Name: 식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 배우세요 수경 공동 배양 시스템을 이용한 식물-미생물 분자 상호작용 및 신호 전달 분석 방법입니다. Arabidopsis thaliana와 Agrobacterium tumefaciens를 활용하여 자연 환경을 모방한 실험 설정에서 양방향 신호 반응을 체계적으로 연구할 수 있습니다.

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그들의 도움과 유용한 토론에 대해 Brian Weselowski와 Alexander W. Eastman에게 감사드립니다. 우리는 또한 Drs. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui, Greg Thorn의 도움을 받았고 유용한 토론과 원고를 읽었습니다. 이 연구는 농업 및 농업 식품 캐나다 (Agriculture and Agri-Food Canada), Growing Forward-AgriFlex (RBPI 번호 2555) 및 Growing Forward II 프로젝트 번호 1670의 자금 지원을 받아 작성되었습니다. 이 연구는 또한 ZC Yuan에게 수여 된 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC) 디스커버리 그랜트 RGPIN-2015-06052에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

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뿌리 분비의 점진적인 특성을 감안할 때, planta에서 생산 된 독성 유발 화학 물질의 농도와 역동적 인 식물 - 미생물 상호 작용에 미치는 영향은 공간적 및 시간적 변화에 따라 발생합니다. 이 수경 재성 공동 재배 시스템에는 미생물 독성이나 식물 방어를 유도하는 합성 식물 호르몬이나 화학 물질이 보충되지 않습니다. 대조적으로, 종래의 접근법을 사용하여, 아세토 독 온온 (acetosyringone)과 같은 합성 화학 물질의 첨가는 갑작스러운, 인위적인 농도의 스파이크를 생성한다. 따라서이 수경 공동 배양 시스템은 미생물 및 숙주 식물이 공간적 및 시간적 매너를 인식하고 반응하는 자연 환경을보다 가깝게 모방합니다. 여기에서 Agrobacterium 독성 유전자가 Arabidopsis 와의 공동 배양시에 활성화되었음을 입증 할 수 있었다. 이것은 천연 식물 유래 화학 물질이 아그로 박테 리움 독성...

식물과 관련된 미생물은 생물 지구 화학적 순환, 생물학적 복원, 기후 변화 완화, 식물 성장 및 건강, 생물학적 및 비 생물 적 스트레스에 대한 식물 내성에 중요한 역할을한다. 미생물은 식물 세포 벽 접촉을 통해 간접적으로 화학 분비 및 신호 1 , 2 , 3을 통해 식물과 상호 작용합니다. 침착성 유기체로서 식물은 병원균에 의한 감염을 막기위한 직접 및 간접적 인 기작을 개발해 왔습니다. 직접 방어에는 구조적 방어와 방어 단백질의 발현이 포함되지만 간접 방어에는 2 차 식물 대사 산물 생성 및 침입 병원체에 대항하는 유기체의 인력이 포함됩니다 4 , 5 . 식물에서 추출한 뿌리 삼출물, 분비물, 점액, 점액 및 용 해물은 rhizosphere의 물리 화학적 성질을 변화시켜 끌어들이거나 밀어 낸다.그들의 숙주에 대한 미생물 6 . 뿌리 분비물의 화학적 조성은 종 특이 적이며, 이로 인해 rhizosphere에서 이러한 화합물을 인식 할 수있는 특정 미생물을 허용하는 선택 필터 역할을합니다 6 . 따라서, 호환 가능한 미생물 종은 자극되어 식물 숙주 1 의 이익 또는 손상에 대한 그들의 결합을 활성화시키고 향상시킬 수있다. 근권에서 식물 - 미생물 상호 작용을 이해하는 것은 미생물 및 화학 물질 노출의 대부분이 뿌리 구조와 토양 - 공기 경계 2 , 6 , 7 , 8 에서 발생하기 때문에 식물 생산성과 생태계 기능을 향상시키는 데 중요합니다. 그러나 지하 식물의 미생물 상호 작용과 상호 반응에 대한 조사는 흥미롭게도<html> 복잡하고 역동적 인 성질 및 단단히 조절 가능한 성장 조건 하에서의 천연 뿌리 구조 및 식물 형태와 적합한 실험 모델의 결여. 가장 많이 연구 phytopathogens 중 하나 인 아그로 박테 리움 체리, 사과, 배, 포도를 포함한 농업과 원예 중요성, 식물의 넓은 범위를 감염, 9 상승했다. 아그로 박테리아 는 식물 - 병원체 상호 작용을 이해하는 중요한 모델 유기체이며 식물 형질 전환 및 식물 공학 10 , 11 , 12 , 13 , 14 에서 강력한 도구입니다. 분자 공장 - 아그로 박테 리움 상호 작용은 물론, 수십 년 동안 연구 및 아그로 박테 리움의 병원성의 현재 이해는 9 광범위 한F &quot;&gt; 11, 15, 16. 아그로 병원성은 대부분 17 센싱 그 독성 프로그램 및 세포 간 통신의 미세 조정의 결과, 식물 유래의 신호를 지각의 발전 능력에 소위 정수를 때문이다. 아그로 박테 리움 독성 프로그램은 rhizosphere에서 이용 가능한 몇 가지 신호에 의해 조절되며 ChvG / I 시스템과 VirA / G 시스템의 2 가지 세트로 구성된다. rhizosphere의 산성 조건은 chvG / I , virA / G 의 전사를 활성화시킨다 , virE0 , virE1 , virH1 , virH2 및 VI 형 분비 시스템 (T6SS) 18의 유전자를 포함한 Agrobacterium 병원성에 관여하는 여러 다른 유전자를 포함한다. 아세토 오손 (acetosyringone) (4&#39;- 히드 록시 -3 &#39;, 5 &#39;- 디메 톡시 아세토 페논), V인산화 신호 전달 메커니즘을 통한 irA / G 2- 성분 시스템 19 . VirA / G는 전체 vir 레 귤론을 활성화시켜 종양 유도 (Ti) 플라스미드에서 전사 핵 (T-DNA)으로 알려진 ~ 20kb의 박테리아 DNA 조각을 식물 핵 16 으로 옮기고 통합시킵니다. T-DNA는 식물 호르몬 인 indole -3-acetic acid (IAA) ( iaaM 과 iaaH )와 cytokinin ( ipt )의 합성에 관여하는 유전자를 가지고 있으며 일단 식물 세포에서 발현되면 많은 양의 식물 호르몬이 생산됩니다. 이것은 비정상적인 조직 증식과 식물 종양 발달을 일으키는데 이는 크라운 담즙병 (crown gall disease)으로 알려져 있으며 이는 식물 9 , 11 , 20 의 만성적이고 재발적인 문제입니다. IAA는 아그로 독성을 억제하거나 감소 Agrobacteriu 살리실산 및 감마 - 아미노 부티르산으로 집단적 행동<html> m 쿼럼 감지 (QS) ( 17 , 21 , 22) . 이 억압 카운터, T-DNA는 아그로 병원성을 촉진 아그로 정수 감지를 활성화하고, 또한 병원체 22, 23 영양원 역할 의견을 갖다 생합성을위한 유전자를 운반한다. 아그로 박테 리움 - 식물 간 상호 작용에 대한 전반적인 깊은 이해와 식물 숙주로의 T-DNA 전달로 인해 초기 상호 작용에서 복잡한 신호 전달 사건이 덜 잘 이해된다. 이것은 Agrobacterium -plant signaling을 조사하기위한 기존의 접근법의 한계로 인해 부분적으로 발생합니다. 식물 세포 현탁 배양 및 인공 사이트 별 상처는 일반적으로 분자 식물 - 미생물 상호 작용 (24)을 연구하는 데 사용됩니다. EF &quot;&gt; (26), (27)는 그러나, 세포 현탁액은 일반적인 식물의 형태를 부족, 특히 식물 서스펜션 세포가 미생물 화성 및 독성 (28), (29) 활성화를위한 매우 중요한 루트 구조와 뿌리 삼출물을하지 않아도 식물 형태의 유지 보수. 루트 구조는 직접 감염된 식물 조직 (30), (31)에 의한 식물 방어 관련 유전자의 검출 결과, 사이트 별 감염을 용이하게 인위적으로 상처를 입는 식물에 의해 해결되었습니다. 그러나, 인공 상처는 자연의 병원균 감염 큰 차이가 특히 상처가 자스몬 산 (JA) 축적을 유도하여 천연 식물 신호 전달 및 방어를 체계적으로 방해한다 .26 또한 합성 화학 물질은 인공적으로 식물 숙주 반응을 유도하는데 사용된다또는 병원체 독성. 란타에서의 반사 농도와 같은 화학 물질의 보충이 가능하지만, 이러한 보충 서서히 미생물 (28), (32)에 의해 감지 화성 구배를 생성 주변 근권로 루트 배설물의 확산을 고려하지 않는다. 식물 - 미생물 상호 작용, 정확성과 방해하고 제한 될 수 얻은 데이터의 깊이, 그리고 란타에서 직접 번역하지 않을 수 있습니다 기존의 접근 방식에서 생성 된 지식을 연구하는 기존의 접근 방식의 한계를 감안할 때. 식물 - 아그로 박테 리움 신호 전달의 많은 양상은 아직 완전히 이해되지 않았는데, 특히 질병 증상이 아직 나타나지 않은 초기 상호 작용 단계에서 그렇다. 종래의 접근법의 한계를 수정하기 위해,이 연구는 저렴하고, 단단히 조절 가능하며, 유연한 수경 첨가제 인 c연구원이 분자 식물 - 미생물 상호 작용의 초기 단계에서 복잡한 신호 전달 및 반응 경로에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있도록하는 시스템입니다. 수경법은 식물 영양소, 뿌리 삼출물, 성장 조건 및 식물에 금속 독성의 영향을 연구하기 위해 널리 사용되었습니다 33 , 34 . 작은 공간 요구 사항, 다양한 식물 조직의 접근 가능성, 영양 / 환경 조건의 엄격한 제어 및 해충 / 질병 통제를 포함하여 수경법 모델의 몇 가지 장점이 있습니다. 수경 시스템은 한천 / 피토 아르 (phytoagar) 도금 기술과 비교하여 식물 생장을 제한하지 않으며, 2-3 주 후에 성장을 제한합니다. 중요한 것은, 전체 공장 구조의 유지 보수는 미생물 화성 및 독성 유도 (8), (29)에 필요한 천연 루트 분비를 촉진한다. 시스템 설명여기 침대는 대안 33 , 34 보다 간단하고 노동 집약적입니다. 더 적은 부품을 사용하고 표준 가위 이외의 도구를 필요로하지 않습니다. 이 제품은 식물 성장에 대한 강력한 지지제이자 미생물 성장을 지원하기위한 흔들림을 통한 멸균 조건 하에서의 단순 통기 방법 인 금속 망 (나일론 33 과 대조적으로)을 사용합니다. 또한이 시스템은 뿌리의 너비를 제한하지 않으면 서 다양한 식물 종을 수용 할 수있는 식물 성장을 지원하기 위해 다양한 크기의 금속 망을 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 수경 공동 배양 시스템에서, 식물은 접종 된 박테리아의 성장을지지하는 유기 화합물을 식물 뿌리가 분비하는 무균 수경계에서 재배된다. 이 공동 배양 시스템에서는 식물 세포 내 호르몬, 방어력 유발 물질 또는 독성 유발 화학 물질과 같은 인공 화학 물질이 보완되지 않으며 자연 세포를 반영합니다식물 - 미생물 상호 작용 동안 신호 항상성. 이 수경 공동 배양 시스템에 의해, 동시에 유전자를 아그로 박테 리움에 의한 감염에 따라 애기 장대 골-0 뿌리 조직에서의 발현뿐만 아니라, 애기 장대와 공동 배양시 아그로 유전자의 활성을 결정할 수 있었다. 이 시스템은 아그로 박테 리움 ( Agrobacterium )과 동시 배양 (감염)시 식물 뿌리의 분비 프로파일뿐 아니라 식물 뿌리에 대한 아그로 박테 리움의 부착을 연구하는데 적합하다는 것이 추가로 증명되었다 ( 그림 1 ). <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig1.jpg" /> 그림 1 : 샘플 분석과 함께 수경 공동 배양 시스템의 개요. 식물은 메쉬 (메쉬 위의 ​​싹)의 꼭대기에서 자랍니다. 수경 재배액에 담근 다음 뿌리를 수경 재배 배지에 넣고 박테리아 f또는 공동 배양. 식물 조직과 박테리아는 동시에 추출 및 분석을 위해 분리됩니다. 이 수치는 참고 35 에서 수정되었습니다.

<table><tbody><tr><td>식물 씨앗 (Arabidopsis thaliana Col-0)</td><td>애기장대 생물 자원 센터</td><td>CS7000</td><td>https://abrc.osu.edu/order-stocks</td></tr><tr><td>박테리아 (Agrobacterium tumefaciens C58)</td><td>워싱턴 대학교</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>라벨링 박테리아</td><td>사내</td><td></td><td>선택 사항, 다운 스트림 분석</td></tr><tr><td>소용돌이</td> <td>(다양한)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에 따라 다름마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>(다양한)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>(다양한)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% 차아염소산나트륨</td><td>(다양한)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이중 증류수</td><td>(다양한)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>오토클레이</td><td>브(다양한)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫&nbsp;</td><td>(각)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄</td><td>올(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>무라시게와 스쿠그(MS) 기저염</td><td>시그마-알드리치</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B5 비타민 믹스</td><td>시그마-알드리치</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>피토아가르</td><td>(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>깊은 Petri 접시</td> <td>(다양한)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>스테인레스 스틸 메쉬</td><td>Ferrier Wire Goods Company Ltd</td><td>N/A</td><td>등급: 304; 메쉬 수: 40 &times; 40; 와이어 DIA: 0.01</td></tr><tr><td>micropore tape, 1"</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>일주일 성장 챔버</td><td>(다양한)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원통형 유리 탱크, 100 &times; 80 mm&nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>3250</td><td>다른 크기를 사용할 수 있으며, 이 경우 액체 함량 조절이 필요할 수 있습니다</td></tr>.유량 <tr><td>후드</td><td>(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>셉트</td><td>(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진탕 인큐베이터</td><td>(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>셰이커</td><td>(각종)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>(각종)</td><td></td><td>옵션, 다운스트림 분석에 따라 다름</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>(각)</td><td></td><td>옵션, 다운스트림에 따라 다름 </td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 및 커버 슬립</td> 분석<td>(다양함)</td><td></td><td>선택 사항, 다운스트림 분석에 따라 다름</td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>(다양함)</td><td></td><td>선택 사항, 다운스트림 분석에 따라 다름</td></tr><tr><td>박테리아 RNA 추출 키트</td><td>(다양함)</td><td></td><td>선택 사항, 다운스트림 분석에 따라 다름</td></tr><tr><td>식물 RNA 추출 키트(RNeasy Plant Mini Kit)</td><td>Qiagen</td><td>74903 또는 74904</td><td>선택 사항, 다운스트림 분석에 따라</td></tr><tr><td>다름 qRT-PCR용 재료 및 장비</td> <td>선택(다양함),</td><td></td> <td>다운스트림 분석</td></tr><tr><td>재료 및 마이크로어레이 분석을 위한 장비에</td> 따라 다름<td>(다양함),</td><td></td> <td>다운스트림 분석에 따라</td></tr><tr><td>다름 액체 질소</td><td>(다양함)</td><td></td> <td>선택 사항, 다운스트림 분석</td></tr><tr><td>모르타르 및 유봉</td><td>(각종)</td>에 따라 다름<td></td><td>선택 사항, 다운스트림 분석</td></tr><tr><td>0.2 &micro에 따라 다름; m 기공 필터</td><td>(다양)</td><td></td><td>옵션, 다운스트림 분석에 따라 다름</td></tr><tr><td>50mL 코니컬 튜브</td><td>(다양)</td><td></td><td>옵션, 다운스트림 분석에 따라 다름</td></tr><tr><td>동결 건조기</td><td>(다양)</td><td></td><td>옵션, 다운스트림 분석에 따라 다름</td></tr><tr><td>밀봉 가능한 시험관</td><td>(다양)</td><td></td><td>옵션, 다운스트림 분석에 따라 다름</td></tr><tr><td>에틸 아세테이트</td><td>(각종)</td><td></td><td>선택 사항, 다운스트림 분석에 따라 다름</td></tr><tr><td>질소 가스</td><td>(다양한)</td><td></td> <td>옵션, 다운스트림 분석</td></tr><tr><td>재료 및 장비에 따라 HPLC(</td><td>다양한)</td><td></td> <td>옵션, 다운스트림 분석</td></tr><tr><td>재료 및 장비에 따라 ESI-TOF-MS</td><td>용</td><td></td> 재료 및 장비 <td>선택, 다운스트림 분석에 따라 다름</td></tr></tbody></table>

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

복잡한 식물 - 미생물 신호 처리 과정을 묘사하기 위해서는 자연 식물 - 미생물 상호 작용을 모방 한 실험 설계가 매우 중요합니다. 애기 장대 - Agrobacterium tumefaciens 박테리아의 병인 및 식물 상호 작용을 연구하기위한 우수한 모델 시스템을 제공합니다. 식물 - 아그로 박테 리움 상호 작용에 대한 이전의 연구는 주로 식물 세포 현탁 배양, 식물의 인공 상처 또는 합성 화학 물질에 의한 미생물 독성 인자 또는 식물 방제 의 인공 유도에 크게 의존해왔다. 그러나 이러한 방법은 식물과 미생물이 공간적, 시간적 방식으로인지하고 반응하는 식물의 자연 신호 와 구별된다. 이 작품은 손상되지 않은 식물이 금속 메쉬 스크린에 의해지지되고 아그로 박테 리움 과 함께 배양되는 수경 공동 배양 시스템을 제시합니다. 이 공동 배양 시스템에서, 합성 피토 호르몬 또는 micr을 유도하는 화학 물질obial 독성 또는 식물 방어는 보충된다. hydroponic cocultivation 시스템 은 planta의 자연 식물 - 미생물 상호 작용 및 신호 항상성과 매우 유사합니다. 식물 뿌리는 아그로 박테 리움을 함유하는 배지로부터 분리 될 수 있고, 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물의 신호 및 반응은 동시에 체계적으로 조사 될 수있다. 특정 시점 / 간격에서, 식물 조직 또는 박테리아는 다양한 &quot;omics&quot;분석을 위해 별도로 수확 될 수있어이 시스템의 효능과 효과를 입증합니다. 수경 공동 배양 시스템은 1) 다양한 식물 미생물 시스템의 상호 신호 전달, 2) 식물 숙주와 여러 미생물 종 ( 예 : 미생물 협회 또는 미생물) 간의 신호 전달, 3) 영양소와 화학 물질의 관련성 연구 4) 미생물이 식물 숙주와 어떻게 상호 작용하고 생물학적 인 o에 대한 식물 내성에 기여하는지r 비 생물 적 스트레스.

수경 재배 동시 재배 시스템의 성장 A. tumefaciens C58의 성장 곡선은 초기 16 시간의 동시 배양에서 유의 한 지연 단계를 나타내었고, A. thaliana Col-0과 공동 재배 할 때 매우 안정한 성장을 보였으며, 최대 OD 600 은 48 h postinoculation. 대조적으로 A. thaliana가 없는 대조 배양에서는 본질적으로 박테리아 성장이 관찰되지 않았다 ( 그림 4 ). 이러한 결과는 인위적으로 공급되는 추가 영양소없이 식물 뿌리 분비 화합물이 수경법 공동 배양 시스템에서 아그로 박테 리움 성장을 지원할 수 있음을 시사한다. 공동 배양의 초기 16 시간 동안의 유의 한 지연 단계는 병원체와의 공...

기술 된 수경 공동 배양 시스템은 금속 메쉬 스크린이있는 온전한 식물을지지하고 박테리아와 함께 배양한다. 식물 조직, 박테리아 및 분비 된 분자는 하류 분석을 위해 따로 따로 수확 할 수 있으며 동시에 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물 또는 미생물의 분자 반응을 조사 할 수 있습니다.

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

이 시스템의 전반적인 목표는 자연 환경을 밀접하게 모방한 단순한 실험 설정에서 식물과 미생물 파트너 간의 상호 신호 전달 상호작용 및 반응, 또는 화학 물질이나 비생물적 요인에 대한 식물의 반응을 연구하는 것입니다. 이 비디오에서는 식물을 Agrobacterium tumefaciens 박테리아와 공동 배양하는 과정을 보여줍니다. 이 방법은 식물의 미생물 상호작용, 미생물 또는 식물의 스트레스 반응, 그리고 식물과 미생물 상호작용의 초기 단계에서 발생하는 복잡한 신호 전달을 포함한 분자 신호 전달의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 자연 환경을 모사한 단순한 설정 내에서 식물의 미생물 상호작용에 따른 신호 전달과 반응의 특성을 이해하는 데 도움이 된다는 점입니다. 이 방법은 단일 미생물 종과 식물의 상호작용에 대한 통찰을 제공하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 여러 미생물 종 또는 비생물적 요인과 식물의 상호작용을 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다. 저희는 자연 상황을 밀접하게 모사한 식물-미생물 상호작용 중 세포 신호 전달 항상성을 탐구하던 중 이 방법의 아이디어를 얻게 되었습니다.실험을 시작하려면 종자를 멸균해야 합니다. Arabidopsis thaliana의 경우, 약 200개의 종자를 500 µL의 탈이온수와 함께 마이크로 원심분리 튜브에 넣고, 튜브를 고속으로 볼텍싱합니다. 탁상용 마이크로 원심분리기를 사용하여 튜브를 9000 x g에서 30초 동안 원심분리합니다.피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 다음으로, 씨앗에 2% sodium hypochlorite 300 µL를 첨가하고 볼텍싱합니다. 혼합물을 실온에서 방치합니다.1분 후, 종자를 원심 분리합니다. 피펫을 사용하여 차아염소산나트륨 용액을 제거합니다. 그런 다음 종자에 500 µL의 멸균 탈이온수를 첨가하고, 혼합물을 볼텍싱합니다.튜브를 원심 분리한 후, 물을 제거합니다. 종자에 70% ethanol 500 microliters를 첨가하고 혼합물을 볼텍싱합니다. 종자가 가라앉을 때까지 1분간 기다린 후, 튜브를 원심 분리합니다.피펫을 사용하여 70% ethanol을 제거합니다. 500 µL의 멸균 탈이온수로 종자를 5회 세척합니다. 그 후, 멸균된 초순수 500 µL에 멸균된 종자를 다시 현탁합니다.멸균된 깊은 페트리 접시에 0.4% phyto agar가 포함된 1/2 농도의 Murashige and Skoog 또는 MS 배지 25 milliliters를 각각 붓습니다. 각 페트리 접시에 맞게 90 millimeter x 90 millimeter 크기의 스테인리스 스틸 메쉬 정사각형 조각을 자릅니다. 메쉬가 페트리 접시 내부에 들어맞도록 각 정사각형 메쉬의 모서리를 살짝 구부립니다.메시의 본체와 90도 각도가 되도록 모서리를 구부려, 메시가 모서리에 의해 지지되도록 함으로써 뿌리 발달을 위한 하단 공간을 충분히 확보합니다. 절단된 메시 사각형들을 비커에 넣고 알루미늄 호일로 덮습니다. 30분 건조 사이클의 오토클레이브를 사용하여 메시 사각형들을 멸균합니다.페트리 접시의 배지가 고체화되고 메시가 멸균되면, 굽은 모서리가 아래로 향하도록 하여 각 메시 사각형을 고체 배지 위에 놓습니다. 메시를 눌러 모서리가 배지에 박히고 메시의 대부분이 배지의 상단 표면에 닿게 합니다. 다음으로, 멸균된 200 µL 피펫을 사용하여 표면 멸균된 개별 A thaliana 종자를 빨아들여 각 종자를 메시 위에 조심스럽게 옮깁니다.식물 종과 실험 요구 사항에 맞춰 간격을 두어 종자를 배치합니다. 페트리 접시의 뚜껑을 닫아 밀봉하고 접시 가장자리를 다공성 수술용 테이프로 감쌉니다. 종자를 알루미늄 호일로 감쌉니다.페트리 접시 전체를 배치하여 종자를 층상처리합니다. 2일 후, 페트리 접시의 종자를 22~24°C 온도와 16시간의 광주기 조건에서 10~14일 동안 배양합니다. 멸균된 클린벤치 내에서, 멸균된 뚜껑이 있는 멸균 원통형 유리 탱크에 고압증기멸균된 액체 MS 배지 18 mL를 붓습니다.다음으로, 멸균 핀셋을 사용하여 10~14일 된 묘소가 포함된 각 메쉬 사각형을 반고체 배지가 담긴 페트리 접시에서 수경 재배용 원통형 탱크로 조심스럽게 옮깁니다. 여기에 표시된 묘소는 알파파(alfalfa)입니다. 다공성 수술용 테이프를 사용하여 탱크 뚜껑을 밀봉합니다.그 다음, 22~24°C에서 16시간의 광주기를 유지하고 50 rpm으로 진탕하며 유묘를 배양합니다. 접종 전, 유묘가 들어 있는 탱크에 오염 가능성이 있는지 주의 깊게 확인하십시오. 오염되지 않은 탱크의 배지는 맑고 투명해야 합니다.수조가 오염되어 탁해진 경우, 해당 수조는 폐기하고 나머지 수조에 번호를 매깁니다. 번호가 매겨진 각 수조에서 수경 재배 배지 20 µL를 채취하여 Luria broth 또는 LB agar가 담긴 페트리 접시에 점적합니다. 접시를 28 °C에서 28시간 동안 배양합니다.각 번호가 매겨진 수경 재배 탱크에 Agrobacterium tumefacians 현탁액 50 µL를 즉시 접종합니다. 유묘와 A. tumefacians 균을 22~24 °C에서 16시간 광주기와 50 rpm의 진탕 조건으로 공동 배양합니다. 배양 12시간 및 28시간 후에 도말된 LB 플레이트를 검사하여 수경 재배 배지의 무균 상태를 확인합니다.오염이 발생한 경우, 박테리아가 접종된 해당 번호의 탱크는 이후의 하위 분석에 사용하지 마십시오. 다음으로, 메쉬 플레이트를 들어 올려 박테리아 현탁액에서 뿌리를 분리합니다. 후속 분석을 위해 뿌리를 사용할 경우, 뿌리를 절단하고 2중 증류수로 빠르게 헹군 뒤 멸균된 여과지 위에서 건조시키십시오.잎이나 다른 조직을 사용하는 경우, 해당 조직을 절단합니다. 식물 전사체 분석을 위해서는 뿌리 또는 줄기를 즉시 액체 질소에 넣어야 합니다. 박테리아 전사체 분석을 위해서는 공동 배양 탱크에서 1.5 milliliters의 배양액을 옮긴 후 원심분리를 통해 세포를 펠렛화합니다.적절한 공동 배양 후, 멸균 가위를 사용하여 주근의 측면 분지인 개별 측근을 분리합니다. 다음으로, 느슨하게 결합된 물질을 제거하기 위해 증류수로 뿌리를 헹굽니다. 각 뿌리를 현미경 슬라이드 위의 30 µL 물에 잠기게 한 뒤, 유리 커버 글라스로 덮습니다.뿌리가 건조해지는 것을 방지하기 위해 매니큐어로 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 그런 다음 형광 현미경을 통해 A thaliana 뿌리에 A tumefacians가 부착된 것을 관찰합니다. 적절한 공동 배양이 끝난 후, 식물을 수경 재배 배지에서 분리합니다.0.2 micron 공극 필터를 통해 18 milliliters의 수경 재배 배지를 50 milliliter 원심 분리관(conical tube)에 옮겨 멸균합니다. 샘플을 80 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 동결합니다. 다음 날, 50 milliliter 원심 분리관의 캡을 느슨하게 닫고 동결 건조기에 넣어 36시간 동안 건조합니다.마지막으로, HPLC 분석 및 화합물 검출을 위해 샘플을 저장하거나 처리합니다. 인위적으로 공급된 영양분이 없는 상태에서도 co-cultivation 시스템에서 A tumefacians c58이 성장했습니다. 반면, A thaliana가 없는 대조군 배양에서는 박테리아 성장이 거의 관찰되지 않았습니다.수경 재배 공배양 시스템은 이 현미경 시각화 영상에서 볼 수 있듯이 박테리아가 뿌리 구조에 부착되는 현상을 연구하는 데 사용할 수 있으며, 여기서 PCherry 적색 형광 표지 박테리아가 전형적인 암석 모양 또는 실 모양으로 식물 뿌리 구조에 국한되어 나타납니다. 식물 숙주와 상호작용하는 미생물 모두의 유전자 발현 프로파일은 QRTPCR을 통해 확인할 수 있습니다. 8시간의 공배양 후, 8개의 tumefacians 세포에서 병원성 유전자의 발현 상향 조절이 확인되었습니다.동시에, A thaliana의 뿌리는 공동 배양에 반응하여 차별적인 유전자 발현을 보였습니다. 공동 배양 72시간 후, 접종된 식물의 분비체(secretome)에서는 대조군과 비교하여 35개의 화합물이 증가하고 76개의 화합물이 감소했습니다. 이 기술은 연구자들이 식물-미생물 상호작용을 연구하고, 식물과 미생물 또는 미생물 군집 파트너 간의 상호 반응이나 비생물적 요인에 대한 식물의 반응을 자연 환경과 매우 유사한 간단한 설정에서 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.본 영상을 시청하신 후, 보다 자연스럽고 관리 가능한 환경에서 식물과 미생물의 상호작용 및 신호 응답을 연구하기 위해 수경 재배 기반의 식물-미생물 공동 배양 시스템을 구축하실 수 있기를 바랍니다.

a-hydroponic-co-cultivation-system-for-simultaneous-systematic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Nathoo, N., et al. 식물/미생물 분자 상호 작용 및 신호 전달의 동시 및 체계적 분석을 위한 수경 공동 재배 시스템. J. Vis. 경험. (2017).이 비디오는 멸균 조건에서 식물-박테리아 상호 작용을 연구하기 위한 수경 공동 재배 시스템을 보여줍니다. 식물 묘목은 멸균된 산성 성장 배지로 옮겨져 배양되고 Agrobacterium을 접종하기 전에 오염 여부를 검사합니다. 활성화된 박테리아는 식물 뿌리에 부착되어 T-DNA를 식물 세포로 전달하며 박테리아 집락화를 강화하는 분자 변화를 촉진합니다.

식물 숙주와 상호 작용하는 박테리아의 분자 반응을 연구하기 위한 공동 배양 시스템

박테리아는 그들의 이웃들 미생물의 생리학에 영향을 미칠 가능성이 분비되는 화합물을 생성. 여기에서 우리는 고체 미디어의 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 형광 전사 기자 균주와 토양 미생물을 혼합하여 화학적으로 매개 종간의 상호 작용을 검출 할 수있는 공 배양 화면을 설명합니다.

화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여

여기에서는 식물 영양 연구를 위한 성공적인 수경재배 시스템을 구축하기 위한 따라하기 쉬운 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 애기장대에서 광범위하게 테스트되었으며 특정 영양 요구 사항 또는 식물 성장 및 발달에 대한 비필수 요소의 영향을 연구하기 위해 다른 식물 종에 쉽게 적용할 수 있습니다.

수경법, • 다목적 시스템은 유해 요소에 영양소 가용성 및 노출에 영양 할당 및 플랜트 응답을 공부하기

이 문서는 생태계 식물 및 높게 통제 된 실험실 조건에서 식물-미생물 상호작용 연구를 활성화 하는 장치 (EcoFABs)의 제조에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

식물-미생물 상호작용 연구 위한 실험실 생태계의 건설에 대 한 생태계 제조 (EcoFAB) 프로토콜

간단 하 고, 다재 다능 한, 고 저가 생체 외에서 수경 시스템 성공적으로, 메 마른 조건 하에서 대규모 실험을 수 있도록 최적화 되었다. 이 시스템 솔루션 및 분자, 생화학, 생리 적 연구에 대 한 뿌리에 의해 그들의 효율적인 흡수 화학 물질의 응용 프로그램을 지원합니다.

유연한 저비용 수경 시스템 살 균 조건에서 작은 분자에 식물 응답을 평가 하기 위한

여기에서 우리는 종의 존재를 정량화하고 식물 뿌리의 초기 식민지 동안 다른 성장 환경으로의 전송 후 박테리아의 공간 분포를 시각화하는 수경 식물 성장 분석방법을 설명합니다.

부동 수경 시스템에서 애기장대 뿌리에 세균 식민지화 및 유지 보수 모니터링

이 프로토콜에 제시된 공동 문화 상호 작용 분석은 저렴하고 높은 처리량이며 간단합니다. 이 계산은 공동 배양에 있는 미생물 상호 작용을 관찰하고, 상호 작용 패턴을 확인하고, 인간과 환경 병원체에 대하여 관심있는 미생물 긴장의 억제 잠재력을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다.

미생물 상호 작용의 조사를 위한 높은 처리량 공동 문화 애세서

이 프로토콜은 식물 뿌리에 토양 매개 미생물을 접종하는 전략에 대한 자세한 요약을 제공합니다. 진균 Verticillium longisporum 및 Verticillium dahliae에 대해 예시된 세 가지 상이한 뿌리 감염 시스템이 기술된다. 잠재적 응용 분야와 가능한 다운스트림 분석이 강조되고 각 시스템에 대한 장단점이 논의됩니다.

식물 뿌리를 토양 매개 미생물로 감염시키는 접종 전략

우리는 미생물이 있든 없든 계통발생학적으로 구별되는 다양한 식물의 성장을 지원하는 유리 기반의 반수경재배 실험 시스템에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 성장 배지와 호환되며 다운스트림 분석을 위한 비파괴 뿌리 삼출물 샘플링을 허용합니다.

Semihydroponic Root 삼출물 프로파일링을 위한 다용도 Glass Jar 시스템

이 프로토콜은 MISS 세포(Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System)를 사용하여 미생물 단클론 분리, 배양 및 피킹을 수행하는 방법을 설명합니다. MISS cell은 액적 미세유체 기술을 기반으로 하는 통합 워크플로우를 달성하며, 이는 우수한 액적 단분산성, 높은 병렬 배양 및 고처리량 바이오매스 검출을 제공합니다.

Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System을 사용한 자동화된 High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking

배우세요 수경 공동 배양 시스템을 이용한 식물-미생물 분자 상호작용 및 신호 전달 분석 방법입니다. Arabidopsis thaliana와 Agrobacterium tumefaciens를 활용하여 자연 환경을 모방한 실험 설정에서 양방향 신호 반응을 체계적으로 연구할 수 있습니다.

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템

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