소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

이 실험의 전반적인 목표는 트랜스포손 매개 무작위 삽입, 경쟁 실험 및 전체 게놈 염기서열 분석을 사용하여 주어진 DNA 요소의 최적 염색체 위치를 결정하는 것입니다. 이 방법은 유전 요소의 염색체 위치의 중요성과 같은 DNA 복제 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 트랜스포손 기반 무작위 삽입을 성장 이점에 의한 적자 클론 선택과 결합한다는 것입니다.

여기서는 E.coli DARS2 region에 의해 단순화되었습니다. 이 방법은 대장균의 염색체 조직에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 박테리아에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 MG1655 델타 DARS2와 같은 전기적 세포를 준비한 후 40마이크로리터의 세포에 1마이크로그램의 pNKBOR DARS2를 첨가하고 혼합물을 사전 냉각된 멸균 0.2cm 갭 큐벳으로 옮깁니다.

큐벳을 전기천공실에 삽입합니다. 그런 다음 18 킬로 볼트, 500 옴 및 25 마이크로 패럿에서 셀을 전기 천공합니다. 시간 상수는 약 5밀리초여야 하며 아크가 발생하지 않아야 합니다.

예열된 LB 육수 1ml에 박테리아 현탁액을 다시 현탁시켜 박테리아 현탁액을 빠르게 회수하고 15ml 시험관으로 옮깁니다. 항생제 선택 없이 섭씨 37도의 폭기 성장 조건에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 밀리리터당 50마이크로그램의 카나마이신이 보충된 LB 한천 플레이트에 박테리아를 플레이트하고 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

다음 날, electroporation에서 식민지를 세십시오. 하나의 콜로니는 하나의 염색체 전이 삽입과 동일한 것으로 간주됩니다. 각 접시에 LB 육수 1ml를 넣고 모든 식민지를 씻어냅니다.

박테리아 농도를 높이기 위해 동일한 LB 육수 1ml를 재사용하십시오. 그런 다음 모든 콜로니를 동일한 50ml 튜브에 모읍니다. 튜브를 소용돌이쳐 출발 물질을 동결하고 1ml의 세포 현탁액과 1ml의 50% 글리세롤을 얼음에 혼합합니다.

튜브를 드라이아이스에 10분 동안 옮깁니다. 배양물이 얼면 섭씨 80도의 음의 냉동고로 옮깁니다. 얼음 위에서 섭씨 영하 80도의 트랜스포슨 라이브러리를 해동합니다.

피펫팅으로 혼합한 다음 15ml 시험관에서 100마이크로리터의 트랜스포존 라이브러리를 10ml의 LB로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 8시간 동안 지속적으로 흔들어 폭기된 세포를 고정상으로 성장시킵니다. 원하는 대로 매개변수를 다른 성장 조건에 맞게 조정합니다.

약 10세대마다 박테리아 개체군을 전파하려면 이전에 정지된 위상 10마이크로리터를 10밀리리터의 새로운 예열 배지로 옮기고 또 다른 8시간 동안 배양물을 고정상으로 성장시킵니다. 100세대마다 1밀리리터 샘플 5개를 저장하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 여기에 나열된 특정 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 통해 NKBOR의 1KB 섹션에 대한 Southern blot에 대한 프로브를 준비합니다.

다음 프로그램을 사용하여 샘플을 실행합니다. Smith에 따르면 무작위 프라이머 시스템을 사용하여 생성된 PCR 단편에 P32 표지된 dATP를 라벨링하고 텍스트 프로토콜에 따라 총 세포 DNA를 준비합니다. 프로브가 커버하는 영역 외부의 관심 영역을 포함하는 NKBOR를 절단하는 Pvul로 전체 세포 DNA를 분해합니다.

Loebner-Olsen과 von Freiesleben에 따르면 0.7% 아가로스 젤을 사용하여 서던 블롯을 수행합니다. 단일 클론에서 DARS2 삽입 부위를 식별하기 위해 쉬운 유전자 보행을 사용하려면 700세대의 추정 경쟁 후에 먼저 LB 한천 플레이트에 박테리아를 퍼뜨려 PCR 템플릿에 대한 게놈 DNA를 분리하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. LB 육수에 단일 콜로니를 접종하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

그런 다음 20마이크로리터를 200마이크로리터의 오토클레이브 증류수로 옮깁니다. 식민지를 용액으로 소용돌이친 다음 혼합물을 섭씨 100도에서 10분 동안 가열합니다. 샘플을 최대 속도로 5분 동안 원심분리한 다음 나중에 사용할 수 있도록 세포 용해물을 섭씨 음의 20도에서 저장합니다.

다음으로, 여기에 표시된 대로 선택한 전이 내에서 어닐링하기 위해 3개의 중첩된 프라이머를 설계합니다. 200나노그램의 게놈 DNA, 중첩 프라이머 1 및 무작위 프라이머를 사용하여 20마이크로리터 PCR 반응을 준비합니다. 그런 다음, 다음 프로그램을 사용하여 샘플을 실행합니다.

두 번째 증폭의 경우 첫 번째 반응의 1마이크로리터를 템플릿으로 사용하고 중첩된 프라이머 2와 동일한 무작위 프라이머를 사용합니다. 중첩된 프라이머 3, 동일한 무작위 프라이머 및 템플릿과 같은 두 번째 반응에서 1마이크로리터를 사용하여 유사한 방식으로 세 번째 반응을 수행합니다. 최종 PCR 반응에서 생성된 산물을 1.5% 아가로스 겔과 스타틴과 에티듐 브로마이드에서 실행합니다.

100 - 800 염기쌍 범위의 밴드를 잘라내고 제조업체의 지침에 따라 상용 DNA 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다. 유세포 분석을 수행하려면 최소 10세대 동안 기하급수적 성장 단계로 유지하여 각 박테리아 배양의 균형을 맞춥니다. OD600을 측정하고 0.3을 초과하지 않는지 확인하십시오.

텍스트 프로토콜에 따라 rifampicin run-out을 수행하려면 1ml의 배양액을 30μl의 RIF-CEF가 들어 있는 15ml 튜브로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 최소 4시간 동안 흔들면서 튜브를 배양합니다. EXP 샘플의 경우, 기하급수적으로 증가하는 배양액 1ml를 얼음 위의 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

다음, 15, 000 시간 G 및 5 분 동안 4 섭씨 온도에 분리기 분리에 의하여 세포를 가을걷이십시오. 펠릿을 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 10밀리몰 트리스 pH 7.5에 다시 현탁시키고 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 77% 에탄올을 추가합니다. 사용할 때까지 샘플을 섭씨 4도에서 보관하십시오.

15, 000 시간 G에 15 분에 원심 분리에 의해 조정 세포의 100개에서 300 마이크로리터를 가을베껴서 세포를 더럽히십시오. 상등액을 제거하고 130마이크로리터의 DNA 염색 용액을 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 얼음과 어두운 곳에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.

마지막으로, 유세포 분석을 사용하여 세포당 기원, 상대적인 세포 질량 및 상대적인 DNA 함량을 측정합니다. 초기 트랜스포존 풀에서 DNA를 추출하고 700 세대 중 100 세대마다 DNA를 프로브가 커버하지 않는 영역에서 트랜스포존 NKBOR DARS2를 한 번 절단하는 것으로 알려진 Pvul로 DNA를 절단하고 남부 블롯을 수행했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 초기 DARS2 풀에는 뚜렷한 밴드가 없었으며, 이는 DARS2가 염색체 전체에 무작위로 삽입되었음을 보여줍니다.

시간이 지남에 따라 초기의 대규모 DARS2 클론 풀이 하나 또는 몇 개의 지속적인 DARS2 클론으로 발전하는 패턴이 나타났습니다. 시작 풀에서 DARS2 삽입 부위를 식별하기 위해 전체 게놈 염기서열 분석이 사용되었습니다. 그리고 400, 500 및 700 세대의 경쟁 끝에 모든 DARS2 삽입의 98%가 야생형 DARS2 염색체 위치 근처에서 발견되었습니다.

그리고 2%는 염색체의 다른 곳에서 발견되었습니다. DARS2가 결핍된 세포는 이전에 동시적으로 복제를 시작하고 야생형 세포에 비해 기원 농도가 감소하는 것으로 나타났습니다. 여기서, 말단에 DARS2 element가 존재하면 동기화 또는 세포 기원 함량을 야생형 수준으로 복원하지 않는 반면, 선택된 DARS2 클론 IR 및 RPPH는 synchrony에서 복제를 시작합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 주어진 DNA 요소의 최적 염색체 위치를 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이것은 트랜스포손 기반 무작위 삽입에 이어 경쟁 실험과 마지막으로 전체 게놈 시퀀싱에 의해 수행됩니다.