생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

이 원고는 체 외에 난 재배 방법을 라이브 셀 이미징 애기 zygotes 및 배아의 수를 설명 합니다. 이 메서드는 zygote 분극 동안 세포내 역학 및 배아 개발 세포 운명 명세를 시각화 하기 위해 이용 된다.

이 절차의 전반적인 목표는 애기장대(Arabidopsis), 접합자(gygote) 및 배아(embryos)의 생세포 이미징을 가능하게 하여 배발생의 역학을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 접합자 비대칭 및 배아 형태학이 어떻게 생성되는지에 대한 식물 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 zygote polarization 및 embryo patterning의 살아있는 역학을 추적할 수 있다는 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 마이크로필러 장치와 배주를 사용한 준비는 텍스트만으로는 설명하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. PDMS 마이크로필러 어레이 장치를 준비하려면 먼저 35mm 유리 바닥 접시에 맞도록 장치를 자르고 측면당 15분 동안 자외선에 한 번 노출되어 장치의 상단과 하단을 살균합니다. 모든 면이 멸균되면 PDMS 장치를 새 35mm 배양 접시에 옮기고 장치가 완전히 잠길 때까지 접시에 5-7ml의 새 N5T 배지를 추가합니다.

그런 다음 접시를 진공 챔버에 넣고 장치의 모든 공기가 매체로 교체될 때까지 장치를 진공 상태로 두고 압력을 줄입니다. 장치의 가스가 제거되면 사각 팁 핀셋을 사용하여 종이 타월 조각으로 장치를 두드려 측면과 바닥에서 여분의 매체를 제거합니다. 그런 다음 장치를 76 x 26mm 슬라이드 유리에 놓고 35mm 배양 접시 뚜껑으로 덮어 장치의 수분을 유지합니다.

해부를 시작하기 전에 0.40mm 게이지 바늘과 가는 핀셋에 70% 에탄올을 넣어 소독합니다. 다음으로, 실험에 적합한 규송을 선택할 수 있도록 식물의 꽃차례를 확인하십시오. 약 5mm의 실리크에는 접합자가 포함되어 있고 8-10mm의 실리크에는 어린 구상 배아가 포함되어 있습니다.

핀셋을 사용하여 3-4개의 관심 실리크를 76 x 26mm 슬라이드 유리의 양면 테이프 조각에 옮깁니다. 그런 다음 슬라이드를 실체 현미경으로 옮기고 바늘과 핀셋을 사용하여 난소 벽을 엽니다. 열린 실리크를 PDMS 장치의 마이크로필러 어레이로 옮기고 배주를 배지로 방출합니다.

그런 다음 18 x 18mm 커버 유리를 장치에 놓고 난자를 마이크로필러 어레이의 공간으로 밀어 넣습니다. 배주가 제자리에 있으면 핀셋이나 손가락을 사용하여 덮개 유리를 장치에서 수평으로 당겨 여분의 매체를 제거하고 장치를 새 35mm 유리 바닥 접시에 거꾸로 놓습니다. 사각 핀셋의 끝을 사용하여 장치를 접시 바닥에 살짝 누르고 장치가 완전히 잠길 때까지 새 N5T 매체를 접시에 붓습니다.

그런 다음 파라필름으로 접시를 밀봉합니다. 배주의 타임 랩스 이미징을 위해 접시를 도립 현미경의 스테이지로 옮기고 마커 형광을 사용하여 이미징을 위한 배주를 선택합니다. 최적의 배주를 찾았으면 제조업체의 권장 사항에 따라 샘플을 라이브 이미징하기 시작합니다.

이 배주 배양 시스템을 통해 zygote polarization 및 embryo patterning의 살아있는 역학을 추적할 수 있습니다. 예를 들어, 여기에서 미세소관이 횡 고리로 축적 된 후 방추체로 형성되는 것을 관찰 할 수 있습니다. 그런 다음 배아 세포는 4분기로 분열하여 방사상 대칭의 구형 모양을 형성합니다.

그러나 액틴 중합 억제제로 배양된 배주를 처리하면 극성 핵 이동을 억제하여 접합체의 보다 대칭적인 분열을 초래하고 접합자 편광에서 액틴 필라멘트의 역할을 제안합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 배아 패터닝에서 세포 간 통신의 역할에 대한 추가 질문에 답하기 위해 레이저 파괴를 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 배발생 중 긴밀한 이벤트를 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.