Name: 생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: 배우세요 Arabidopsis thaliana 수정란과 배아의 생체 세포 이미징 방법을 통해 식물 발생 과정의 세포 역학을 관찰하는 기술입니다. 이 방법은 수정란 극성화와 배아 패턴 형성의 생동감 있는 역학을 추적하여 식물 발달 생물학의 핵심 질문에 답할 수 있습니다.

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이 작품에서 현미경에서 연구소의 Transformative 바이오-분자 (WPI-ITbM) 나고야 대학의 실시 되었고 일본 고급 식물 과학 네트워크에 의해 지원. 이 작품 과학의 승진을 위한 일본 사회와 일본 과학 및 기술 기관 (ERATO 프로젝트 남 M.U.)에서 교부 금에 의해 지원 되었다: 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (번호. JP24113514, JP26113710, JP15H05962, 및 M.U., 및 개에 대 한 JP15H05955. JP16H06465, JP16H06464 및 JP16K21727 T.H에 대 한), (B, Nos 젊은 과학자에 대 한 특정. JP24770045 및 M.U.에 대 한 JP26840093), 그리고 도전적인 탐구 연구 (제에 대 한 특정 M.U.에 대 한 JP16K14753)입니다.

1. 준비 체 외에 난 배양의 <ol><li>확인 생체 외에서 난 문화에 대 한 액체 매체 (&#34; N5T 매체 &#34;) 1 x Nitsch 기초 소금 혼합물, 5% (w/v) 트 레 할 로스가 수화물, 0.05 포함 하 % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic 산 (MES)-코 (pH 5.8), 및 1 x Gamborg &#39; s 비타민 솔루션.</li>
	<li>코와 5.8에 pH를 조정.</li>
	<li>압력가 마로 소독 하 여 매체 소독 (121 ° C, 20 분) 또는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링. 
	참고: 소독된 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 2-3 개월.</li>
</ol> 2. PDMS Micropillar 배열 장치 준비 <ol><li>PDMS micropillar 장치 칼, 면도날 또는 35 m m 유리 하단 접시의 유리 부분 (14 m m φ)에 맞게가 위로 잘라. 
	참고: 이전 논문 8 , 9, PDMS 장치 건설의 전체 절차를 설명 하 고 여기에 세부 사항을 생략 됩니다 따라서. 4 잘 또는 96 잘 접시와 같은 더 작은 양으로 유리 하단 요리 단기 이미징 장치 없이 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>Sterilize 15 분의 자외선 아래 PDMS 장치 상단의</li>
	<li>평방 팁 핀셋을 사용 하 여 의해 PDMS 장치 그리고 15 분 하단 소독 빛 자외선 아래 계속.</li>
	<li>35mm 문화 접시에 멸 균된 PDMS 장치를 전송 하 고 장치는 완전히 매체 (대략 5-7 mL)에 젖 었 때까지 N5T 매체를 추가.</li>
	<li>진공 챔버에 접시를 넣어 고 드에 압력을 감소 시키기. 유지 장치에 공중 매체에 의해 대체 될 때까지 하룻밤에 3 h에 대 한 진공 청소기. 
	참고: 장치는 강한 진공에서 공기 방울에 의해 분리 될 수 있다.</li>
	<li>장치 요리에서 평방 팁 핀셋으로 잡고 고 측면과 하단에 추가 매체를 제거 하는 종이 타월에 넣어. 
	참고:이 난 재배에 사용 될 것입니다 micropillar 배열 (상부 표면)에 매체를 제거 하지 합니다.</li>
	<li>76 x 26 mm 슬라이드 유리, micropillar 부분 위쪽으로 계속 보장에 장치 전송 하 고 다음 난 추출 하는 동안 밖으로 건조에서 매체를 방지 하기 위해 35mm 문화 접시 뚜껑 장치 커버.</li>
</ol> 3. Silique 절 개 및 난 추출 <ol><li>70% 에탄올으로 닦아 하 여 바늘 (0.40 m m G) 및 정밀한 족집게를 소독. 바늘 주사기 또는 나무 막대기에 부착 하 여 쉽게 처리 됩니다.</li>
	<li>식물의 꽃이 핌을 확인 하 고 실험에 대 한 적절 한 siliques를 선택 합니다. 약 5 m m siliques 포함 zygotes, 그리고 젊은 구형 배아를 포함 하는 8-10 m m siliques.</li>
	<li>핀셋를 사용 하 여는 siliques를 소비 세와 76 x 26 mm 슬라이드 유리에 양면 테이프에 그들을 배치. 에 대 한 포함 한 silique 40-60 ovules, 그리고 3-4 siliques (즉, 120-240 ovules)는 한 장치에 대 한 충분 한.</li>
	<li>멸 균된 바늘과는 stereomicroscope에서 핀셋을 사용 하 여 내부 ovules를 볼 수 silique (난소 벽)를 엽니다. ovules 손상 되지만 난소 벽 컷.</li>
	<li>(2.7 단계에서 준비), PDMS 장치에 열린된 silique N5T 매체에 전송 눌렀다가 ovules 매체에 바늘 또는 핀셋.</li>
	<li>Micropillar 배열에 공간에는 ovules을 PDMS 장치에 작은 덮개 유리 (18 x 18 mm)을 넣어.</li>
	<li>가로 추가 매체를 제거 하려면 사용 하 여 핀셋 또는 손가락을 당겨 덮개 유리를 벗고.</li>
	<li>PDMS 장치를 뒤집어서, 35 m m 유리 하단 접시에 배치 하 고 약간 유리에 붙어 스퀘어 팁 핀셋을 사용 하 여 추진 하 여 장치를 누릅니다.</li>
	<li>유리 바닥으로 부드럽게 부 어 N5T 매체 PDMS 장치는 완전히 매체에 배어 때까지 중간 병 decanting 여 접시와 파라핀 영화와 함께 접시를 봉인. 
	참고: PDMS 장치 재활용 될 수 있지만 너무 오래 된 장치는 쉽게 유리 바닥에서 분리. 또한, 장치 단계 2.5에서에서 완전히 degassed 하지은 또는 매체는 너무 빨리 부 어 떠 있습니다.</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" /> 그림 2: 샘플 준비에 대 한 도식 절차. 
이 도식 흐름 단계 3.5 4.1에 해당합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
 4. 시간 경과 영상 <ol><li>는 거꾸로 한 현미경에 3.9 단계에서 준비 된 유리 하단 접시를 놓고 고에 초점에 적합 한 ovules를 선택 합니다. 
	참고: 단계, 위치 및 방향에는 ovules 다르므로 적당 한 ovules 발견 한다 그들의 표식 형광을 확인 하 여.</li>
	<li>제조 업체에 따라 라이브 이미징 시작 &#39; 현미경 시스템의 s 지시. 
	참고: 현미경 장비와 매개 변수는, 다양 하 고 따라서 사용자 실험 목적에 맞는 적절 한 설정을 선택 해야 합니다. 예를 들어,이 원고에 사용 되는 설정을 표 1에 나열 됩니다.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>장비/설정</td> <td>그림 3 (A) 및 추가 비디오 1과 4</td> <td> 그림 3 (B) 및 추가 비디오 2</td> <td>보충 비디오 3</td></tr> <tr><td>현미경</td> <td>레이저 스캔 현미경 (A1R MP) 거꾸로</td> <td>회전 디스크 confocal 거꾸로 현미경 (CSU-W1)</td> <td> 상자 형 반전 confocal 현미경 시스템 안정 인큐베이션 챔버 (CV1000)</td></tr> <tr><td>레이저</td> <td>Ti:sapphire 펨 펄스 레이저</td> <td>488-561-nm 및 LD 레이저</td> <td>488-561-nm 및 LD 레이저</td></tr> <tr><td>O bjective 렌즈</td> <td>물 침수 렌즈 X 40 (나 = 1.15) 침수 매체와</td> <td>실리콘 기름 침수 렌즈 X 60 (나 = 1.30), 압 전 초점 드라이브에 탑재 된</td> <td>40 X 렌즈 (나 = 0.95)</td></tr> <tr><td>검색 또는</td> <td>외부 descanned 비 GaAsP PMT 검출기</td> <td>EMCCD 카메라</td> <td>EMCCD 카메라</td></tr> <tr><td>Dichroic 거울</td> <td>DM495 및 DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>필터</td> < td > 대역 통과 필터; 534/30 nm 및 578/105 nm</td> <td>대역 통과 필터, 520/35, 및 593/46 nm</td> <td>대역 통과 필터, 520/50 nm와 617/73 nm</td></tr> <tr><td>z 축 따라 슬라이스</td> <td>1 µ m 간격으로 31 z-스택</td> <td>17 z-스택 3 µ m와 인터 벌 스</td> <td>7 z-5 µ m 간격으로 스택</td></tr> <tr><td>시간 간격</td> <td>20 분</td> <td>5 분</td> <td>10 분</td></tr></tbody></table> 표 1:는 현미경 시스템 및이 원고에 사용 된 설정을. 
현미경 및 매개 변수는 다양 한, 그리고 따라서 각 사용자는 실험에 적합 한 시스템을 선택 해야 합니다.
<ol start="3"> <li>획득된 한 이미지 시퀀스를 확인 하 고.avi 또는.mov 프레 젠 테이 션에 대 한 같은 일반적인 동영상 포맷 변환. 
	참고: 현미경 소프트웨어는 동영상 포맷으로 이미지 출력 수 없습니다, 경우.tif로 이미지를 저장 하 여 다음 ImageJ, 오픈 소스 프로그램 NIH 이미지 파일 형식을 변경 하 여 영감된에서 그들을 엽니다. ImageJ에서 제공 됩니다: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ Z-s를 만들기 위해 사용할 수 있습니다.에 설명 된 대로 최대 강도 프로젝션, 같은 영화를 감싸 다: https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol><li>Natesh, S., Rau, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatesh%2C+S+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).</li>
<li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li>
<li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+%28Oryza+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li>
<li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004970000063">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li>
<li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00497-004-0233-9">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li>
<li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li>
<li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li>
<li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li>
<li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400513011015">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li>
<li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li>
<li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li>
<li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 원고는 간단한 체 외에 난 재배 하는 프로토콜 zygotes와 배아 개발의 라이브 셀 이미징에 사용 하기 위해 효율적인 소개 합니다.
PDMS 장치 디자인은 배아 단계에 따라 최적화를 할 수 있습니다. 첫 번째 개발된 장치 microcage 배열 방향을 조정 하 고 수정 ovules9의 위치를 그리고 다음 micropillar 장치 ovules를 보다 효율적으로 함정을 건설 되었다8. 또한,는 micropillars 얇고는 microcage 보다 되며 따라서 장기적인 관찰 하는 동안 난 확장을 방지 하지 않습니다. 이 micropillar 장치는 배아 심장 단계8까지 zygotic 단계에서 몇 일 동안 한 난을 저장할 수 있습니다. 그러나 궁극적으로,, 완전히 확장된 난의 높이 micropillar 높이 초과 하면 고 따라서 멀리 장...

체의 기본적인 몸 계획 단 세포 접합 자에서 개발 한다. 대부분 꽃 식물, zygotic 사업부는 꼭대기와 촬영 및 루트, 각각1로 발전 하는 기저 세포를 생성 합니다. 따라서, embryogenesis, 동안 식물 몸은 형성 하는 방법을 이해 하는 것이 중요 하다 하지만 그들은 꽃에서 깊은 곳에서 개발 하기 때문에 직접 생활 zygotes 및 배아의 역학을 관찰 하는 효과적인 도구가 되지 않았습니다. 옥수수, 쌀, 등 여러 monocot 종, 체 외에서 수정 방법 설립된2,3되었습니다. 이 방법에서는, 고립 된 정자 및 난 자 세포 융합 하는 전기적 또는 화학적으로, 그리고 생성 된 셀 비옥한 식물으로 개발할 수 있습니다. 그러나, dicot 식물, 체 외에서 수정 방법 남성과 여성 gametes4,5의 세포 주기 비 동기화 상태 때문에 아마도 적절 한 배아를 생산할 수 있다. 또한, 태아를 둘러싼 조직 (endosperm) 배아 개발6에 중요 한 역할을 담당합니다.
모델 dicot 종, A. thaliana, 생체 외에서 재배 방법 배아와 endosperm7포함 전체 난에 초점을 맞춤 으로써 개발 되었다. 이 시스템은 성공적으로 embryogenesis에 다양 한 화학 시 약의 효과 분석 하는 데 사용 됩니다 하지만 낮은 생존 율을가지고 있기 때문에 시간 경과 영상에 적합 하지 않습니다. 따라서, 소설 체 외에 난 재배 시스템 접합 자 단계도 일찍 시작 하 고 높은 비율8에 비옥한 식물 생산 개발 되었다. 다양 한 실험 후 그 니 매체 발견 이었고, 트 레 할 로스는 크게 ovules8의 생존 율을 개선. 또한, 때문에 난 그것은 성장 하 고 따라서 현미경의 관측 분야에서 자주 이동 확장, PDMS 장치 매체9에 난을 해결 하기 위해 개발 되었다. PDMS 장치는 심장-단계 배아에는 접합 자에서 개발을 추적 하기에 충분 한 3-4 일에 대 한 장기적인 이미지를 사용할 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 그것은 된다 zygote 양극 화와 패턴, 뿐만 아니라 정상적인 조건 하에서 하지만 또한 화학 억제제 존재 또는 다양 한 돌연변이 배경8,10에서에서 배아의 역학을 시각화 수 ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
그림 1: 특정 형광 마커 난 통해 배아 Zygotes 시각화 하는 데 사용의 회로도. 애기 zygote 꽃 깊숙한 생성 되는 난에 배아로 발전 한다. 이 체 외에서 배양 시스템, zygote 및 태아는 난을 통해 관찰 하 고 따라서 다른 난 조직에 표시 되지 않는 특정 형광 마커를 사용 하는 것이 중요 하다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Nitsch 기초 소금 혼합물</td><td>Duchefa</td><td>N0223</td><td></td></tr><tr><td>트레할로스 이수화물</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>206-18455</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg' s 비타민 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>Matsunami 유리</td><td>D111300</td><td></td></tr><tr><td>35mm 문화 접시</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>76 &times; 26 mm 슬라이드 유리</td><td>Matsunami 유리</td><td>S1225</td><td></td></tr><tr><td>18 &times; 18 mm 슬라이드 유리</td><td>Matsunami 유리</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>바늘 (게이지 0.40 mm)</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>침수 매체 Immersol W 2010</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>A1R MP</td><td>Nikon</td><td>A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>맞춤형 장비이므로 카탈로그 번호는 사용할 수 없습니다.</td></tr><tr><td>CV1000</td><td>요코가와 전기</td><td>CV1000-SP84</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

대부분의 현 화 식물에 어머니 조직에 깊이 숨겨진 zygote과 태아 하 고 따라서 그것은 오래. 개발 방법의 신비 예를 들어는 zygote 몸 축 설정 하에서 어떻게 하 고 어떻게 태아 장기 형성 동안 다양 한 세포 운명을 지정 합니다. 이 원고는 체 외에 난 문화 메서드를를 라이브 셀 이미징 zygotes과 애기 thaliana의 배아 개발에 대해 설명 합니다. 최적화 된 재배 매체 zygotes 또는 초기 배아 비옥한 식물에 성장 수 있습니다. Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar 배열 장치와 함께 그것을 결합 하 여는 난 같은 위치에 액체 매체에서 개최 됩니다. 이 기정은 늦은 배아 단계에 zygotic 부문에서 몇 일 동안 관찰 하는 현미경 같은 난 중요 합니다. 결과 라이브 셀 이미징 핵 이동 및 골격 재배열, 및 또한 세포 분열 타이밍 및 배아 패턴화 하는 동안 세포 운명 명세와 같은 접합 자 분극의 실시간 역학을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 배아 개발, 다양 한 요인의 영향을 분석할 억제제 치료와 레이저-셀 통신의 역할을 검토 중단 등 광학 조작이 난 재배 시스템에 결합할 수 있습니다.

이 난 재배 시스템을 사용 하 여이 메서드는 zygote 분극 및 모방 하는 태아의 생활 역학을 추적할 수 있습니다. 이 때문에 이전 zygote와 배아, 어머니 조직에 깊이 숨겨져 있는 실시간 동작을 시각화 하 아무 기술 성과 이다. 그림 3A 와 보조 비디오 1 젊은 zygote에서 microtubules (MTs) subapical 지역10가로 링 축적 보여준다. 이 산 반지는 zygote elongates 꼭대기 방향에 하는 동안 유지 됩니다. Zygote 신장 및 꼭대기 지역에 핵 마이그레이션 완료 후 산 반지 사라진다 고는 MTs 형성 DNA를 분리 하는 스핀 들. 그림 3B 와 보조 비디오 2 배아 세포 전할 radially 대칭 구형 모양<sup c...

이 원고는 체 외에 난 재배 방법을 라이브 셀 이미징 애기 zygotes 및 배아의 수를 설명 합니다. 이 메서드는 zygote 분극 동안 세포내 역학 및 배아 개발 세포 운명 명세를 시각화 하기 위해 이용 된다.

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 Arabidopsis 접합자와 배아의 실시간 세포 이미징을 통해 배아 발생의 역동성을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 접합자의 비대칭성과 배아의 형태가 어떻게 생성되는지에 대한 식물 발달 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 접합자 극성과 배아 패턴 형성의 살아있는 역동성을 추적할 수 있다는 점입니다.마이크로필러 장치와 배주머니를 이용한 준비 과정은 텍스트만으로는 설명하기 어려우므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. PDMS 마이크로필러 어레이 장치를 준비하려면, 먼저 장치를 35mm 유리 바닥 배양 접시에 맞게 절단하고, 장치의 상단과 하단 양면을 각각 15분 동안 UV 라이트로 조사하여 멸균합니다. 모든 면의 멸균이 완료되면, PDMS 장치를 새로운 35mm 배양 접시로 옮기고 장치가 완전히 잠길 때까지 신선한 N5T 배지 5~7mL를 접시에 추가합니다.그 다음 디쉬를 진공 챔버에 넣고 압력을 낮추어, 장치 내의 모든 공기가 배지로 교체될 때까지 진공 상태로 둡니다. 장치의 탈기가 완료되면, 사각형 팁 핀셋을 사용하여 장치를 종이 타월에 가볍게 눌러 측면과 바닥의 과잉 배지를 제거합니다. 그런 다음 장치를 76 by 26 mm 슬라이드 글라스 위에 놓고 35 mm 배양 디쉬 뚜껑으로 덮어 장치의 수분을 유지합니다.해부를 시작하기 전, 0.40 밀리미터 게이지 바늘과 미세 핀셋을 70% 에탄올로 멸균하십시오. 다음으로, 실험에 적합한 장각(siliques)을 선택할 수 있도록 식물의 꽃차례를 확인하십시오. 약 5 밀리미터 길이의 장각에는 접합자가 포함되어 있으며, 8에서 10 밀리미터 길이의 장각에는 어린 구형 배가 포함되어 있습니다.핀셋을 사용하여 관심 있는 실리크(siliques) 3~4개를 76 by 26 밀리미터 슬라이드 글라스 위의 양면 테이프로 옮깁니다. 그런 다음 슬라이드를 실체 현미경 아래로 옮기고, 바늘과 핀셋을 사용하여 씨방벽을 엽니다. 열린 실리크를 PDMS 장치의 마이크로필러 어레이 위로 옮겨 배지로 배주(ovules)를 방출시킵니다.그런 다음 18 by 18 밀리미터 커버 글라스를 장치 위에 놓아 배주가 마이크로필러 어레이의 공간 속으로 밀려 들어가게 합니다. 배주가 제자리에 위치하면, 핀셋이나 손가락을 사용하여 커버 글라스를 장치에서 수평으로 당겨 제거하여 과잉 배지를 제거하고, 장치를 거꾸로 뒤집어 새로운 35 밀리미터 글라스 바텀 디쉬에 넣습니다. 사각 핀셋의 끝을 사용하여 장치를 디쉬 바닥 쪽으로 살짝 누르고, 장치가 완전히 잠길 때까지 신선한 N5T 배지를 디쉬에 붓습니다.그 다음, 파라필름으로 배양 접시를 밀봉합니다. 배주(ovules)의 타임랩스 이미징을 위해, 배양 접시를 도립 현미경의 스테이지 위로 옮기고 마커 형광을 이용하여 이미징할 배주를 선택합니다. 최적의 배주가 확인되면, 제조사의 권장 사항에 따라 샘플의 라이브 이미징을 시작합니다.이 배주 배양 시스템을 통해 접합자 극성 형성 및 배아 패턴 형성의 생생한 역동성을 추적할 수 있습니다. 예를 들어, 여기서는 미세소관이 횡단 고리 형태로 축적된 후 방추사로 형성되는 과정을 관찰할 수 있습니다. 이후 배아 세포는 4분할하며 분열하여 방사형 대칭의 구형 구조를 형성합니다.그러나 배양된 밑씨를 액틴 중합 억제제로 처리하면 극핵의 이동이 억제되어 접합자의 분할이 더 대칭적으로 일어나며, 이는 접합체 극성 형성에서 액틴 필라멘트의 역할을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차 이후에 레이저 파괴를 수행하여 배아 패턴 형성에 있어 세포 간 통신의 역할에 관한 추가적인 의문을 해결할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 배아 발생 과정 중의 밀집된 사건들을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

in-vitro-ovule-cultivation-for-live-cell-imaging-zygote-polarization

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 stomatal 차별화를 문서화, 개발 며칠 동안 표피의 공 촛점 이미징을위한 식물 cotyledons를 고정하기 위해 챔버 슬라이드 및 미디어를 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 형광 태그 단백질은 세포 분열과 세포 형 차별화 중에 가능한 역할의 이해를 증가 표현과 subcellular 지방화에 의해 동적으로 추적 할 수 있습니다.

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

우리의 개발 초기 단계에서 배아를 분리하는 효율적이고 간단한...

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

우리는 면역 염색, 형광 제자리 교잡, 전체 마운트 애기 장대 난자의 양적, 고해상도 이미징 다음 DNA 염색 여기를 효율적이고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 성공적 염색질 변형 및 핵 구조를 분석하는데 사용 하였다.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

목표는 콩과 식물이 아닌 애기장대 모델을 보완하기 위해 초기 식물 배아 발생의 조절을 조사하는 데 모델 콩과 식물 Medicago truncatula를 쉽게 사용할 수 있음을 설명하는 것입니다. 포드 형태학은 접합 배발생 단계와 관련이 있으며 조직 배양을 사용하여 배아를 수집하는 프로토콜도 제공됩니다.

모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜<em&gt; Medicago truncatula</em

이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

우리는 epifluorescence 현미경을 사용하여 애기장대 이중 수정에 있는 정액 핵 형태에 근거하여 성공또는 실패한 수정을 결정하는 방법을 보여줍니다.

애기장의 정자 핵 형태를 추적하여 수정 상태의 평가 이중 수정

여기에서 우리는 난자의 수용성을 증가시키는 Arabidopsis thaliana에서 꽃가루 튜브 안내 및 수신을 관찰하기 위한 SIV(semi-in vitro) 방법의 개선을 설명합니다. 고처리량 SIV 겸 중격 방법은 배우자 마커 라인 및 유전적으로 인코딩된 바이오센서와 결합하여 수정의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.

Arabidopsis 꽃가루관 수용 및 이중 수정의 실시간 이미징 semi-In vitro cum septum 방법을 사용한

감수 분열 전기 동안의 염색체 이동은 포자 형성의 기본이 되는 잘 이해되지 않는 현상입니다. 이 프로토콜은 애기장대 탈리아나 수컷 감수 모수세포에서 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임을 획득, 분석 및 정량화하는 방법을 설명합니다.

애기장대 의 수컷 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임의 라이브 이미징 특성화

이 기사는 T 세포 자손의 생성, 표현형 및 수의 동역학을 분석하여 흉선 침전 전구 세포를 특성화하는 생체 내 및 시험관 내 방법론에 대해 설명합니다.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

배우세요 Arabidopsis thaliana 수정란과 배아의 생체 세포 이미징 방법을 통해 식물 발생 과정의 세포 역학을 관찰하는 기술입니다. 이 방법은 수정란 극성화와 배아 패턴 형성의 생동감 있는 역학을 추적하여 식물 발달 생물학의 핵심 질문에 답할 수 있습니다.

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

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