Name: 소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 학습하세요 대장균에서 트랜스포존 매개 무작위 삽입을 이용한 DNA 요소의 최적 염색체 위치 결정 방법을 경쟁 실험과 전체 게놈 시퀀싱으로 분석하는 기술입니다.

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저자는 세균성 긴장 응답 및 지 속성 (BASP) Novo Nordisk 기초, Lundbeck 재단 그리고 센터를 통해 덴마크 국립 연구 재단 (DNRF120)에서 교부 금에 의해 투자 되었다.

1. Transposon 도서관의 컬렉션 참고: 염색체 DARS2 로커 스 미니 테네시 10으로 복제 했다-transposon, NKBOR (pNKBOR)에 21, 결과 기반으로 NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR 온라인 22 얻어질 수 있다. pNKBOR 복제 23 시작자 단백질 π를 필요로 하는 R6K 기반 자살 벡터 이다. 플라스 미드 pJFM1는 따라서 pir 유전자의 염색체 복사본을 포함 하는 E. 콜라이 긴장 (예를 들어, Dh5α λ pir)에 복제할 수 있습니다. 그러나, pJFM1은 Pir 불충분 한 wildtype MG1655로 변형 때 pJFM1 복제할 수 없습니다, NKBOR의 임의 삽입에 의해 생성 된 대 저항 클론의 선택에 지도:: 세균성 염색체로 DARS2. 편의상,이 DARS2 삽입 라고 하. 그림 1 방법론의 도식 프레 젠 테이 션을 참조 하십시오.
<ol><li>준비 electrocompetent MG1655 Δ 적극적으로 성장에서 DARS2 Lysogeny 국물 (파운드)에서 37 ° C 24 성장 세포.</li>
	<li>Electroporate pJFM1 electrocompetent MG1655 Δ로 DARS2, 곤잘레스 외. 따라 24 electrocompetent 대장균 MG1655 Δ의 <ol><li>40 (물 1 µ L)에서 pJFM1의 추가 1 µ g µ L DARS2 미리 냉장, 무 균 0.2 cm 간격 베트에이 혼합물을 전송. Electroporation 챔버에는 베트를 삽입 합니다. 18 Electroporate kV, 500 Ω 및 25 µ F; 시간 상수 ~5.0 ms, 그리고 아무 아크가 발생 한다.</li>
		<li>신속 하 게 미리 데워 파운드 국물과 15 mL 테스트 튜브에 1 mL에 resuspending에 의해 세균성 정지 복구.</li>
		<li>셀 항생제 선택 없이 30 분 동안 37 ° C에서 화난된 성장 조건 하에서 배양 하 여 복구 하자. 50µg/mL 대 보충 파운드 한 천 배지 위에 박테리아 접시 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	</ol></li> <li>는 electroporation에서 식민지를 계산: 한 식민지는 것으로 간주 한 염색체 transposon 삽입. 
	참고: 식민지는 식민지 카운터 또는 눈으로 계산 될 수 있습니다. 식민지의 수는 각 클론의 염색체에 위치한 transposons 분리 평균 거리에 반비례 한다.</li>
	<li>추가 1 mL 각 파운드 국물의 접시와 모든 식민지를 씻어; 파운드 국물의 1 mL ~ 100000 식민지 씻어 충분 해야 한다. 다시 파운드 국물 세균 농도 증가 동일한 1 mL를 사용 하 여. 같은 50 mL 튜브에 모든 식민지 수영장.</li>
	<li>소용돌이 튜브 및 동결 시작 물자 (t = 0). 그것을 고정, 얼음에 50% 글리세롤의 1 mL와 함께 셀 서 스 펜 션의 1 mL를 혼합 한다. 10 분 동안 얼음 건조 튜브를 전송 합니다. 일단 문화, 냉동-80 ° C 냉동 고에 그들을 전송. 
	참고:이 단계에서 50000 CFU/mL의 최소의 셀 농도으로 예상 된다.</li>
</ol> 2. 파운드에 경쟁 실험 <ol><li>녹여 얼음에-80 ° C에서 transposon 라이브러리. Pipetting으로 믹스.</li>
	<li>Transposon 라이브러리 15 mL 테스트 튜브에 파운드의 10 mL를의 전송 100 µ L.</li>
	<li>고정 단계를 37 ° C에서 8 h에 대 한 연속 진동 (250rpm) 의해 화난 세포 성장 (즉, OD 600 ~ 4.0 =). 원하는 대로 다른 성장 조건에 이러한 매개 변수를 조정.</li>
	<li>신선한 prewarmed 매체에 연속 전송에 의해 세균성 인구 모든 ~ 10 세대를 전파합니다. 이렇게 신선한 파운드의 10 mL를 이전 고정 단계 문화 10 µ L를 전송 하 고 다른 8 h에 대 한 성장 하는 고정 단계로 (즉, OD 600 ~ 4.0 =). 
	참고: 시작 및 끝 광학 밀도 동일 인으로 빌드하기 희석에 해당 ~ 10 세대의 성장 (2 10 = 1024). 세균성 인구 중 신선한 prewarmed 매체에 직접 전파 하거나 저장할 수 0-4 ° C (얼음)에 다음 날을 전파 하 고. 파운드는 여기 많은 휴대폰 doublings에 짧은 가능한 (22 분 가까이 두 배로 시간) 시간을 보장 하기 위해 사용 되었다.</li>
	<li>경쟁의 각 100 세대, 이후 저장-80 ° C에서 5 1 mL 샘플 (단계 3.3에서에서 설명).</li>
	<li>개별 transposon 삽입을 포함 하는 셀 간의 체력 차이 작은 것으로 예상 된다, 만약 계속 경쟁의 기간 긴, 여기, 700 세대 (t = 700) 사용 되었다.</li>
</ol> 3. 감시 하는 경쟁 실험 동안 남쪽 오 점 분석 <ol><li>특정 뇌관을 사용 하 여 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭을 수행 하 여 오 (1-kb 섹션에서 NKBOR의) 남부에 대 한 조사를 준비: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat 및 NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
	<li>품 30 98 ° C에 <ol>초기 변성에 대 한 s. 그런 다음 10 98 ° C에서 35 주기를 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 45 72 ° C s. 마지막 확장에 대 일 분을 위한 72 ° C 사용 
		참고: PCR 반응에 대 한 서식 파일은 순화 pNKBOR 플라스 미드 21.</li>
		<li>스미스 25에 따라 결과 PCR 파편 [α-32 P] dATP 임의의 뇌관 시스템을 사용 하 여 레이블.</li>
	</ol></li> <li>T Løbner Olesen 및 폰 Freiesleben 26에 따르면 총 세포질 DNA 준비 = 0 및 선택한 시간 포인트 t까지 700 세대 경쟁의 추정 =.</li>
	<li>소화 Pvu을 인하 하지 지역에만 한 번 관심 영역을 포함 하는 NKBOR 나 프로브에 의해 보호와 총 세포질 DNA; 1 단위의 Pvu 나 기판 DNA의 완전히 다이제스트 1 µ g를 사용할 수 있습니다. 
	참고: 프로브 삽입 사이트에 따라 다양 한 길이의 염색체 DNA 함께 transposon의 일부가 들어 있는 조각 인식 합니다.</li>
	<li>Løbner Olesen 및 폰 Freiesleben 26에 따라 0.7 %agarose 젤을 사용 하 여 남쪽 오 점 수행.</li>
</ol> 4. 적자 클론의 식별 <ol><li>사용 쉬운 유전자 걷기, 해리슨 그 외 여러분에 의해 설명 된 대로 27, 700 예상된 세대 경쟁; 후 단일 클론 (파운드 플레이트에 고립 된)에서 DARS2 삽입 사이트를 식별 하 더 밴드 남쪽 오 점에 더 격리 하는 데 필요한 모든 transposon 삽입 커버.
	<ol><li>격리 PCR 템플릿 genomic DNA 50 µ g/mL 대를 포함 하는 파운드 한 천 격판덮개에 박테리아를 확산 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어. 37 ° C에서 파운드 국물에서 숙박 한 식민지를 성장 한 이후에 압력가 증류수 200 µ L로 20 µ L을 전송 (또는 DNA 정화 단계 3.2에서 사용).
		<li>혼합 소용돌이 <ol>입니다. 위한 10 분 및 5 분에 대 한 최대 속도 원심 분리기 저장 세포 lysate 미래 사용을 위한-20 ° C에서 100 ° C에서 혼합 열.</li>
		</ol></li> <li>선택의 transposon 내 anneal를 3 중첩 된 뇌관 디자인 (PCR 전략의 그래픽 표현에 대 한 그림 2 참조). 
		참고: 중첩 된 뇌관 3 알려진된 5에 가장 가까운 거짓말 확인 해야 중첩 된 뇌관 디자인 &#39; transposon DNA, 중첩 프라이 머 2와 1의 끝. 중첩 된 뇌관 3와 5 사이 간격 &#39; 알려진된 t의 끝ransposon DNA (사이트를 찾을 수 있는 특정 염색체 transposon 삽입) 알 수 없는 DNA에 알려진된 DNA에서 시퀀스 read-through에 대 한 충분 해야 한다. NKBOR에 대 한 다음 중첩 된 뇌관을 사용 되었다: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg, 및 pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. 알려진된 제한 효소의 인식 사이트를 포함 하는 임의의 뇌관도 사용 됩니다. 결과 보장 하기 위해, 하나는 적어도 두 개의 다른 무작위 뇌관을 사용 해야 합니다. 제한 효소 (e.g.,Sau 3AI 및 힌 dIII)에 대 한 제한 사이트 있어야 3 &#39; 끝과 앞 10 임의의 기지 그래서 그 5 &#39;-NNNNNNNNNNGATC-3 &#39; 5 &#39;-NNNNNNNNNNAAGCTT-3 &#39;는 뇌관 포함 된 Sau 3AI 사이트 (GATC) 힌 dIII 사이트 (AAGCTT), 각각, 어디 N = A, T, G, 또는 C.</li>
		<li>20에서 게놈 DNA의 사용 200 ng µ L PCR 반응. 30에 대 한 98 ° C에 품 어 초기 변성에 대 한 s. 30에 대 한 98 ° C에서 25 주기를 수행 15 50 ° C s s, 그리고 4 분 동안 72 ° C. 마지막 확장에 대 한 사용 하 여 72 ° C 10 분 사용 뇌관 쌍 구성 된 중첩 된 뇌관 1 무작위 뇌관 중 하나.</li>
		<li>뇌관 쌍 뇌관 2 중첩 및 두 번째 증폭에서 동일한 무작위 뇌관의 구성 된 그것의 이전 반응의 1 µ L를 사용 하 여 서식 파일로 사용.</li>
		<li>반복 단계 4.1.4 뇌관 3 중첩 된 동일한 임의의 뇌관의 구성 된 뇌관 쌍.</li>
		<li>는 1.5 %agarose 젤에 ethidium 평범한 사람으로 얼룩 최종 PCR 반응에서 제품을 실행합니다. 100-800 bp 범위에서 밴드를 잘라 하 고 어떤 상업적인 DNA 젤 추출 키트 제조 업체에 따르면를 사용 하 여 DNA를 분리 &#39; s 방향. 물 15 µ L에서 DNA resuspend. 
		참고: 주의. Ethidium 평범한 사람 독성 그리고 관리와 처리 해야 합니다.</li>
		<li>생어를 사용 하 여 시퀀싱 뇌관으로 뇌관 3 중첩 (4.1.6 단계) 이전 단계에서 격리 하는 밴드 순서는 상업적인 공급자에서 시퀀싱.</li>
	</ol></li> <li>WGS 수행.
	<ol><li>Frimodt 몰 러 외 4에 설명 된 대로 수행 WGS DNA에서 추출한 총에 경쟁 실험 기간 동안 수집 된 샘플을 선택.</li>
	</ol></li> <li>시퀀싱 분석 수행.
	<ol><li>맞춤 짝 간 150을 읽고 NKBOR, AF310136.1 1,904 인접 Ns &#8230; 2,204 씨앗 부분 문자열 (S, 1, 1.15)와의 모호한 문자 (L, 0, 0.9) 최대 수 사이 간격 Bowtie2 28을 사용 하 여.</li>
		<li>정렬 된 읽기를 선택 하 고 다음 다시 두 MG1655 ref를 정렬 | NC_000913.3 및 NKBOR 기가바이트 | AF310136 blastN 29를 사용 하 여</li> <li>할당 전위 접합 MG1655 NKBOR에서 삽입 위치.</li>
	</ol></li></ol> 5. Flow Cytometry <ol><li>cytometry에 대 한 샘플을 수집.
	적어도 10 세대를 위한 지 수 성장 단계에 그것을 유지 하 여 <ol><li>균형 각 문화. OD 600을 확인 하 고 그것은 결코 0.3 초과 확인.</li>
		<li>두 가지 유형의 흐름 샘플을 수집합니다.
		<ol><li>RIF runout에 대 한 RIF-CEF (300 µ g/mL 리 팜 피신과 36 µ g/mL 세 팔 렉 신 12.5 m m NaOH에에서 녹아 있는)의 30 µ L을 포함 하는 15 mL 튜브에 문화의 1 mL을 전송. 동요의 4 h의 최소 37 ° C에서 그것을 두고. 
			참고: 리 팜 피신 직접 차단 하지 복제에의 지속적인 라운드 종료를 계속 하면서 염색체 복제의 개시 합니다. 세 팔 렉 신 세포 분열, 복제 runout (RIF runout)에 완전히 복제 된 염색체를 가진 세포의 축적을 방지 합니다. 리 팜 피신 및 세 팔 렉 신 20 치료 시 완전히 복제 된 염색체의 수는 근원의 수.</li>
			<li>특급-샘플, 전송의 기 하 급수적으로 성장 하는 얼음에 1.5 mL 튜브에 문화 1 mL</li>
		</ol></li></ol></li> <li>셀을 다음과 같이 수정. 4에서 5 분 동안 15000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수확 ° C. 얼음 10 mM Tris pH 7.5의 100 µ L에 펠 릿을 Resuspend 하 고 차가운 77% 에탄올의 1 mL을 추가. 사용 될 때까지 4 ° C에서 샘플 저장.</li>
	<li>셀 다음과 같이 얼룩. 상쾌한 15 분 제거에 대 한 15000 x g에서 원심 분리 하 여 고정된 셀의 100-300 µ L를 수확 하 고 펠 릿의 130 µ L에서 resuspend &#34; DNA 얼룩이 솔루션 &#34; (90 µ g/mL mithramycin, 20 µ g/mL ethidium 평범한 사람, 10 m m MgCl 2 그리고 10 mM Tris pH 7.5). 얼음에 샘플을 넣어 하 어두운; 샘플에 대 한 준비가 흐름 cytometry 분석 10 분 후 
	참고: 다른 DNA ethidium 평범한 사람 보다 얼룩과 mithramycin 사용된 30 , 31 수.</li>
	<li>흐름 cytometry 분석 셀, 상대 셀 질량 및 상대 DNA 콘텐츠 원본 결정.
	<li>수행 cytometry, 32에서 설명한 대로 <ol>. RIF runout 및 EXP-샘플 교류 cytometer 제조 업체를 사용 하 여 실행 &#39; s 지침 . Mithramycin-및 ethidium 평범한 사람 얼룩이 진 셀 여기 파장 395 및 440 nm을 사용 하 고 565 위 형광 수집 nm.
		<li>셀 번호 히스토그램 대 단일 매개 변수 앞으로 빛 분산형 및 30000 이벤트의 최소 셀 번호 히스토그램 대 형광 강도 특급 샘플 실행 상대 셀 질량과 상대 DNA 콘텐츠를 결정 하려면 <ol> 해당 셀 신호 하.</li>
			<li>사용 앞으로 흩어져 빛 단일 매개 변수 분포를 평균 상대 측정 셀 미사 
			참고: 앞으로 흩어져 빛은 평균 셀 대량 20.</li>
			<li>평균 DNA를 측정 하기 위해 사용 형광 강도 단일 매개 변수 배포판 콘텐츠 20.</li>
			<li>평균 DNA 콘텐츠 평균 셀 대량 20의 비율으로 DNA 농도 얻을.</li>
		</ol></li> <li>셀 당 근원의 수를 결정.
		<ol><li>대 단일 매개 변수 형광 강도를 실행 RIF runout 샘플 셀 셀 신호에 해당 하는 30000 이벤트의 최소 숫자 히스토그램.</li>
			<li>각 염색체의 수를 확인 하려면 사용 하 여 형광 강도 단일 매개 변수 배포판 셀 20.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>계산 비동기 인덱스 (Ai).
	<li>계산 Ai, Løbner Olesen 외에 설명 된 대로 <ol> 32, RIF runout 샘플 및 수식 Ai의 형광 강도 단일 매개 변수 배포판을 사용 하 여 = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 f4 + f8), fx가 x 완전히 복제 된 염색체의 수와 분수 셀. 식 이라고 때 비동기 고려 A &#62; 0.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자는 전혀 경쟁 금융 관심이 없다.

여기에서 사용 하는 방법론-의 상태--예술 기법 유전적 요소의 최적의 게놈 위치에 대 한 어려운 질문에 대답을 활용 합니다. 유전자 요소 (중재는 transposon)의 임의 삽입 수 클론 다음 조사 유전 요소의 최적의 위치를 위해 선택 하는 서로 대하여 경쟁 하기 위해 만들 수 있는 수천의 신속 하 고 쉽게 컬렉션 (즉 적자 클론).
여기, DARS2 미니-테네시10에 삽입 된-transposon, NKBOR를 기반으로. Transposon의 선택 삽입 사이트의 다운스트림 분석을 위해 중요 하다. 여러 다른 transposons 미니-테네시5Km234 등 더 인기 있는 선택, Himar는 transposon 감독 삽입 사이트 시퀀싱 (TraDIS) 실험에서 사용 된 난 마리너 transposon35,</s...

어떤 유전적 요소의 기능 게놈에 있는 그것의 위치에 따라 달라질 수 있습니다. 박테리아에이 주로 결과 방해에서 인접 유전자, 로컬 DNA 토폴로지 및 복제 관련 유전자 노출량의 전사에 의해. 특히, DNA 복제 및 분리의 프로세스 제어, 적어도 부분에서 비 코딩 염색체 지역별1, 그리고이 지역의 적절 한 기능에 따라 달라 집니다 genomic 위치/컨텍스트. 대장균, 예제에서는 여동생에 필요한 dif 사이트 염색체 해상도2; KOPS 시퀀스, 염색체 분리3;에 필요한 및 데이터, DARS1및 DARS2 지역, (아래; 적절 한 염색체 복제 제어에 필요한 4). 우리 여기 DARS2 비 코딩 영역의 연구에 의해 exemplified 임의의 이전, 선택, 그리고 어떤 주어진된 유전 요소의 최적의 유전자 맥락의 결정에 대 한 허용 하는 방법 제시.
대장균, DnaA에 시작자 단백질은 DNA 물가는 단일 복제 원점오릭스, 여 helicase DnaB5,,67의 채용에 대 한 책임. DnaA AAA+ (즉, 다양 한 활동과 관련 된 ATPases)에 속하는 단백질 유사한 높은 ATP 그리고 ADP를 바인딩할 수 및 화력5. DnaAATP 수준 개시8, DnaAATP 에 multimer를 형성에서 봉우리 오릭스 는 DNA 이중 오프닝9트리거합니다. 개시, 후 오릭스 hemimethylated SeqA 단백질의 바인딩을 포함 하는 메커니즘에 의해 격리로 인해 다시 개시에 대 한 일시적으로 사용할 수 없게 만든 오릭스10,11. 격리, 동안 DnaAATP 의 수준을 적어도 두 가지 메커니즘에 의해 감소 된다: DnaA (RIDA)12,13 및 데이터의 규제 비활성화-종속 DnaAATP 가수분해 (DDAH)14 ,15. RIDA와 DDAH 홍보 DnaAADPDnaAATP 의 변환. 개시의 새로운 라운드 전에 DnaAADP 는 특정 DnaA 재가동 시퀀스 (DARS)에 DnaAATP 를 재가동: DARS1 및 DARS216,17. 염색체 데이터, DARS1및 DARS2는 비 코딩 지역과 DnaAATP를 변조 하는 보호자와 같은 방식으로 행동 /DnaAADP interconversion. 복제의 근원 밖에이 지역 활성화 DnaA 복잡 한 어셈블리 중 하나에 대 한 비활성화 (데이터, 14) 또는 활성화 (DARS1 및 DARS2; 17) DnaA의. DARS2 셀에서 삭제 대량 배로 시간 되지만 비동기 복제 개시15,,1618변경 되지 않습니다. 그러나, DARS2-결핍 세포는 피트 니스는 풍부한 매체에서 모두 지속적인 성장 경쟁 하는 동안 또는 마우스 내장18에 있는 식민지의 설립 동안에 그렇지 않으면 isogenic wildtype에 비해 비용. 이 비동기/근원 농도에 사소한 변화 세균성 체력에 부정적인 효과 나타냅니다. 대장균, 선택적 압력 유지 염색체 대칭 (즉, 두 거의 같은 길이의 복제 팔)19있다. 데이터, DARS1및 DARS2 지역에 동일한 상대 거리는 오릭스 모든 대장균 변종 시퀀싱18, 염색체 크기에 큰 변화에도 불구 하 고.
여기, 우리가 그것의 기능에 대 한 최적의 염색체 position(s)의 식별에 대 한 예를 들어 대장균 의 DARS2 지역을 사용합니다. DARS2 NKBOR transposon 및 결과 NKBOR에 삽입 되었다: MG1655의 게놈에 무작위로 삽입 이후DARS2 transposon ΔDARS2. 우리는 따라서 셀의 컬렉션을 생성, 각 보유 DARS2 염색체에 다른 위치에 배치 합니다. 생체 외에서 경쟁 실험, 어디는 컬렉션에 있는 모든 셀 풀링된 되었고 약된 700 세대에 대 한 파운드에서 지속적인 성장을 하는 동안 서로 대하여 경쟁, 수행 되었다. 경쟁 실험의 결과 모니터링/결정 했다 남쪽 오 점, 쉬운 유전자 산책, 그리고 전체 게놈 시퀀싱 (WGS;를 사용 하 여 그림 1)입니다. 끝점 클론 쉬운 유전자 걸어서 해결 cytometry 세포 주기 매개 변수를 평가 하 여 특징 이었다. 흐름 cytometric 분석에 많은 수의 셀에 대 한 셀 크기, DNA 콘텐츠 및 개시 synchrony를 측정할 수 있습니다. Cytometry, 하는 동안 단일 셀의 흐름은 다음 동시에 등록 내보낸된 형광 DNA 콘텐츠, 측정을 수집 하는 photomultipliers에 의해 제공, 스테인드 DNA를 자극 하는 적절 한 파장의 광선 전달 합니다 세포는 DNA에 물 들 다. 앞으로 흩어져 빛 셀 대량20의 측정 이다.
생체 외에서 경쟁 실험 선물이 여기 염색체 위치 및 유전 요소의 게놈 맥락의 중요성에 관한 문제를 해결 하는 데 사용 됩니다. 방법은 공평 하 고 사용 하기 쉬운입니다.

<table><tbody><tr><td>고압 클레이브 Mili-Q 물</td><td></td><td>없음</td><td></td></tr><tr><td>전기충격 큐벳, 0.1 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P41050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad MicroPulser 전기충격 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780029&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천, 분말 (Lennox L 한천)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; 플라스틱 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&nbsp; CryoTubes</td><td>시그마-알드리치</td><td>V7634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA 중합효소(2 U/&micro; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>dATP, [&alpha;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &마이크로; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU012H250UC</td><td></td></tr><tr><td>DECAprime II DNA 라벨링 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1455</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계&nbsp; SF/MBV/03.32</td><td>Pharmacia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hermle 원심분리기&nbsp; &nbsp; &nbsp; SF/MBV/03.46</td><td>Hermle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ole Dich 원심분리기&nbsp; SF/MBV/03.29</td><td>Ole Dich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 2.0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>96% 에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>페놀 초순수</td><td>BRL</td><td>5509UA</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Merck</td><td>2445</td><td></td></tr><tr><td>리보 뉴클레아제 A 유형 II 시</td><td>그마 - 알드리치</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 황산염 (SDS)</td> <td>머크</td><td>13760</td><td></td></tr><tr><td>리소자임</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>L 6876</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>405-7</td><td></td></tr><tr><td>0.5M Na-EDTA pH 8.0</td><td>BRL</td><td>5575 UA</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신 설페이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>10106801001</td><td></td></tr><tr><td>PvuI(10 U/&마이크로; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0621</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>DNA 겔 로딩 염료(6X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA 완충액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>브롬화 에티듐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>433160</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71687</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; 3MM 종이</td><td>시그마-알드리치</td><td>WHA3030931</td><td></td></tr><tr><td>SSC 버퍼 20&times; 집중</td><td>시그마-알드리치</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>아머샴 하이본드-N+</td><td>GE 헬스케어</td><td>RPN119B</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp; 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 - 분획 V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>연어 고환에서 추출한 디옥시리보 핵산 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Carestream Kodak &nbsp; 바이오맥스 &nbsp; 라이트 필름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z373494</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp; 젤 추출 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1111&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>젠엘루트 &nbsp; PCR 클린업 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1020</td><td></td></tr><tr><td>T100&nbsp; Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec Plus 분광 광도계</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>리팜피신</td><td>서비스</td><td>34514.01</td><td></td></tr><tr><td>세팔렉신</td><td>시그마-알드리치</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>미트라마이신</td><td>서비스</td><td>29803.02</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>아포지 A10 악기</td><td>아포지</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

소설 transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 dna 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

특정된 DNA 요소의 최적의 염색체 position(s)는 / transposon 중재 무작위 삽입 휘트니스 선택에 의해 다음에 의해 결정 되었다. 박테리아, 유전적 요소의 기능에 유전 맥락의 영향을 평가 하기 위해 어려울 수 있습니다. 토폴로지 효과, 이웃 유전자 또는 유전자 복제 관련 된 복용량, transcriptional 방해를 포함 하 여 몇 가지 메커니즘 주어진 유전적 요소의 기능 영향을 줄 수 있습니다. 여기, 대장균 및 간단한 성장 경쟁을 사용 하 여 가장 유리한 위치 실험 선택의 염색체에 DNA 요소의 임의의 통합을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 임의의 삽입, 성장 혜택, 실험적인 요구에 쉽게 조절 절차 적자 clone(s)의 선택과 결합의 잘 설명된 transposon-기반 시스템의 활용. 복잡 한 다중 클론 인구에 전체 게놈 시퀀싱 또는 선택 된 클론의 급속 한 식별에 대 한 쉬운 유전자 적자 clone(s)의 성격을 결정할 수 있습니다. 여기, 비 코딩 DNA 영역 DARS2, 대장균의 염색체 복제의 개시를 제어 하는 예제로 사용 되었다. DARS2 의 기능 유전자 복제 관련 된 복용량;에 의해 영향을 받을 것으로 알려져 가까이 DARS2 는 더 활성화 된다 DNA 복제의 기원에 가져옵니다. DARS2 DARS2의 염색체에 무작위로 삽입 된-변형 삭제. 개별 삽입을 포함 하는 결과 클론 풀링된 그리고 세대의 수백을 위해 서로 경쟁 했다. 마지막으로, 적자 클론 특징 되었고 DARS2 원래 DARS2 위치에 가까운 근접에서 삽입 포함 발견.

남쪽 오 점 DARS2 transposon 라이브러리에 염색체에 걸쳐 무작위로 배포 했다 확인 이루어졌다 (t = 0) 적자 클론 시간이 지남에 유지할 것 이다 그. 남쪽 오 점 초기 transposon 풀에서 추출한 DNA에서 수행 되었다 (t = 0)과 경쟁 (그림 3)의 700 세대에서 모든 예상된 100. 여기, 각 시간 점에서 총 세포 DNA가 나 제한 효소, 잘라 transposon NKBOR 알려진 Pvu와 소화::DARS2 한 번 조사에 의해 적용 되지 않는 지역에만. 남쪽 오 점 NKBOR의 부분 보완 방사성 레이블이 DNA 파편으로 조사 되었다. 그림 3, 초기 DARS2 수영장에서에서 본 (t = 0) DARS2 염색체에 걸쳐 무작위로 삽입 된 보여주는 부족된 고유 ...

여기, 비 코딩 DNA 요소의 transposon 중재 무작위 삽입의 힘의 최적의 염색체 위치를 해결 하기 위해 사용 되었다.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

본 실험의 전반적인 목표는 트랜스포존 매개 무작위 삽입, 경쟁 실험 및 전장 유전체 시퀀싱을 이용하여 임의의 DNA 요소에 대한 최적의 염색체 위치를 결정하는 것입니다. 이 방법은 유전 요소의 염색체 위치의 중요성과 같이 DNA 복제 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 트랜스포존 기반의 무작위 삽입을 성장 우위에 따른 최적의 클론 선택과 결합했다는 점입니다.여기서는 E.coli DARS2 영역을 통해 간소화되었습니다. 이 방법은 Escherichia coli의 염색체 구성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 다른 박테리아에도 적용 가능합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 MG1655 delta DARS2와 같은 전기 천공 가능 세포를 준비한 후, 40 µL의 세포에 1 µg의 pNKBOR DARS2를 첨가하고 혼합물을 미리 냉각된 멸균된 0.2 cm 간격 큐벳으로 옮깁니다.큐벳을 전기천공 챔버에 삽입하십시오. 그런 다음 18 kilovolts, 500 ohm 및 25 microfarad 조건으로 세포를 전기천공하십시오. 시간 상수는 약 5 milliseconds여야 하며, 아크 방전이 발생하지 않아야 합니다.미리 데워둔 LB broth 1 mL에 다시 현탁하여 박테리아 현탁액을 빠르게 회복시킨 후, 15 mL 시험관으로 옮깁니다. 항생제 선택 없이 37 °C의 통기 성장 조건에서 세포를 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 50 µg/mL의 kanamycin이 첨가된 LB agar 플레이트에 박테리아를 도말하고, 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 전기천공법(electroporation)으로 형성된 콜로니 수를 측정합니다. 콜로니 1개는 염색체 트랜스포존 삽입 1개와 동일한 것으로 간주합니다. 각 플레이트에 LB 배지 1 mL를 첨가하여 모든 콜로니를 씻어냅니다.박테리아 농도를 높이기 위해 동일한 1 mL의 LB 배지를 재사용하십시오. 그 다음, 모든 콜로니를 동일한 50 mL 튜브에 모으십시오. 튜브를 볼텍싱하여 시작 물질을 균질화하고, 얼음 위에서 세포 현탁액 1 mL와 50% glycerol 1 mL를 혼합하십시오.튜브를 드라이아이스에 10분 동안 둡니다. 배양액이 얼면 -80°C 냉동고로 옮깁니다. -80°C에 보관된 트랜스포존 라이브러리를 얼음 위에서 해동합니다.피펫팅으로 혼합한 다음, 트랜스포손 라이브러리 100 µL를 15 mL 시험관에 담긴 LB 10 mL에 옮깁니다. 37 °C에서 8시간 동안 지속적으로 흔들어 공기를 공급하며 배양하여 정지기에 도달하게 합니다. 필요에 따라 매개변수를 다양한 성장 조건으로 조정하십시오.박테리아 개체군을 약 10세대마다 증식시키기 위해, 이전에 정지기(stationary phase)에 도달한 배양액 10 µL를 미리 데워둔 신선한 배지 10 mL에 옮기고 다시 8시간 동안 배양하여 정지기에 도달하게 합니다. 경쟁 단계가 100세대마다 진행될 때마다, 1 mL 샘플 5개를 채취하여 -80 °C에 보관합니다. 여기에 나열된 특이적 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 통해 NKBOR의 1 kb 구간에 대한 Southern blot용 프로브를 준비합니다.다음 프로그램을 사용하여 샘플을 분석하십시오. Smith의 방식에 따라 랜덤 프라이머 시스템을 이용하여 결과 PCR 단편을 P32-표지 dATP로 표지하고, 텍스트 프로토콜에 따라 총 세포 DNA를 준비하십시오. 프로브로 덮인 영역 외부의 관심 영역을 포함하는 NKBOR을 절단하는 Pvul로 총 세포 DNA를 소화하십시오.Loebner-Olsen 및 von Freiesleben의 방법에 따라 0.7% agarose gel을 사용하여 Southern blot을 수행합니다. 단일 클론으로부터 DARS2 삽입 부위를 식별하기 위해 easy gene walking을 사용하려면, 약 700세대의 경쟁 배양 후, 먼저 박테리아를 LB agar 플레이트에 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 PCR 템플릿용 genomic DNA를 분리합니다. 단일 콜로니를 LB broth에 접종하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.그런 다음, 20 µL를 200 µL의 멸균 증류수에 옮깁니다. 콜로니가 용액에 섞이도록 볼텍싱하고, 혼합물을 100 °C에서 10분 동안 가열합니다. 샘플을 최대 속도로 5분 동안 원심 분리한 후, 세포 용해물을 -20 °C에 보관하여 추후에 사용합니다.다음으로, 여기와 같이 선택한 트랜스포존 내에 결합하도록 세 개의 네스티드 프라이머(nested primers)를 설계합니다. 200 ng의 게놈 DNA, 네스티드 프라이머 1 및 랜덤 프라이머를 사용하여 20 µL PCR 반응액을 준비합니다. 그런 다음, 다음 프로그램에 따라 샘플을 반응시킵니다.두 번째 증폭을 위해, 첫 번째 반응물 1 µL를 템플릿으로 사용하고 네스티드 프라이머 2와 동일한 랜덤 프라이머를 사용하십시오. 네스티드 프라이머 3, 동일한 랜덤 프라이머 및 두 번째 반응물 1 µL를 템플릿으로 사용하여 유사한 방식으로 세 번째 반응을 수행하십시오. 최종 PCR 반응 생성물을 1.5% agarose 겔에서 전기영동하고 ethidium bromide로 염색하십시오.100에서 800 base pairs 범위의 밴드를 절취하고, 제조사의 지침에 따라 상용 DNA gel extracting kit를 사용하여 DNA를 분리합니다. 유세포 분석을 수행하려면, 각 박테리아 배양액을 최소 10세대 동안 지수 성장기에 유지하여 균형을 맞춥니다. OD600을 측정하여 0.3을 초과하지 않도록 합니다.텍스트 프로토콜에 따라 리팜피신 run-out을 수행하려면, 30 µL의 RIF-CEF가 들어 있는 15 mL 튜브에 배양액 1 mL를 옮깁니다. 해당 튜브를 37 °C에서 최소 4시간 동안 흔들어 배양합니다. EXP 샘플의 경우, 지수 성장기 배양액 1 mL를 얼음 위에 놓인 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.그 다음, 15,000 ×g, 4 °C 조건에서 5분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 펠렛을 얼음처럼 차가운 10 mM Tris pH 7.5 100 µL에 재부유시킨 후, 얼음처럼 차가운 77% ethanol 1 mL를 첨가합니다. 샘플은 사용 전까지 4 °C에서 보관하십시오.15,000 ×g에서 15분 동안 원심분리하여 고정된 세포 100 내지 300 µL를 수집함으로써 세포를 염색합니다. 상층액을 제거하고 130 µL의 DNA 염색 용액을 사용하여 펠렛을 재부유시킵니다. 그런 다음, 샘플을 얼음 위 암소에서 10분 동안 배양합니다.마지막으로, 유세포 분석법을 사용하여 세포당 기원, 상대적 세포 질량 및 상대적 DNA 함량을 결정합니다. 초기 트랜스포존 풀과 경쟁 기간 동안 추정된 700세대 중 매 100세대마다 DNA를 추출한 후, 프로브로 덮이지 않은 영역에서 transposon NKBOR DARS2를 한 번 절단하는 것으로 알려진 Pvul로 DNA를 절단하고 서던 블롯을 수행했습니다. 여기에서 보는 바와 같이, 초기 DARS2 풀에서는 뚜렷한 밴드가 나타나지 않았으며, 이는 DARS2가 염색체 전체에 무작위로 삽입되었음을 보여줍니다.시간이 지남에 따라, 초기 DARS2 클론의 대규모 풀이 단 하나 또는 소수의 지속적인 DARS2 클론으로 발달하는 패턴이 나타났습니다. 초기 풀의 DARS2 삽입 부위를 식별하기 위해 전유전체 서열 분석이 사용되었습니다. 그리고 삽입 서열의 대표적인 하위 집합을 대상으로 400, 500, 700 세대의 경쟁을 거친 후, 모든 DARS2 삽입의 98%가 야생형 DARS2 염색체 위치 근처에서 발견되었습니다.그리고 2%는 염색체의 다른 곳에서 발견되었습니다. DARS2 결핍 세포는 이전에 복제를 동기화하여 시작하며, 야생형 세포에 비해 기점 농도가 감소하는 것으로 나타났습니다. 여기서 말단에 DARS2 요소가 존재하더라도 동기화나 세포 내 기점 함량이 야생형 수준으로 회복되지 않는 반면, 선택된 DARS2 클론인 IR 및 RPPH는 복제를 동기화하여 시작합니다.이 영상을 시청한 후에는 특정 DNA 요소의 최적의 염색체 위치를 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 트랜스포존 기반의 무작위 삽입 후 경쟁 실험을 수행하고, 마지막으로 전장 유전체 시퀀싱을 통해 이루어집니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

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에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

출처: Kazi, M. I., et. al., 고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에서 트랜스포존 삽입 라이브러리 생성. J. Vis. Exp. (2020년)이 비디오는 카나마이신 내성을 기반으로 트랜스포존 삽입을 운반하는 그람 음성 수용자 박테리아의 선택, 정량화 및 보존을 보여줍니다.

게놈 트랜스포존 삽입을 통한 그람 음성 박테리아의 분리

엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.

생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

여기에 제시 된 대장균 또는 Shigella flexneri 세균성 활용을 사용 하 여 고밀도 transposon 삽입 라이브러리를 만들기 위한 간단한 방법이입니다. 이 의정서는 transposon의 임의의 게놈 삽입 하 여 독특한 돌연변이 박테리아에 수천의 수백의 컬렉션의 창조를 허용 한다.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

시퀀싱 (RH-seq)을 통한 상호 반심은 종 간의 특성 차이의 유전적 기초를 매핑하는 강력한 새로운 방법입니다. hemizygotes의 풀은 트랜스포종 돌연변이 발생에 의해 생성되고 그들의 체력은 높은 전반에 걸쳐 시퀀싱을 사용하여 경쟁적인 성장을 통해 추적됩니다. 결과 데이터의 분석은 특성의 근본적인 유전자를 찾아낸다.

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당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.

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소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

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