Name: 심각한 In Vivo 마취 된 래트에서의 Hyperdirect 경로로부터의 국소 장 전위 및 다중 단위 활성의 전기 생리 학적 기록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 학습하세요 마취된 래트에서 국소 장 전위와 다중 단위 활성을 동시 기록하는 전기생리학 기법을 통해 피질-기저핵 루프의 기능을 연구하는 방법을. 이 기법은 신경정신질환의 병리적 진동 분석과 치료 바이오마커 개발에 활용됩니다.

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우리 연구에 자금을 지원 한 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247에 감사드립니다.

실험 절차는 독일 동물 복지 법 (2014 년 마지막 개정) 및 유럽 규정 (2010 / 63 / EU)에 따라 수행되었습니다. 실험은 지역 동물 복지 당국 (LaGeSo, Berlin)의 승인을 얻었으며 지역 부서 및 국제 지침을 준수했습니다. 참고 : 제시된 방법에서는 두 가지 전극 모델을 사용하여 일차 운동 피질 (M1)과 시상 하부 핵 (STN) 및 망막 흑색질 (SNr)을 연결하는 하이퍼 다이렉트 cortico-basal ganglia 경로를 기록합니다. 경막 외 electrocorticogram (ECoG) M1 맞춤형 낮은 임피던스 Ag / AgCl 전극에서 녹음에 사용됩니다. STN 및 SNr의 녹음은 상업적으로 이용 가능한 고 임피던스 텅스텐 전극을 사용하여 수행됩니다. 1. 경막 외 Ag / AgCl 경막 외 전극의 제작 <ol><li> 대략을 가지고 가십시오. 직경 99.99 % 순은 와이어 5cm 길이 스트립r을 200 μm로 줄이고 필요한 경우 코팅을 제거하십시오. </li><li> 팁이 녹을 때까지 팁이있는 와이어 팁을 라이터 또는 촛불의 불꽃 속으로 아래쪽으로 잡습니다. 팁이 볼 형태이고 직경이 약 1 mm가 될 때까지 기다리십시오. 공 모양의 시작 부분에서 와이어 끝까지 총 길이 15 mm로 예비 성형 된 전극을 잘라내십시오. </li><li> 사용 된 전기 생리 학적 녹음 시스템에 맞는 와이어 끝단에 정밀 커넥터를 납땜하십시오. 전도성 실버 바니시로 와이어 끝에서 커넥터까지 납땜 지점을 덮으십시오. 이는 전도도를 높이고 신호 품질을 향상시킵니다. </li><li> 전도성 바니시가 건조 된 후 납땜 지점을 3 mm ~ 1 mm 열수축 튜브로 덮으십시오. 조심스럽게 시계 모양의 해머를 사용하여 공 모양의 팁을 두께의 절반으로 평평하게하십시오. </li><li> 시험 장갑을 끼고 보풀이없는 천을 100 % 에탄올로 닦아서 먼지와 기름을 제거하십시오. </li><li> 전극을 넣으세요.15 mL 원심 분리 관 또는 세포 배양 튜브에 넣고 공 모양의 팁이 완전히 덮일 때까지 가정용 염소 표백제 (주의 : 용매 100 g 당 2.8 g의 차아 염소산 나트륨 함유)로 채 웁니다. 주의 : 염소 표백제는 부식성이 있습니다. 항상 제조업체의 안전 지침을 따르십시오. </li><li> 23 분 후에 전극을 꺼내 증류수로 관대하게 씻어 낸다. 염화은 층의 성공적인 적용은 균질 한 자주색 변화로 나타납니다. </li><li> 공기 중에서 건조하십시오. 완전히 말린 후 미세 핀셋으로 전극을 가져갑니다. 고급 페인트 브러시로 액체 전기 절연체를 바르십시오. 전극 팁 바로 뒤에있는 와이어에서 시작하여 열 수축 튜브까지 모든 것을 덮으십시오. 단열재를 최소 2 시간 동안 건조시킵니다. </li><li> 품질 관리를 위해 멀티 미터로 전기 전도도를 점검하십시오. 가능한 경우 적절한 임피던스 미터를 사용하여 1kHz에서 임피던스 테스트를 수행하고 전극과 테스트프로브는 서로 접촉하지 않고 H2O 용액을 함유하는 0.9 % NaCl에 함께 넣는다. 1kHz에서의 임피던스 값은 약 8kΩ이어야합니다. </li></ol> 2. 전극 고정 장치 홀더에 전극 고정 참고 : MUA와 LFP를 동시에 기록하려면 임피던스가 1.5 MΩ 인 텅스텐 마이크로 와이어 전극을 사용하십시오. 레코딩의 초점이 단일 유닛의 고음질 레코딩 인 경우 임피던스 (&gt; 5 MΩ)가 더 높은 마이크로 와이어 전극을 선택하십시오. 연구 목적이 LFP에서만 이루어지는 경우, 더 낮은 임피던스를 갖는 전극을 수용 할 수 있습니다. dorsoventral stereotaxic 조정이 종종 필요한 작은 구조의 경우 적절한 dorsoventral tip separation (이 경우 250 μm)이있는 전극 쌍을 사용하십시오. 또한, 필요하다면 더 많은 로컬 기준 전극의 이점을 제공합니다. stereotaxic 좌표는 항상 최하위 전극에서 측정되고브레 그마를 참조하여 계산됩니다. <ol><li> 아크릴 블록과 클램프로 표준 stereotaxic 전극 홀더를 가져 와서 수술 현미경의 시야에서 평평한 표면에 안전하게 놓습니다. </li><li> 핀셋을 사용하여 접착 테이프 조각 (3mm x 8mm)으로 홀더의 아크릴 블록에 첫 번째 전극 쌍을 느슨하게 고정합니다. 전극은 아크릴 블록을 돌출시켜야합니다. 12 mm. </li><li> 조심스럽게 두 번째 바이폴라 전극을 첫 번째 전극 옆에 고정하십시오. 하이퍼 다이렉트 경로의 구조를 표적으로 할 때 거리는 2mm가되어야합니다 ( 그림 1 ). 대부분의 표준 stereotaxic 전극 홀더 들어, 이것은 인접한 홈입니다. 확인하려면 캘리퍼 게이지를 사용하십시오. 다른 네트워크에도 같은 방식으로 접근 할 수 있습니다. 이를 위해 아크릴 블록이 어느 정도 돌릴 수 있습니다. </li><li> 대부분의 복부 팁이 약 200 인 위치로 조심스럽게 밀어서 두 번째 전극 쌍을 조정하십시오( 그림 1 )에 비해 오목하게 들어가있다. 현미경으로 시력 검사를하십시오. 이를 위해 30G 캐뉼라 (외경 300μm)를 사용하여 거리를 더 정확하게 측정하십시오. </li><li> 접착 테이프를 누른 다음 홀더의 금속 클램프로 고정하십시오. </li></ol> 3. 수술 <ol><li> 전기 생리 학적 기록을 위해 마취에 우레탄 (CAUTION)을 사용하십시오. 주의 : 우레탄은 독성 및 발암 성이므로 항상 물질 제조업체가 제공 한 안전 규정 및 데이터 시트를 준수하십시오. </li><li> 0.9 % NaCl 의료 식염수에 200 mg / mL 우레탄 용액을 준비합니다. </li><li> 1.3 g / kg 체중 우레탄을 복강 내 (IP)로 투여하십시오. 쥐의 종류에 따라 마취의 안전성을 높이기 위해 주사 간격을 15 분 간격으로 2 회 복용량으로 나누는 것이 합리적 일 수 있습니다. </li><li> p를 사용하여 마취 깊이를 확인하십시오.(edal-withdrawal) 반사 및 다른 적절한 반사 (reflexes)를 포함한다. 마취가 수술을 수행하기에 충분히 깊지 않은 경우 0.15 g / kg bodyweight의 우레탄 IP를 주입하고 15 분 더 기다리십시오. </li><li> 각막 탈수를 예방하기 위해 안 연고를 바르십시오. </li><li> 마취 중 호흡 수 및 페달 철수 반사를 지속적으로 모니터링합니다. 생리 학적 체온이 수술 전반에 걸쳐 유지되도록 온도 조절 장치가있는 작은 동물 가열 패드를 사용하십시오. 전기 생리 학적 기록을 시작하기 전에 비 전기적인 대안 ( 예 : 아세트산 나트륨 헤드 패드)으로 변경하십시오. </li><li> 깨끗한 수술 분야를 달성하기 위해 머리의 지느러미면과 함께 털을 면도하십시오. 적절한 수술 소독제로 절개 부위 주위를 소독하십시오. stereotactic 프레임에 동물을 해결. </li><li> 메스로 2cm 길이의 두피를 시상면 방향으로 절개하십시오. 메스를 사용하여 두개골의 무력증을 약간 없애고 두개골을 소독하십시오. 공동 사용tton 봉오리는 남아있는 조직을 제거하기 위해 3 % H 2 O 2 에 담갔다. </li><li> 필요하다면 전기 카 커나 열 경화기를 사용하여 출혈을 조절하십시오. 출혈이 1-2 분 후에 자발적으로 멈추지 않고 두개골에 시력을 방해하는 경우 두개골 뼈와 피하에서 출혈을 멈춥니다. </li><li> 머리가 편평한 해골 위치에 위치 할 때까지 절치 막대를 조절하십시오. 이는 stereotaxic 기준점 인 bregma와 lambda가 같은 평면에 있음을 의미합니다. 이것은 높은 수술 정밀도를 달성하는 데 가장 중요합니다. 표준 stereotaxic 쥐 정렬 도구를 사용하여, 현미경 비전 아래 bregma에 지정된 팁을 보정하고 공구에 bregma과 람다에 대한 지정된 지점이 동시에 두개골을 만질 때까지 절치 막대를 조정합니다. 참고 : 다른 쪽에서 집중된 빛이있는 한쪽면의 뷰는이 상태를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또는 정교한 캐 뉼러로 stereotaxic 홀더를 가져 와서 Bregma a의 dorsoventral 좌표를 측정하십시오.현미경으로 시야를 확보 한 람다. 브레 마지마와 람다의 외음부 좌표가 같아 질 때까지 절치 막대를 조절하십시오. </li><li> 캐 뉼러가있는 stereotaxic holder를 사용하고 bregma를 교정 한 다음 두개골에있는 모든 drill hole의 위치를 ​​계산하십시오. stereotaxic 홀더를 사용하여 조심스럽게 두개골을 긁거나 수술 컬러 마커를 사용하여 구멍을 뚫는 구멍의 위치를 ​​표시하십시오. 이것에 대한 좌표는 표적에 따라 다르며, bregma에 대한 좌표는 소뇌 기준 전극에 대해 제안 된 좌표를 포함하여 표 1 의 hyperdirect 경로에 대해 제공됩니다. </li><li> 마이크로 드릴을 사용하여 모든 구멍을 조심스럽게 뚫습니다. STN 및 SNr의 경우 일반적인 구멍 (약 2mm x 3mm 크기)을 뚫습니다. 다른 모든 드릴 구멍은 ​​약 1mm의 직경을 가져야합니다. </li><li> 2 개의 정밀한 캐 뉼러 (적어도 27G)를 가져 가며 단단한 표면 또는 핀셋을 사용하여 구부려 진 모양을 만들기 위해 팁을 구부립니다. 이들을 사용하여 debri을 제거하십시오.s를 드릴 구멍에서 빼내고 일반적인 STN / SNr 구멍에서 경질 물질을 조심스럽게 자르고 제거하십시오. </li><li> 생리 식염수로 드릴 구멍을 플러시하십시오. 두뇌와 두라의 건조를 방지하기 위해 15 분마다 한 방울의 생리 식염수를 드릴 구멍에 바르십시오. </li><li> 미세 드릴과 일치하는 스테인레스 강 마이크로 나사 ( 예 : M 1.2 mm x 2 mm 나사)를 가지고 소뇌 위의 경막 외 전극의 드릴 구멍 사이에있는 마이크로 나사에 구멍과 나사를 뚫습니다. M1 경막 외 전극. </li><li> 자기 조립 Ag / AgCl 경막 외 전극을 참조 전극과 M1 전극의 드릴 구멍으로 밀어 넣습니다. 정밀한 핀셋으로 전극 팁을 가이드하고 두개골 뼈 바로 아래를 드릴 구멍으로 밀어 넣으십시오. </li><li> 모든 경막 외 전극을 2 성분 치과 용 아크릴로 고정하십시오. bregma 포인트를 덮거나 일반적인 STN / SNr 구멍에 영향을 미치지 않도록하십시오. </li><li> 텅스텐 마이크로 와이어 electrod와 준비 홀더를 삽입es를 stereotaxic 틀에 넣는다. </li><li> STN을 대상으로하는 대부분의 복부 전극을 브레 그마에게 교정하십시오. 일반적인 STN / SNr 구멍 위의 계산 된 위치로 조정하고 현미경으로 뇌 아래로 전극을 낮추십시오. 텅스텐 마이크로 와이어 전극이 뇌 내부로 부드럽게 들어가는 지 확인하십시오. </li></ol> 4. 전기 생리 학적 매핑과 녹음 참고 :이 단계에서는 온라인 필터링 및 온라인 스파이크 정렬이 가능한 레코딩 소프트웨어가있는 패러데이 케이지 및 다중 채널 전기 생리 학적 레코딩 시스템이 필요합니다. 바람직하게는 전기적 잡음과 아티팩트를 절대 최소로 유지하기 위해 동물의 머리 근처에 위치한 전치 증폭기와 함께 작동하는 시스템을 사용하십시오. 텅스텐 마이크로 와이어 전극 외에도, 적어도 하나의 경막 외 전극 및 하나의 기준 전극이 하이퍼 다이렉트 경로의 기록을 수행하는 데 필요하다. 그것은 경막 외 및 참조를 삽입하는 것이 좋습니다e 전극을 서로 접촉하지 않고 쌍으로 연결하면 오작동이 발생했을 때 도움이되며 데이터 분석에서 다양한 유형의 참조가 가능합니다. <ol><li> stereotaxic 프레임 위에 모바일 패러데이 케이지를 넣어. 고정식 패러데이 케이지 만 사용할 수있는 경우 조심스럽게 stereotaxic 프레임을 패러데이 케이지로 옮기고 뇌의 깊은 전극을 뇌에 넣지 말고 stereotaxic frame이 최종 위치에 올 때까지 확인하십시오. </li><li> Electysiological 설정의 headstage에 전극을 연결합니다. 참조 전극이 적절한 참조 채널에 연결되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 레코딩 소프트웨어 설정 : 밴드 패스 필터 (0.05-8,000 Hz) 및 원시 데이터 신호 증폭 (1,500-2,000 배 이득). 적절한 설정 (LFP의 경우 대역 통과 필터 0.05-250 Hz, MUA의 경우 대역 통과 필터 300-8,000 Hz)과 함께 온라인 LFP 및 스파이크 필터를 사용하십시오. 모든 필터에는 버터 워스 필터를 사용하십시오. </li><li> 해당되는 경우 onlin에 대해 스파이크 임계 값을 설정합니다.전자 스파이크 정렬. 대부분의 레코딩 소프트웨어는 신호가 소프트웨어에 의해 스파이크로 표시되는 진폭 값인 스파이크 임계 값을 설정할 수 있습니다. 이 임계 값은 필터링 된 스파이크 신호의 평균 진폭의 인자 또는 표준 편차로서 수학적으로 결정될 수 있거나, 바람직하게는 &lt;500ms의 데이터 세그먼트의 육안 검사에 의해 결정될 수 있고 그래픽의 신호 노이즈 위의 라인으로 설정 될 수있다 사용자 인터페이스. 참고 : 스파이크 임계 값 설정의 의도는 스파이크 및 정렬 단위를 계산하여 현재 얼마나 많은 뉴런이 기록되고 스파이크가 어떻게 형성되는지에 대한 정보를 제공하는 것입니다. </li><li> 천천히 텅스텐 마이크로 와이어 전극을 대상의 1 mm 지느러미까지 내립니다.이 전극은 하이퍼 다이 렉션 경로의 STN입니다. 필요한 경우 신호가 안정 될 때까지 기다리십시오. </li><li> 전기 생리 학적 매핑을 위해 전극을 100 μm 간격으로 전진시킵니다. 각 단계에서 점화 패턴을 평가하여 r먹고 스파이크의 모양. 그림 2 의 전형적인 예와 비교하십시오. 일반적으로 밀도가 높은 핵은 몇 가지 dorsoventral 단계에 걸쳐 빠르고 연속적으로 스파이크를하는 반면, 섬유가 풍부한 구조는 후속 복부 단계에서 낮은 발사 속도와 동질적인 스파이크 활동을 나타냅니다. </li><li> 하이퍼 다이렉트 경로의 경우, 대부분의 복부 전극이 STN 내부에 있는지 확인하십시오. 참고 : MUA의 상당한 증가가 Zona incerta의 복부에서 감지되면 STN에 도달합니다. STN에 이르기까지 전극이 내부 캡슐에 도달했기 때문에 스파이크가 거의 완전히 멈 춥니 다. 대부분의 복부 전극이 STN에있을 때, 텅스텐 미세 전극의 구성은 후부의 두 번째 전극이 SNr에 있음을 보장합니다. STN과 SNr에서 일반적인 MUA를 동시에 기록하려면 미세 조정을 조금씩 늘려야합니다. MUA의 빈도는 실제로 기록 된 뉴런 수와 뇌 수준활성화. </li><li> 일단 전극이 원하는 구조에 있으면 온라인 필터링 및 스파이크 정렬 ( 그림 4 참조)을 설정 한 다음 데이터 기록을 시작하십시오. LFP 녹음에서 식별 할 수있는 다양한 피질 동기화 상태에 대한 일반적인 예가 그림 3에 나와 있습니다. </li></ol> 5. 실험 종료 <ol><li> 녹음이 끝나면 천천히 뇌에서 전극을 들어 올려 생리 식염수로 순간적으로 씻어 낸다. 전극은 철저한 세척과 육안 검사 후에 재사용 할 수 있습니다. 방전 전극을 배출하십시오. </li><li> 과량의 우레탄 (2.5g / kg bodyweight)을 IP로 주사하여 동물을 안락사시킵니다. 참고 : 우레탄은 최종 절차에만 사용해야합니다. </li><li> 전극 위치 또는 다른 조직 학적 염색 절차의 조직 학적 검증이 필요한 경우, 두개골에서 뇌를 제거하고조직을 적절하게. 참고 : 의도 염색 방법에 따라 심근 관류가 필요할 수 있습니다. 전극 위치의 사후 검증을 위해 표준 Nissl 염색법이 대부분의 경우에 예를 들어 코로나 뇌 절편에서 전극 궤적을 시각화하는데 충분합니다. 조직 학적 표적 검증을 용이하게하기위한 다른 접근법으로는 기록 전극을 통해 전류를인가하거나 전극 삽입 전에 생체 적합 염료를 적용하여 뇌 조직에 전기 유도 된 병변을 사용하는 방법이있다. </li></ol>

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본 연구에서이 방법은 M1과 STN 및 SNR을 설치류에 연결하는 하이퍼 다이렉트 cortico-basal ganglia 경로의 예를 사용하여 주어진 네트워크의 여러 지점에서 동시에 세포 외 전기 생리 학적 신호를 기록하는 방법을 보여줍니다. STN과 같은 작은 피질 하부 구조의 기록에서 중요한 단계는 정확하게 기록 된 전극을 표적 안으로 삽입하는 것입니다. 제시된 방법에서는 두 가지 중요한 단계를 처리하여 높은 정확도의 타겟팅을 보장합니다. 뇌에 전극이 삽입되기 전에 stereotactic 장치에서 동물을 준비 할 때, 두개골이 &quot;평평한 해골&quot;위치 22 로 옮겨지는 것을 확인하는 것은 절대적으로 필수적입니다. 편평한 두개골 위치를 얻기 위해, stereotactic frame의 incisor bar의 위치는 bregma와 lambda reference point의 높이가 o두개골은 동일한 외배 평면 ( <sup c...

파킨슨 병 (PD)과 정신 분열병과 같은 다른 신경 정신 질환에 대한 최근의 누적 증거는 그들의 병태 생리가 대뇌 피질 및 피질 하부 구조 1 , 2 , 3 을 종종 포함하는 확장 된 신경 회로의 중대한 장애에 기초한다는 것을 강하게 시사한다. 이 이론에 따르면, 질병의 임상 증상은 단일 세포 또는 특정 연결 요소 1 , 2 , 3 대신에 세포 네트워크의 정보 처리 능력이 손상되어 발생합니다. 신경 정신병 학 질환의 복잡한 그룹에 대한 이해를 높이고 새로운 치료 옵션을 찾으려면 인간 환자 및 동물 모델에서 이러한 무질서한 네트워크의 연결 동역학을 매우 상세하게 특성화해야합니다. 탁월한생체 내에서 대규모 네트워크를 연구하는 방법은 세포 외 전위의 다중 사이트 전기 생리 학적 기록이다. 이 방법을 사용하여, 흥분성 및 억제 성 postsynaptic 전류의 시간적 합계를 주로 나타내는 국부 전계 전위 (local field potentials, LFPs) 및 시냅스 전 전위 (preynaptic potentials)에 의해 생성 된 다중 단위 활성 (MUA)을 동시에 평가할 수 있습니다. 세포 외 포텐셜의 기록은 기능적 자기 공명 영상 및 칼슘 이미징과 같은 네트워크를 연구하는 다른 방법보다 시간적 공간적 해상도가 더 높고 유 전적으로 조작 된 유기체에 의존하지 않기 때문에 몇 가지 장점이 있습니다 5 . 그러나, 세포 외 생체 내 기록의 사용은 보편적으로 적용될 수없는 침입 기술이기 때문에 제한적이다. 생체 내 전기 생리 학적 연구ordings는 마취 된 동물뿐만 아니라 깨어있는 상태에서 수행 될 수 있습니다. 두 가지 방법 모두 특정 장단점이 있습니다. 깨어있는 동물에 대한 연구는 정의 된 행동 과제를 수행하는 동안 뇌 신호를 기록 할 수는 있지만 운동 관련 및 기타 아티팩트 7,8에 취약합니다. 반면 마취 된 동물의 기록은 고도로 정의 된 피질의 동기화 상태에서 최소한의 인공물로 LFP 및 MUA를 평가할 기회를 제공하지만 결과는 또한 깨어있는 피험자 9 , 10 , 11 에서 발견 할 수있는 것과 어느 정도 다릅니다. 최근에는 LFP 샘플링이 네트워크 활동의 병리학 적 변화를 묘사하는 데 특히 유용하다는 것이 입증되었습니다. 이에 대한 탁월한 예는 인간 환자에서 PD의 병리 생리학에 관한 연구입니다cortico-basal ganglia loop에서의 강화 된 베타 진동이 파킨슨 병 운동 증상과 연관되어 있음을 보여줄 수있는이 질병의 동물 모델 12 , 13 . 이 연구의 결과로, 베타 진동이 폐쇄 루프 심뇌 자극에 대한 온라인 피드백 바이오 마커로 사용될 수 있는지에 대해서는 현재 조사 중이다. 본 연구에서는 우레탄으로 마취 된 쥐에서 LFP 및 MUA의 급성 다중 부위 생체 전기 생리 학적 기록에 대한 상세한 설명이 제공된다. 하이퍼 다이렉트 cortico-basal ganglia pathway와 같은 완전한 네트워크가 표준 및 맞춤 전극을 사용하여 전기 생리 학적으로 특성화 될 수있는 방법과 그 전극을 구축하는 방법을 보여줍니다. 기저핵 신경핵의 정확한 표적화가 공동체에 의해 어떻게 달성 될 수 있는지 특히 강조된다MUA의 온라인 등록과 함께 정위 수술을 마비시킨다.

<table><tbody><tr><td>Ag/AgCl 맞춤형 경막외 전극</td><td>Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com</td><td>99.99% 은선 Ag/AgCl 전극에 대한 제품 ID AG005127</td>은 <td>더 나은 신호 품질을 허용하지만 급성 실험에만 사용할 수 있습니다. 가능한 교체: 스테인리스 스틸 전극</td></tr><tr><td>아크릴 블록이 있는 입체 홀더</td><td>David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA</td><td>제품 ID 모델 1770 표준 전극 홀더</td><td>아크릴 블록에 원하는 대상에 대한 전극 설정에 적합한 홈이 있는지 확인하십시오. 아크릴 블록은 원하는 구성을 얻기 위해 파일로 쉽게 수정할 수 있습니다. 가능한 교체: 자체 제작된 전극 홀더</td></tr><tr><td>텅스텐 마이크로와이어 전극 1.5 M&Omega; 임피던스</td><td>Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way&nbsp; Gaithersburg, Maryland, 20879 USA</td><td>제품 ID WE3ST31.5A5-250um</td><td>1.5 M&Omega;는 MUA와 LFP를 동시에 기록하는 데 필요합니다. 가능한 교체: 다양한 재료의 미세 전극을 사용할 수 있습니다. 전극은 곧고 견고하며 가능한 한 얇아야 합니다.</td></tr><tr><td>쥐 정렬 도구</td><td>David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA</td><td>제품 ID 모델 944 쥐 정렬 도구</td><td>뇌의 정확한 방향이 입체 아틀라스와 일치할 수 있도록 합니다. 가능한 교체 : 캐뉼라가있는 입체 주</td></tr>거 <tr><td>2 액형 치과 아크릴</td><td>Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom</td><td>Simplex Rapid Powder Clear 225g, 제품 코드 : ACR803; 심플렉스 래피드 리퀴드 150ml, 제품 코드: ACR920</td><td>사용하는 전극에 따라 전극이 작고 가벼운 경우 초강력 접착제가 쉬운 대안이 될 수 있습니다. 가능한 대체품: 초강력 접착제(시아아크릴레이트 기반)</td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>자체 건설</td><td></td><td>적절한 패러데이 케이지가 전자기 인공물로부터 가장 잘 보호되지만 상자 모양으로 형성하거나 프레임에 적용할 수 있고 전도성 재료로 만들어진 모든 것이 도움이 될 수 있습니다. 교체 가능: 알루미늄 호일 또는 구리 메쉬</td></tr><tr><td>기록 소프트웨어 및 온라인 스파이크 분류 기능을 사용한 전기 생리학적 설정</td><td>OmniPlex&reg; 신경 데이터 수집 시스템 Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA</td><td></td><td>오프라인 정렬 소프트웨어는 잠재적인 대안이며 오픈 소스 커뮤니티에서 여러 스크립트 및 소프트웨어를 무료로 찾을 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

심각한<em&gt; in vivo</em&gt; 마취 된 래트에서의 hyperdirect 경로로부터의 국소 장 전위 및 다중 단위 활성의 전기 생리 학적 기록

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

수렴 된 증거는 많은 신경 정신병이 대다수의 신경 네트워크의 장애로 이해되어야 함을 보여줍니다. 이러한 질병의 병태 생리 학적 기초를 더 잘 이해하기 위해서는 회로의 다른 연결 부분간에 정보 처리가 방해되는 방식을 정확하게 특성화해야합니다. 세포 외 생체 전기 기록을 사용하여, 연결 네트워크 내에서의 신경 활동을 정확하게 묘사하는 것이 가능하다. 이 방법의 적용은 기능적 자기 공명 영상 및 칼슘 이미징과 같은 다른 기술보다 몇 가지 장점이 있습니다. 고유 한 시간 및 공간 해상도를 허용하고 유 전적으로 조작 된 유기체에 의존하지 않기 때문입니다. 그러나, 세포 외 생체 내 기록의 사용은 보편적으로 적용될 수없는 침입 기술이기 때문에 제한적이다. 이 기사에서는 간단하고 사용하기 쉬운 방법을 소개합니다.네트워크의 여러 지점에서 로컬 필드 잠재력 및 다중 단위 활동과 같은 세포 외 잠재력을 동시에 기록 할 수 있습니다. 그것은 stereotactic 수술과 multi-unit 녹음의 온라인 분석의 결합을 사용하여 피질 핵의 정확한 타겟팅이 어떻게 이루어질 수 있는지에 대해 자세히 설명합니다. 따라서, hyperdirect cortico-basal ganglia loop와 같은 완전한 네트워크가 in vivo 에서 마취 된 동물 에서 어떻게 연구 될 수 있는지 보여줍니다.

본 명세서에 사용 된 기록 전극을 사용하여, 일차 운동 피질, 시상 하부 핵 및 STN 및 SNr로부터의 흑질질 및 MUA로부터 LFP를 샘플링하는 것이 가능하다. 처음에는 LFP 및 다중 단위 활동이 광대역 신호로 함께 기록됩니다. 그 후, LFP 및 MUA는 대역 통과 필터 (LFP의 경우 0.05-250 Hz 및 MUA의 경우 300-4,000 Hz)로 분리됩니다. 피질 핵, 특히 STN과 같은 작은 구조물의 올바른 타겟팅을 위해 계획된 stereotaxic 좌표를 온라인으로 기록 된 MUA 신호와 정렬하는 것이 유리합니다. STN 특성을 목표로하는 전극 궤적에 대해 MUA 패턴을 기록 할 수 있습니다 ( 그림 2 ) 9 , <sup cla...

이 연구에서 방법론은 우레탄 마취하에 hyperdirect 통로에서 다중 부위 생체 내 생리 학적 기록을 수행하는 방법에 대해 제시됩니다.

심각한<em&gt; In Vivo</em&gt; 마취 된 래트에서의 Hyperdirect 경로로부터의 국소 장 전위 및 다중 단위 활성의 전기 생리 학적 기록

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

본 실험의 전반적인 목표는 마취된 쥐의 피질-기저핵 루프(cortico-basal ganglia loop)로부터 국소 전위(local field potentials) 및 다단위 활동(multi-unit activity)의 급성 인 비보(in vivo) 전기생리학적 기록을 수행하는 방법을 시연하는 것입니다. 이 방법은 신경정신질환의 복잡한 병태생리에 병적 진동이 어떻게 기여하는지와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 뇌의 다양한 피질 및 피질하 표적으로부터 세포외 전위를 동시에 기록하는 데 사용할 수 있다는 점입니다.국소장전위(local field potentials)를 폐루프 자극(closed-loop stimulation)과 같은 치료의 바이오마커로 활용할 수 있기 때문에, 이 기술의 영향은 다양한 신경정신질환의 치료로 확대될 수 있습니다. 이 방법은 기저핵의 병태생리에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라 다른 뇌 영역에도 적용 가능합니다. 이 절차를 시작하려면 지름 200 micrometers, 길이 5 centimeter의 은선을 준비하고 필요한 경우 코팅을 제거하십시오.다음으로, 와이어 팁이 녹기 시작하여 직경 1mm의 구형이 될 때까지 불꽃에 아래 방향으로 유지합니다. 그런 다음 구형 팁의 시작 부분부터 와이어 끝까지의 총 길이가 15mm가 되도록 전극을 절단합니다. 전기생리학적 기록 시스템에 맞는 정밀 커넥터를 와이어 끝에 납땜합니다.그 다음, 전도성을 높이기 위해 와이어 끝단부터 커넥터까지의 납땜 부위를 전도성 은 바니시로 덮습니다. 전도성 바니시가 마르면, 납땜 부위를 1~3mm 열수축 튜브로 덮습니다. 시계 수리용 망치를 사용하여 공 모양의 팁을 두께의 절반이 되도록 조심스럽게 납작하게 폅니다.그 다음, 검사용 장갑을 착용하고 100% ethanol을 적신 보풀 없는 세척포를 사용하여 오염물과 그리스를 제거합니다. 그런 다음 전극을 15 milliliter 원심분리 튜브 또는 세포 배양 튜브에 넣고, 구형 팁이 완전히 잠길 때까지 가정용 염소 표백제를 채웁니다. 23분 후, 전극을 꺼내 증류수로 충분히 헹굽니다.염화은 도포가 성공적으로 이루어지면 전극 표면이 균일하게 진한 보라색으로 보여야 합니다. 그 후, 전극을 공기 중에서 건조시킵니다. 전극이 완전히 건조되면 정밀 핀셋으로 전극을 집어 옮깁니다.그 다음, 가는 붓을 사용하여 전극에 액상 전기 절연제를 도포합니다. 전극 팁 바로 뒤의 와이어부터 시작하여 열수축 튜브까지 전체를 덮어줍니다. 그 후, 절연제가 최소 2시간 동안 건조되도록 둡니다.이 단계에서는 접착 테이프를 사용하여 첫 번째 전극 쌍을 홀더의 아크릴 블록에 느슨하게 고정합니다. 전극은 아크릴 블록으로부터 약 12 millimeters 정도 돌출되어야 합니다. 다음으로, 두 번째 쌍극 전극을 첫 번째 전극 옆에 조심스럽게 고정합니다.초직접 경로(hyper direct pathway) 구조를 타겟팅하기 위해, 전극 쌍 사이의 거리는 2 mm여야 합니다. 현미경 하에서, 두 번째 양극 전극을 조심스럽게 밀어 가장 복측(ventral) 끝부분이 첫 번째 전극보다 약 200 µm 들어가도록 위치를 조정합니다. 접착 테이프를 누른 다음, 홀더의 금속 클램프로 전극을 고정합니다.동물을 마취시킨 후, 깨끗한 수술 부위를 확보하기 위해 머리 부분을 면도합니다. 동물을 정위 고정기(stereotaxic frame)에 고정한 다음, 적절한 수술용 소독제로 절개 부위와 주변 영역을 소독합니다. 이어서 메스를 사용하여 두피의 시상 방향으로 2 cm 길이의 절개를 수행합니다.메스를 사용하여 두개골 건막을 살짝 긁어내고 3% hydrogen peroxide로 두개골을 소독합니다. 그런 다음 3% hydrogen peroxide에 적신 면봉을 사용하여 남아 있는 조직을 제거합니다. 다음으로, 입전치 고정바(incisor bar)를 조절하여 두개골 상단이 수평이 되도록 맞추는데, 이는 입체정위 참조점인 bregma와 lambda가 동일한 평면에 위치함을 의미합니다.현미경 하에서 표준 쥐용 뇌정위 정렬 도구를 사용하여 지정된 팁을 브레그마(bregma)에 맞추어 교정하고, 도구의 브레그마와 람다(lambda) 지정 지점이 두개골에 동시에 닿을 때까지 절치 바(incisor bar)를 조절합니다. 캐뉼라가 장착된 뇌정위 홀더를 사용하여 브레그마를 기준으로 교정한 후, 두개골 상의 모든 드릴 구멍 위치를 계산합니다. 그 다음, 두개골을 조심스럽게 긁어내거나 수술용 컬러 마커를 사용하여 드릴로 뚫을 구멍의 위치를 표시합니다.그런 다음 마이크로 드릴을 사용하여 지름 약 1mm의 구멍들을 조심스럽게 뚫습니다. STN과 SNr의 경우, 약 2mm x 3mm 크기의 공통 구멍을 뚫습니다. 미세 캐뉼라 하나를 가져와 팁을 구부려 두 개의 갈고리 모양을 만듭니다.그 다음 훅을 사용하여 드릴 구멍에서 이물질을 제거하고, STN/SNr 공통 구멍의 경막을 조심스럽게 절개하여 제거합니다. 그 후, 드릴 구멍을 생리식염수로 세척합니다. 뇌와 경막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 15분마다 드릴 구멍에 생리식염수를 한 방울씩 투여합니다.그 다음 마이크로 드릴과 그에 맞는 스테인리스강 마이크로 나사를 사용하여, 소뇌 위쪽 기준 경막외 전극의 드릴 구멍 사이에 구멍을 뚫고 마이크로 나사를 조입니다. 다음으로, 미세 핀셋으로 전극 팁을 안내하여 두개골 바로 아래의 드릴 구멍 속으로 밀어 넣습니다. 모든 경막외 전극을 2액형 스텐실 아크릴로 고정합니다.브레그마(bregma) 지점을 가리거나 공통 STN/SNr 구멍에 영향을 주지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 텅스텐 마이크로 와이어 전극이 장착된 준비된 홀더를 정위 고정틀(stereotaxic frame)에 삽입하십시오. STN을 타겟팅하도록 설정된 가장 복측(ventral) 전극을 브레그마에 맞춰 교정하십시오.공통 STN/SNr 구멍 위로 계산된 위치에 맞춘 후, 전극을 뇌 쪽으로 내립니다. 텅스텐 마이크로 와이어 전극이 뇌 내부로 부드럽게 삽입되는지 확인하십시오. 이 과정에서 밴드패스 필터와 같은 기록 소프트웨어를 설정하고 원시 데이터 신호를 증폭합니다.그런 다음 적절한 설정을 적용한 온라인 LFP 및 스파이크 필터를 사용하십시오. 모든 필터에는 Butterworth 타입 필터를 사용합니다. 온라인 스파이크 분류를 위해 스파이크 임계값을 설정하십시오.대부분의 기록 소프트웨어에서는 스파이크 임계값을 설정할 수 있으며, 이는 신호가 소프트웨어에 의해 스파이크로 표시되기 위해 임계값을 초과해야 하는 진폭 값입니다. 다음으로, 텅스텐 마이크로 와이어 전극을 STN 상단 1 mm까지 천천히 내리고, 필요한 경우 신호가 안정될 때까지 기다립니다. 전기생리학적 매핑을 위해 전극을 100 µm 간격으로 복측으로 전진시킵니다.각 단계마다 발화 패턴, 발화율 및 스파이크 형태를 함께 제공된 원고의 그림 2에 제시된 전형적인 예시와 비교하여 평가하십시오. 전극이 원하는 구조에 위치하면 온라인 필터링과 스파이크 분류를 설정한 후 데이터 기록을 시작하십시오. 다음은 일차 운동 피질의 대표적인 600초 LFP 기록입니다.활성화 상태에 해당하는 고주파 저진폭 활동 시간대와 서파 활동 상태에 해당하는 저주파 고진폭 시간대를 구분할 수 있습니다. 그리고 이것은 600초 간격 동안 LFP의 0에서 20 Hertz 상대 전력을 보여주는 해당 시간-주파수 플롯입니다. 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 이 기술은 2시간 내에 완료될 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 마취된 쥐의 피질-기저핵 루프(cortico-basal ganglia loop)에서 세포 외 in vivo 전기생리학적 기록을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

acute-vivo-electrophysiological-recordings-local-field-potentials

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 여러 부위의 뇌 활동에 대한 전기 생리학적 기록을 위해 마취된 쥐를 준비하는 자세한 절차를 보여줍니다. 두개골에 접근하기 위해 두피를 절개하고, 정확한 위치에 구멍을 뚫어 전극을 설치하고 고정합니다. 그런 다음 텅스텐 마이크로 와이어 전극을 대상 위치에 삽입하여 데이터를 기록합니다.

쥐의 여러 부위에서 뇌 활동에 대한 생체 내 전기생리학적 기록

이 비디오는 마취된 쥐에서 공동 국소 뇌파검사(EEG)와 국소 자기장 전위(LFP)를 동시에 기록하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 쥐를 준비하고 수염 패드에 자극 전극을 부착하는 것이 포함됩니다. 표면 EEG 측정을 위해 EEG 거미 전극을 쥐의 두개골에 놓습니다. 동시에 다채널 미세전극은 두개골의 버 구멍을 통해 특정 뇌 영역에 삽입되어 국소화된 뇌 영역의 신경 활동을 기록합니다.

마취된 쥐의 동시 뇌파 및 국소 자기장 전위 기록(Concurrent Electroencephalographic and Local Field Potential Recordings in an Anesthetized Rat

이 절차는 등전점 뇌 상태의 결과, 생리 학적으로 관련된 뇌 상태 동안 지속적인 전기 활동의 완전한 폐지 후 하나의 뉴런에서 오래 지속되는 생체 세포 내 녹음을 수행한다. 동물의 생리적 상수는 조심스럽게 인공 혼수 상태로 전환하는 동안 모니터링됩니다.

등전위 뇌 상태의 유도는 신경 흥분에 내생 시냅스 활동의 영향을 조사하기<em&gt; 생체</em

이 프로토콜은 마취된 쥐에서 망막전도와 시각적 유발 전위를 동시에 측정하는 것을 설명합니다.

전위도의 동시 녹화 및 마취 된 흰쥐의 비주얼 사건 관련 전위

우리는 녹음이 마취 교란없이 실시하고 있습니다 인간의 조건에 더 유사하다 눈 (전위도) 및 의식 쥐의 뇌 (시각 잠재적 유발)에서 시각 전기 생리 신호를 측정하는 수술 주입 및 녹음 과정을 보여줍니다.

의식 쥐에 주입 및 무선 막전위의 기록 및 Visual 사건 관련 전위

이 프로토콜의 공동 화 된 electroencephalography (뇌 파)와 멀티-층 류 지역 필드는 마 취 쥐에 잠재적인 동시 녹음에 대 한 간단한 방법을 설명합니다. EEG 신호의 무시할 수 왜곡을 생산 하는 microelectrode의 삽입에 대 한 두개골에 드릴 버 구멍 표시 됩니다.

공동 화 된 Electroencephalography 및 설치류에서 로컬 필드 가능성의 동시 녹음

이 연구는 두뇌, 심전도, 근, 로컬 필드 전위의 동시 녹음 하 고 자유롭게 움직이는 쥐의 신호를 호흡 하는 방법을 소개 합니다. 이 기법을 실험 비용 절감 및 데이터 분석을 단순화, 뇌 및 말 초 기관 간의 상호 작용의 이해에 기여할 것입니다.

대뇌 피 질의 로컬 필드 전위, 심전도, 치십시오, 그리고 자유롭게 움직이는 쥐에서 리듬 호흡의 동시 녹음

우리는 microelectrode 배열을 사용 하는 설치류 뇌 조각에 4 aminopyridine 이용한 epileptiform 활동의 기록 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 사용자 지정 녹음 실 조직 생존 연장된 실험 세션에 걸쳐 유지합니다. 전극 매핑 라이브 고 자극 쌍의 선택 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스에 의해 수행 됩니다.

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

우리는 동시에 응답 nociceptive 레이저 자극으로 자유롭게 이동 하는 쥐에서 electrocorticography와 로컬 필드 전위를 기록 하는 기술을 개발 했다. 이 기술은 nociceptive 정보를 뇌에서 처리 조사를 용이 하 게 electrocortical 신호는 생체 및 거시적인 수준에서의 직접적인 관계를 설정 하는 데 도움이 됩니다.

대뇌 피 질의 로컬 필드 전위 및 응답 Nociceptive 레이저 자극으로 자유롭게 이동 하는 쥐에서 Electrocorticograms의 동시 녹음

이 프로토콜은 머리가 고정된 마우스의 뇌간에서 생체 내 고밀도 단일 뉴런 기록을 얻는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 전신 마취 전과 전신 마취 중에 REM(Rapid Eye Movement) 수면 중에 비활성화된 뇌간 영역인 복외측 수관 주위 회색에서 뉴런의 활동 전위 발화를 측정하기 위해 배포됩니다.

Head-Fixed Mice의 뇌간에서 발생한 급성 단일 단위 다중 전극 기록

여기서는 급성, 마취, 생체 내 쥐 실험에서 두 가지 유형의 척수 전기생리학적 측정을 사용하여 신경섬유 아형의 활동을 구별할 수 있는 두 가지 유형의 측정법인 국소장 전위 및 광역 동적 범위 단일 뉴런 기록을 평가하는 방법을 제시합니다.

마취된 쥐에서 말초 통증 차단을 평가하는 전기생리학적 방법

학습하세요 마취된 래트에서 국소 장 전위와 다중 단위 활성을 동시 기록하는 전기생리학 기법을 통해 피질-기저핵 루프의 기능을 연구하는 방법을. 이 기법은 신경정신질환의 병리적 진동 분석과 치료 바이오마커 개발에 활용됩니다.

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