April 12th, 2018
여기, 선물이 효과적으로 상호 신경 통로 통해 방법 얼룩이 지기 형광으로 biotinylated dextran 아민 (BDA)를 공개 하는 세련 된 프로토콜. 그것은 미세 구조 분석 적합 BDA 라벨 및 다른 신경 요소 confocal 레이저 스캐닝 현미경 아래에서 구별의.
이 비디오의 전반적인 목표는 중추 신경계에서 최적의 신경 라벨링을 연구하기 위해 고분자량 BDA를 적용하기 위한 정교한 프로토콜을 시연하는 것입니다. 이 측정은 신경망 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 신경 회로를 통해 신경 라벨링의 프레임 구조를 시각화함으로써.
이 기술의 주요 장점은 국소 신경 회로와 그 화학적 특성을 시작할 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다. 유리 마이크로피펫이 장착된 마이크로리터 마이크로주사기 1개를 준비하고 액체 파라핀을 추출하여 테스트합니다. 승인된 프로토콜을 사용하여 쥐를 마취한 후 꼬리 꼬집기에 대한 반응이 없어 심부 마취를 확인합니다.
그런 다음 전기 면도기로 동물의 머리 윗부분을 면도하고 10% 포비돈 요오드와 70% 에탄올로 수술 부위를 문지릅니다. 뭉툭한 이어바를 귀에 삽입하고 쥐의 윗니를 입 홀더에 넣어 쥐를 입체 장치에 고정합니다. 눈에 안과 연고를 바릅니다.
멸균 수술용 장갑과 커튼을 사용하여 멸균 상태를 유지하십시오. 70% 에탄올을 사용하여 수술 부위의 머리 피부를 다시 청소합니다. 메스로 피부를 절개한 후 시상 봉합사를 따라 멸균 솜 팁 애플리케이터를 사용하여 두개골에서 근육과 골막을 긁어냅니다.
아틀라스에서 사전 정의된 좌표를 사용하여 개두술의 위치를 결정합니다. 수막이 보일 때까지 둥근 팁 비트가 있는 버 드릴을 사용하여 약 1mm 깊이까지 드릴로 개두술을 수행합니다. 주사 부위에 대뇌 피질을 노출시키기 위해 마이크로 겸자를 사용하여 경막을 절제합니다.
마이크로 주사기에서 액체 파라핀을 배출한 다음 10%BDA 용액을 끌어냅니다. 주사기를 마이크로 주입 장치에 장착하고 마이크로 펌프를 연결합니다. 실체 현미경 아래에서 미세 주입 장치를 조작합니다.
채워진 유리 마이크로피펫을 뇌의 피질 표면을 통해 5.8mm 깊이까지 VPM에 삽입합니다. 그런 다음 마이크로 펌프를 사용하여 3분 동안 100나노리터의 10%BDA를 VPM에 주입합니다. 5분 후 피펫을 천천히 빼냅니다.
멸균 실로 상처를 봉합한 다음 쥐가 의식을 되찾고 완전히 회복될 때까지 따뜻한 회복 장소에 쥐를 눕힙니다. 쥐를 안락사시킨 후 가위와 집게를 사용하여 쥐의 흉강을 열고 심장에 접근합니다. 정맥 주사 카테터를 대동맥 쪽의 좌심실에 삽입한 다음 오른쪽 귓바퀴를 엽니다.
먼저 심장에서 나오는 혈액이 맑아질 때까지 생리학적 온도에서 약 1-2분 동안 0.9% 식염수를 관류합니다. 그런 다음 0.1 몰 인산염 완충액에 250-300 밀리리터의 4 % 파라 포름 알데히드로 계속합니다. 절개된 뇌를 4%파라포름알데히드에 실온에서 2시간 동안 사후 고정합니다.
그런 다음 뇌를 0.1 몰 PBS의 30% 자당으로 옮기고 섭씨 4도에서 3일 동안 동결 보호합니다. 3일 후, 뇌가 용액에 가라앉으면 뇌 매트릭스의 도움을 받아 뇌를 관상 방향으로 세 블록으로 나눕니다. 중앙 블록은 원발성 체감각 피질(primary somatosensory cortex)에 있는 시상(thalamus)의 복부 후내측핵(ventral posteromedial nucleus of thalamus)을 포함하고 있습니다.
뇌의 중앙 블록을 슬라이딩 마이크로톰의 동결 단계에 장착하여 관상동맥 평면에서 절편하고 얼었을 때 40미크론에서 절편합니다. 0.1 몰 PBS가 포함된 6웰 접시에 절편을 수집합니다. 흔들면서 약 1분 동안 0.1몰 PBS로 섹션을 헹구어 염색을 시작합니다.
그런 다음 0.3% Triton X-100을 함유한 0.1몰 PBS의 AF500/525 녹색 형광 Nissl 염색 스트렙타비딘-AF594의 혼합 용액으로 절편을 옮기고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 염색 후 흔들림으로 0.1몰 PB로 섹션을 세 번 세척합니다. 표준 조직화학 기법을 사용하여 현미경 슬라이드에 절편을 장착합니다.
약 한 시간 동안 섹션을 자연 건조하십시오. 증류수에 50%글리세린을 토레센트 섹션에 바르고 슬라이드를 이미징하기 전에 슬립을 덮습니다. 이 대표적인 현미경 사진은 녹색 Nissl 염색의 배경에 시상의 복부 후내측 핵의 빨간색으로 BDA 주입 부위를 보여줍니다.
여기에는 4층의 탈라밀 코르티콜 축삭돌기와 5층과 6층의 피질 시상 뉴런을 포함한 thorescent BDA 표지가 나와 있습니다. 비교를 위해 이 현미경 사진은 표준 avidin-biotin peroxidase 절차를 사용한 기존 BDA 라벨링이 thorescent BDA 라벨링과 유사한 신경 라벨링 패턴을 나타낸다는 것을 보여줍니다. thorescent BDA 표지 섹션의 이 고배율 보기는 전행성 표지된 축삭 가지(axonal arbors)를 빨간색으로 자세히 보여줍니다.
역행성으로 표지된 신경 세포체, 수상돌기 및 수지상 가시가 여기에 자세히 나와 있습니다. 일단 숙달되면, 개두술과 정위 주사는 제대로 수행된다면 20-30분 안에 완료될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 고분자량 BDA를 적용하여 신경 연결 및 신경 라벨링의 상세한 구조를 되살리는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 동영상은 중추 신경계에서 신경 라벨링을 연구하기 위해 고분자량 비오틴화 덱스트란 아민(BDA)을 적용하는 개선된 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법은 신경 회로와 그 화학적 특성을 상세히 시각화할 수 있게 합니다.
High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) tracing enables precise mapping of thalamocortical projections, supporting mechanistic de-risking in neurocircuitry research. Enhanced visualization of neuronal pathways and local circuit markers increases predictive confidence for target validation in CNS drug discovery. This refined protocol strengthens translational continuity from early discovery through preclinical neuroanatomical studies.
This refined BDA tracing protocol fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling robust neural pathway mapping and marker co-localization for CNS research portfolios.