2017년 7월 22일
기술 된 수경 공동 배양 시스템은 금속 메쉬 스크린이있는 온전한 식물을지지하고 박테리아와 함께 배양한다. 식물 조직, 박테리아 및 분비 된 분자는 하류 분석을 위해 따로 따로 수확 할 수 있으며 동시에 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물 또는 미생물의 분자 반응을 조사 할 수 있습니다.
이 시스템의 전반적인 목표는 자연 환경을 밀접하게 모방한 간단한 실험 환경에서 식물과 마이크로 파트너 간의 상호 신호 상호 작용 및 반응 또는 화학 물질 또는 비생물적 요인에 대한 식물의 반응을 연구하는 것입니다. 이 비디오는 Agrobacterium tumefaciens 박테리아와 식물의 공동 재배를 보여줍니다. 이 방법은 식물의 미생물 상호 작용, 미생물 또는 식물 스트레스 반응, 식물의 미생물 상호 작용의 초기 단계에서도 복잡한 신호 전달을 포함한 분자 신호에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 기술의 가장 큰 장점은 자연 환경을 모방하는 간단한 설정에서 식물의 미생물 상호 작용의 자연 신호 및 반응을 이해하는 데 도움이 된다는 것입니다. 이 방법은 단일 미생물 종과 식물의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있지만 여러 미생물 종 또는 비생물적 요인과의 식물 상호 작용을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 우리는 자연 상황을 밀접하게 모방하는 식물 미생물 상호 작용 중에 세포 신호 항상성을 찾는 동안 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다.
실험을 시작하려면 씨앗을 살균해야 합니다. 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 경우, 약 200개의 씨앗과 500마이크로리터의 탈이온수를 마이크로 원심분리기 튜브에 결합하고 튜브를 고속으로 와류시킵니다. 테이블탑 마이크로 원심분리기에서 9000 x g의 튜브를 30초 동안 원심분리합니다.
피펫을 사용하여 물 상층액을 제거합니다. 다음으로, 300 마이크로 리터의 2 % 차아 염소산 나트륨을 씨앗에 넣고 와류로 만듭니다. 혼합물을 실온에서 가라앉히십시오.
1분 후 씨앗을 원심분리합니다. 피펫으로 차아염소산나트륨 용액을 제거합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 멸균 탈이온수를 씨앗에 넣고 혼합물을 와류로 만듭니다.
튜브를 원심 분리한 후 물을 제거합니다. 씨앗에 500 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 첨가하고 혼합물을 와류로 만듭니다. 씨앗이 1분 동안 가라앉도록 한 후 튜브를 원심분리합니다.
피펫을 사용하여 70% 에탄올을 제거합니다. 500마이크로리터의 멸균 탈이온수로 씨앗을 5번 씻습니다. 그런 다음 멸균된 씨앗을 500마이크로리터의 멸균된 초순수에 다시 현탁시킵니다.
25ml의 절반 강도 Murashige 및 Skoog 또는 04% phyto 한천이 포함된 MS 매체를 각 멸균 깊은 페트리 접시에 붓습니다. 각 페트리 접시에 대해 90mm x 90mm 정사각형의 스테인리스 스틸 메쉬를 잘라냅니다. 메쉬가 페트리 플레이트 내부에 맞을 만큼만 각 사각형 메쉬의 모서리를 구부립니다.
모서리를 메쉬의 대부분에 대해 90도 각도로 구부려 메쉬가 모서리에 의해 지지될 수 있도록 하고 아래에 루트 개발을 위한 충분한 공간을 남겨둡니다. 자른 메쉬 사각형을 비커에 넣고 알루미늄 호일로 덮습니다. 30분 건조 사이클을 사용하여 고압증기멸균하여 메쉬 사각형을 살균합니다.
매체가 페트리 접시에서 응고되고 메쉬가 멸균되면 구부러진 모서리가 아래를 향하도록 하여 각 메쉬 사각형을 단단한 매체 위에 놓습니다. 모서리가 매체를 관통하고 메쉬의 대부분이 매체의 상단 표면에 닿도록 메쉬를 밉니다. 다음으로, 멸균 200마이크로리터 피펫을 사용하여 개별 표면 멸균된 A 탈리아나 종자를 추출하고 각 종자를 메쉬 위에 부드럽게 옮깁니다.
식물 종과 실험적 요구 사항에 따라 간격을 두도록 씨앗을 놓습니다. 페트리 접시를 뚜껑으로 밀봉하고 접시 가장자리에 다공성 수술 테이프를 붙입니다. 씨앗을 알루미늄 호일로 싸십시오.
전체 페트리 접시를 배치하여 씨앗을 계층화합니다. 이틀 후, 섭씨 22-24도의 페트리 접시에서 씨앗을 재배하고 10-14일 동안 16시간 사진 시간을 갖습니다. 멸균된 플로우 후드에서 18ml의 오토클레이브 액체 MS 배지를 멸균 뚜껑이 있는 멸균 원통형 유리 탱크에 붓습니다.
다음으로, 멸균 집게를 사용하여 반고체 매체의 페트리 접시에서 수경법 원통형 탱크로 10-14 일 된 묘목이있는 각 메쉬 사각형을 부드럽게 옮깁니다. 여기에 표시된 묘목은 알팔파입니다. 다공성 수술 테이프를 사용하여 탱크에 뚜껑을 밀봉합니다.
그런 다음 섭씨 22-24도에서 16 시간의 사진 기간으로 묘목을 재배하고 50rpm으로 흔듭니다. 접종하기 전에 묘목이 있는 탱크에 잠재적인 오염이 있는지 주의 깊게 검사하십시오. 오염되지 않은 탱크의 매체는 깨끗하고 투명해야 합니다.
탱크가 오염으로 흐리면 폐기하고 나머지 탱크에 번호를 매기십시오. 번호가 매겨진 각 탱크에서 20마이크로리터의 수경 재배 배지를 샘플링하고 Luria 육수 또는 LB 한천을 곁들인 페트리 접시에 올려 놓습니다. 접시를 섭씨 28도에서 28시간 동안 배양합니다.
번호가 매겨진 각 수경 재배 탱크에 50 마이크로 리터의 agrobacterium tumefacians 현탁액을 즉시 접종하십시오. 묘목과 투메파시안 박테리아를 섭씨 22-24도에서 16시간 사진 시간으로 50rpm으로 흔든 상태에서 공동 재배합니다. 배양 12시간 및 28시간 후에 점박이 LB 플레이트를 검사하여 수경 재배 배지의 무균 상태를 확인합니다.
오염이 있는 경우 추가 다운스트림 분석을 위해 박테리아가 접종된 해당 번호가 매겨진 탱크를 사용하지 마십시오. 다음으로, 메쉬 플레이트를 들어 올려 박테리아 현탁액에서 뿌리를 분리합니다. 후속 분석을 위해 뿌리를 사용하는 경우 뿌리를 자르고 이중 증류수로 빠르게 헹구고 멸균된 여과지에서 건조시킵니다.
잎이나 다른 조직을 사용하는 경우 조직을 잘라냅니다. 식물 전사체 분석을 위해 뿌리 또는 싹을 즉시 액체 질소에 침착해야 합니다. 박테리아 전사체 분석의 경우, 공동 배양 탱크에서 배양액 1.5ml를 옮기고 원심분리로 세포를 펠릿화합니다.
적절한 공동 재배 후 멸균 가위를 사용하여 주 뿌리의 곁 가지 인 개별 2 차 뿌리를 분리하십시오. 그런 다음 이중 증류수로 뿌리를 헹구어 느슨하게 결합된 물질을 제거합니다. 현미경 슬라이드에 각 뿌리를 30마이크로리터의 물에 담그고 유리 커버 슬립으로 덮습니다.
커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉하여 뿌리를 탈수로부터 보호하십시오. 그런 다음 형광 현미경으로 A tumefacians가 A thaliana 뿌리에 부착되는 것을 시각화합니다. 적절한 공동 재배 후 수경 재배 매체에서 식물을 분리하십시오.
18ml의 수경 재배 매체를 0.2 미크론 공극 필터를 통해 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 통과시켜 살균합니다. 샘플을 섭씨 80도에서 밤새 얼립니다. 다음 날, 50ml 원뿔형 튜브의 뚜껑을 풀고 동결 건조기에 36시간 동안 넣습니다.
마지막으로, HPLC 분석 및 화합물 검출을 위해 샘플을 보관하거나 처리합니다. 인위적으로 공급된 영양분 없이, 투메파시안 c58은 공동 재배 시스템에서 자랐다. 대조적으로, 본질적으로 A thaliana가 없는 대조군 배양에서는 박테리아 성장이 관찰되지 않았습니다.
수경재배 공동 재배 시스템은 이 현미경 시각화에서 볼 수 있듯이 뿌리 구조에 대한 박테리아의 부착을 연구하는 데 사용할 수 있으며, PCherry red 형광 표지 박테리아는 전형적인 암석 모양 또는 필라멘트 모양의 식물 뿌리 구조에 국한되었습니다. 식물 포스트와 상호 작용하는 미생물 모두의 유전자 발현 프로파일은 QRTPCR을 통해 확인할 수 있습니다. 8시간의 공동 배양 후, 8개의 투메파시안 세포가 독성 유전자의 발현 조절을 밝혔습니다.
동시에 A thaliana의 뿌리는 공동 재배에 대한 반응으로 차별적인 유전자 발현을 나타냈습니다. 72시간의 공동 배양 후, 대조군과 비교하여 접종된 식물의 분비체에서 35개의 화합물이 향상되고 76개의 화합물이 감소했습니다. 이 기술은 연구자들이 식물과 미생물의 상호 작용을 연구하고 식물과 미생물 또는 미생물 생물 군계 파트너 간의 상호 반응 또는 자연 환경을 밀접하게 모방하는 간단한 설정에서 비생물적 요인에 대한 식물의 반응을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.
여러분과 함께 이 과정을 지켜본 후, 보다 자연스럽고 관리하기 쉬운 환경에서 분자 식물, 미생물 상호 작용 및 신호 반응을 연구하기 위해 수경재배에 식물 미생물 공동 재배 시스템을 구축할 수 있기를 바랍니다.
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이 기사는 식물과 미생물의 상호작용을 동시에 연구할 수 있는 수경 공동 배양 시스템을 소개합니다. 이 설정은 자연 환경을 모방하여 상호 신호 전달 및 분자 반응에 대한 조사를 용이하게 합니다.
This hydroponic co-cultivation system enables simultaneous and systematic analysis of plant-microbe molecular interactions under near-natural conditions, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By preserving spatial and temporal signaling homeostasis without synthetic inducers, it provides predictive confidence for target validation in plant-associated pathways. The approach facilitates translational biomarker discovery and preclinical model development for agrochemical and biostimulant R&D pipelines.
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven analysis of plant-microbe signaling before lead identification stages.