후, 가위와 포셉을 사용하여 쥐의 흉강을 열고 심장에 접근합니다. 좌심실에서 대동맥 방향으로 정맥 카테터를 삽입한 다음, 우심방을 엽니다.먼저, 심장에서 나오는 혈액이 투명해질 때까지 생리학적 온도에서 0.9% saline으로 약 1~2분 동안 관류합니다. 그 다음, 0.1 molar 인산염 완충액에 포함된 4% paraformaldehyde 250~300 mL로 관류를 계속합니다. 적출한 뇌를 4% paraformaldehyde에 넣고 실온에서 2시간 동안 후고정합니다.그런 다음 뇌를 0.1 molar PBS 내의 30% sucrose로 옮겨 4°C에서 3일 동안 동결 보호합니다. 3일 후 뇌가 용액 속에 가라앉으면, 브레인 매트릭스를 이용하여 뇌를 관상면 방향으로 세 개의 블록으로 나눕니다. 중앙 블록에는 일차 체성감각 피질의 시상 후내측복측핵이 포함되어 있습니다.뇌의 중앙 블록을 슬라이딩 마이크로톰의 냉동 스테이지에 장착하여 관상면으로 절편을 제작하며, 냉동 상태에서 40 microns 두께로 절단합니다. 0.1 molar PBS가 담긴 6-웰 디쉬에 절편을 수집합니다. 흔들어주며 약 1분 동안 0.1 molar PBS로 절편을 헹궈 염색을 시작합니다.그 다음 절편들을 0.3% Triton X-100이 포함된 0.1 molar PBS 내의 streptavidin-AF594와 AF500/525 녹색 형광 Nissl 염색액 혼합 용액으로 옮기고, 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 염색 후, rocking을 이용하여 0.1 molar PB로 절편들을 3회 세척합니다. 표준 조직화학 기법을 사용하여 절편들을 현미경 슬라이드에 마운팅합니다.절편을 약 1시간 동안 공기 중에서 건조합니다. 슬라이드를 이미징하기 전, 형광 절편에 증류수로 희석한 50% glycerin을 도포하고 커버슬립을 덮습니다. 이 대표 광미세구조 사진은 녹색 Nissl 염색 배경 위에 시상 배측 후내측 핵의 BDA 주입 부위를 빨간색으로 보여줍니다.여기에는 4층의 시상피질 축삭과 5층 및 6층의 피질시상 뉴런을 포함한 thorescent BDA 라벨링 결과가 표시되어 있습니다. 비교를 위해, 표준 avidin-biotin peroxidase 절차를 이용한 일반적인 BDA 라벨링 광미세사진을 보면 thorescent BDA 라벨링과 유사한 신경 라벨링 패턴이 나타남을 알 수 있습니다. thorescent BDA로 라벨링된 절편의 고배율 확대 이미지는 적색으로 표시된 전방향성 라벨링 축삭 수지상 구조를 상세히 보여줍니다.역행성으로 표지된 신경세포체, 수지상돌기 및 수지상돌기 가시를 여기서 자세히 보여줍니다. 숙련되면, 적절하게 수행할 경우 두개골 절제술과 입체정위 주입을 20분에서 30분 내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 신경 연결을 복원하기 위해 고분자량 BDA를 적용하는 방법과 신경 표지의 세부 구조에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

Transsynaptic tracing은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중심 원심성을 분석하기 위한 강력한 도구가 되었습니다. 여기에서는 시냅스경이 횡단하는 광견병 바이러스를 활용하여 기능적인 뇌 회로를 식별하고 국소화하는 프로토콜을 제시한 다음, 식별된 뉴런 그룹 간의 회로에서 특정 연결을 검증하기 위한 고전적인 요로 추적 기술을 제시합니다.

Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적

수술 방법은 신생아 쥐의 복부 두개골을 노출 설명되어 있습니다. 이 방법을 사용하면 마취 새끼 뇌간 급성 전기 생리학 및 이광자 현미경 실험을 수행하기 개두술을 열 수있다.

신생아 설치류의 복부 두개골에 개두를 확인하는 방법

신경 네트워크의 구조를 이해하기 위해, 개별 뉴런의 기능적, 형태 적 특성이 필요하다. 여기, 우리는 juxtasomal biocytin의 세포 구성에 전기 생리학 녹음을 할 수 있습니다 라벨, 아직 세포 내에서 돌기 및 축삭 아키텍처의 사후 재건 신경 레이블을 할 수있는 능력을 유지을 보여줍니다.

Juxtasomal Biocytin 레이블은 개별 두피 뉴런의 구조 - 기능 관계를 연구하는

면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

병리학적 조건에서 뇌 재구성을 연구하기 위해 우리는 혈액 뇌 장벽을 우회하여 뇌로 단백질을 직접 전달하기 위해 미량삼투압 펌프를 사용했습니다. 그런 다음 단백질의 영향으로 뇌 연결성의 변화를 연구하기 위해 요로 추적자를 주입합니다.

Miniosmotic의 주입 펌프 및 요로의 트레이서의 배달 병태 생리 학적 조건에서 뇌 조직 개편을 연구에

우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다.

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

이 프로토콜은 두개골 외상성 뇌 손상의 마우스 모델과 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 세포의 이식에 대한 방법론을 상해 부위내로 시연한다. 이 절차에서 결과의 행동 그리고 조직학 시험은 또한 간략하게 기술됩니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

현재 프로토콜은 해마에 복부 테진 영역 (VTA) 글루타민트 프로젝션을 추적하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 VTA 글루타민단 단자가 생체 내에서 CA1 퍼티티 피라미드 발사 속도를 조절하는 방법을 보여주기 위해 CA1 레코딩과 결합되었습니다.

해마의 생체 내 해부학 및 기능적 추적

여기서 우리는 손상되지 않은 뇌 구조의 일환으로 표적 분자의 보기를 허용하는 소수성 조직 청산 방법을 제시합니다. 이 기술은 지금 F344/N 통제 및 두 남녀의 HIV-1 형질전환 쥐를 위해 검증되었습니다.

쥐 뇌 조직을 위한 소수성 조직 청산 방법

연속 이광자 단층촬영(STPT) 이미징은 이광자 이미징과 자동 스테이지 제어 및 마이크로톰 슬라이싱을 결합하여 조직 덩어리를 3차원 형태로 이미징하는 기술입니다. 여기에서는 마모셋 뇌가 구조적 특징을 더 잘 이해할 수 있도록 이를 구현하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

신경 해부학적 분석을 위한 전체 마모셋 뇌의 연속 이광자 단층촬영(Serial Two-Photon Tomography of the whole Marmoset Brain)

배우세요 고분자량 BDA를 이용한 쥐 중추신경계 신경회로 추적법. 공초점 레이저 현미경으로 세포 수준의 신경 구조를 시각화하고 국소 신경회로 특성을 분석하는 정교한 프로토콜입니다.

높은 분자량 Biotinylated Dextran 아민 Thalamocortical 프로젝션 쥐에 추적에 대 한 응용 프로그램 향상

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