Name: 제대혈 유래 다 능성 줄기 세포로부터 연골 형성 펠렛 형성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 배우세요 제대혈 유래 iPSC에서 연골 형성 펠렛을 생성하는 방법을. 이 기술은 대량 생산과 질병 모델링, 약물 스크리닝에 활용되어 재생의학 연구에 기여합니다.

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이 연구는 보건 복지 가족부 한국 보건 의료 기술 연구 개발 사업 (HI16C2177)의 지원을 받아 수행되었다.

이 프로토콜은 한국 가톨릭 대학교의 기관 검토위원회 (KC12TISI0861)의 승인을 받았습니다. 리 프로그래밍에 사용 된 CBMC는 서울 성모 병원의 코드 혈액 은행에서 직접 입수했습니다. 1. iPSC와의 연동 분화 <ol><li> CBMC-iPSC 세대 <ol><li> 이전 연구에서 보여준 프로토콜을 사용하여 CBMC-hiPSCs를 생성하십시오. </li><li> 혈액 세포를 15 ML 원뿔 튜브에 수집하고 hemocytometer를 사용하여 그들을 계산합니다. </li><li> 3 x 10 5 세포를 준비하고 515 xg 및 RT에서 5 분간 원심 분리하십시오. 흡인으로 상등액을 버리고 혈액 세포 매체 0.5 ML에 세포를 resuspend. </li><li> 세포를 비 코팅 24- 웰 플레이트의 웰에 옮기고 제조자의 권고에 따라 센다이 바이러스 혼합물을 첨가한다. </li><li> 1,150 xg 및 30 ° C에서 30 분 동안 플레이트를 원심 분리하십시오. </li><li> 후미원심 분리기, 37 ° C에서 5 % CO 2 에서 밤새 세포를 배양하십시오. </li><li> 다음날, 형질 도입 된 세포를 매트릭스로 코팅 된 웰로 옮긴다. 30 ℃에서 30 분 동안 1,150 xg에서 플레이트를 원심 분리하십시오. </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 제거하고, iPSC 배지 1 mL를 첨가하고, 37 ℃에서 5 % CO2에서 세포 O / N을 유지한다. </li><li> 첨부 된 세포를 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 유지하십시오. 매일 매체를 교체하고 신선한 iPSC 매체로 교체하십시오. 참고 : 식민지는 형질 도입 후 14-21 일에 나타납니다. </li></ol></li><li> EB 세대 <ol><li> 37 ° C와 5 % CO 2 에서 hiPSC를 유지하십시오. 매일 매체를 교체하여 신선한 Essential 8 (E8) 매체로 교체하십시오. </li><li> E8 배지에서 vitronectin 코팅, 100mm 접시에 2 x 10 6 hiPSCs를 준비합니다. </li><li> 배양 접시에서 E8 매체를 제거하고 멸균 인산 버퍼 식염수 (PBS)로 씻으십시오. </li><li> 1 추가mL의 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)에 넣고 2 분 동안 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 배양한다. </li><li> 세포를 E8 배지 3 mL로 수확하고 새로운 15-mL 원뿔 튜브로 옮긴다. 2 분 동안 실온 (RT)에서 250 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음 E8 매체 5 ML에있는 세포를 resuspend. </li><li> hemocytometer를 사용하여 셀을 계산하고 각 100mm 페트리 접시 2 X 10 6 세포를 준비합니다. 10 μM ρ 관련 키나제 (록) 억제제와 E8 및 EB 매체 (1 : 1)의 10 ML 혼합물에 준비 세포를 Resuspend. </li><li> 37 ° C와 5 % CO 2 에서 응집에 대한 세포 O / N를 품어. </li><li> 다음 날, pipetting하여 집계 된 EB를 수확합니다. 1 분 250 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는를 제거하고 10 ML의 신선한 E8 매체에 EBs를 resuspend. </li><li> 생성 된 EB를 5 일 동안 확대하여 일일 변경을 fres로 수행합니다.h E8 배지. 더 성숙을 위해, E7 매체로 문화 매체를 변경합니다. 새 E7 배지로 매일 중간 배지를 수행하여 37 ℃ 및 5 % CO2에서 EB를 5 일 동안 유지한다. 참고 : E7 배지는 FGF2가없는 E8 배지입니다. </li></ol></li><li> EBs로부터의 증식 세포 유도 <ol><li> 100 mm 접시에 1 % 젤라틴 6 ML을 추가하고 37에서 품어 ° C와 30 분 5 % CO 2 . </li><li> 사용하기 전에 젤라틴을 제거하고 2-3 시간 동안 완전히 건조시킵니다. </li><li> EB를 50 mL 원뿔 튜브로 옮긴다. EB가 원추형 튜브의 바닥에 고정되도록하십시오. EB를 방해하지 않고 뜨는 제거. </li><li> 20 % 태아 소 혈청 (FBS)과 Dulbecco의 수정 이글의 매체 (DMEM) 10 ML에 EBs Resuspend. EB를 젤라틴 코팅 100mm 접시에 옮깁니다. 10 μM ROCK 억제제를 첨가하십시오. </li><li> 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 7 일 동안 세포를 인큐베이션하고 유지한다. 나를 바꾸어 라.ROCK 억제제를 첨가하지 않고 매일 격렬히 닦으십시오. </li></ol></li><li> 연골 형성 펠릿 형성 <ol><li> 접시에서 문화 매체를 대기음과 PBS로 세 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 1 MM EDTA 1 ML을 적용하고 2 분 37 ° C와 5 % CO 2 에서 품어. </li><li> 20 % FBS와 DMEM 5 ML을 사용하여 세포를 수확하고 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송. </li><li> 250 XG와 RT에서 2 분 동안 세포를 원심 분리기. 뜨는을 버리고 20 % FBS와 DMEM 10 ML에 펠렛을 resuspend. </li><li> 40 μm 셀 스트레이너를 사용하여 셀 덩어리를 걸러 내고 버리고 단일 세포를 수거하십시오. hemocytometer를 사용하여 단일 세포를 센다. </li><li> 250 XG와 RT에서 2 분 동안 세포를 원심 분리기. chondrogenic 차별화 매체 (CDM) 300 μL와 15 ML 원추형 튜브에 펠렛 당 상등 및 종자 3 X 10 5 세포를 제거합니다. </li><li> 펠렛 형성을 위해 5 분 동안 세포를 원심 분리하십시오.680 xg 및 RT. 참고 : 펠렛은 연골 펠렛의 분화 동안 15 ML 원뿔 튜브에서 유지됩니다. </li><li> 37 밤새 세포를 품어 ° C 5 % CO 2 . </li><li> 2-3 일마다 CDM을 변경하십시오. 3 일 이내에, 펠렛은 평평하고 회전 타원체 형태를 나타낼 것이다. 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 21 일 동안 알약을 유지하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 염색에 의한 연골 형성 펠렛 특성 <ol><li> 연골 형성 매립 <ol><li> 묻기 전에 58 ° C에서 파라핀을 준비하고 녹여주십시오. </li><li> 1.5 ML 튜브에서 RT에서 2 H 4 % paraformaldehyde의 1 ML에 알약을 수정. 주의 : 파라 포름 알데히드는 매우 독성이 있습니다. 눈, 피부 또는 점막과의 접촉을 피하십시오. 그것을 준비하는 동안 노출을 최소화하고 흡입을 피하십시오. </li><li> 카세트에 거즈 한 층을 놓고 피펫을 사용하여 고정 된 알약을 옮깁니다. 접을 때 펠렛을 덮는다.e 거즈를 잡고 카세트 뚜껑을 닫으십시오. </li><li> 70 % 에탄올 (EtOH) 100 mL에서 탈수를 2 회, 각각 10 분간 개시한다. 80 % 및 95 % EtOH에서 순차적 10 분 세척을 통해 펠렛을 탈수시킨다. </li><li> 펠렛을 10 분 동안 100 % EtOH로 옮긴다. 신선한 EtOH로 3 회 반복한다. </li><li> &quot;제거&quot;를 위해 용액을 EtOH와 크실렌의 100 mL, 1 : 1 혼합물에 교환 한 후 EtOH와 크실렌의 1 : 2 혼합물을 각각 10 분 동안 교환하십시오. 펠릿을 100 % 크실렌 (각 10 분)에 두 번 배양하여 남은 EtOH를 제거합니다. </li><li> 파라핀 침투 들어, 연속 자일 렌과 파라핀 혼합물에 알약을 품어. 58 ° C에서 전체 파라핀 침투 과정을 수행하십시오. 쥐똥을 자일 렌과 파라핀의 2 : 1 혼합물 100mL에 30 분 동안 품어 둔다. </li><li> 100 mL의 크실렌과 파라핀의 1 : 1 혼합물에 대한 용액을 교환하고 30 분 동안 항온 처리한다. </li><li> 자일 렌과 파라핀의 1 : 2 혼합물 100mL에 대한 용액을 교환하고 30 분. </li><li> 최종 침투 들어, 펠렛을 100 % 파라핀의 첫 목욕에 전송하고 2 시간 품어. </li><li> 펠렛을 100 % 파라핀의 두 번째 목욕에 옮기고 58 ° C에서 O / N을 배양합니다. </li><li> 다음날, 족집게를 사용하여 펠릿을 몰드에 부드럽게 옮긴다. 파라핀 디스펜서에서 파라핀을 몰드에 첨가하십시오. 4 ° C에서 30 분 동안 파라핀을 고형화하십시오. </li><li> 섹션을 7 μm로 슬라이스하고 섹션을 슬라이드로 옮깁니다. 슬라이드를 하룻밤 건조시키고 사용 준비가 될 때까지 실온에서 슬라이드를 보관하십시오. </li></ol></li><li> 슬라이드 준비 <ol><li> 100 %, 90 %, 80 % 및 70 % EtOH를 각각 5 분 동안 순차적으로 이동시켜 슬라이드를 탈 파라핀 화시킵니다. </li><li> 유리 항아리에 슬라이드를 놓고 5 분 동안 수돗물로 헹굽니다. </li></ol></li><li> 알 시안 블루 염색 <ol><li> 30 분 동안 1 % alcian 블루 솔루션 50 ML에 슬라이드를 품어. 아니E : 알 시안 블루를 3 % 아세트산 용액으로 희석한다. 아세트산을 사용하여 pH를 2.5로 조정한다. </li><li> 슬라이드를 유리 병에 넣고 2 분 동안 수돗물로 헹굽니다. </li><li> 탈 이온수 (DW)에서 슬라이드를 헹구고 2 분 동안 핵 고속 적색 용액으로 대조 염색합니다. </li><li> 유리 병에 슬라이드를 놓고 1 분 동안 수돗물로 헹굽니다. </li><li> 2.3.5) 단계 2.6에서 슬라이드를 탈수 및 마운트합니다. </li></ol></li><li> 톨루이딘 블루 염색 <ol><li> 슬라이드를 50 mL의 톨루이딘 블루 용액에서 4 분 동안 인큐베이션한다. </li><li> 유리 항아리에 슬라이드를 놓고 5 분 동안 수돗물로 헹굽니다. </li><li> 단계 2.6에서 슬라이드를 탈수 및 마운트하십시오. </li></ol></li><li> 면역 조직 화학 염색 <ol><li> 내생 peroxidase 차단을 위해 15 분 동안 3 % H 2 O 2 에서 슬라이드를 품어. </li><li> 트리스 부에 1 : 100 희석 한 1 차 항체 (anti-COL1A1과 -COL2A1) 200 μL를가한다.슬라이드에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 정상 염소 혈청 (NGS) 5 %를 함유 한 생리 식염수 (TBS)를 접종하고 4 ℃에서 O / N을 배양한다. </li><li> 다음날, 슬라이드를 유리 병에 넣고 0.1 % 폴리 소르 베이트 20 (TBST)이 함유 된 TBS 50 mL로 5 분씩 각각 3 회 씻어냅니다. </li><li> 2 차 항체 (염소 항 토끼 IgG 항체 200 μL를 1 % BSA 및 5 % NGS를 포함하는 TBS에서 1 : 200으로 희석)를 슬라이드에 가하고 40 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 유리 항아리에 슬라이드를 놓고 각각 5 분 50 ML 3 번 그들을 씻으십시오. </li><li> 신호 증폭 들어, 슬라이드에 HRP - 복합 streptavidin 솔루션을 적용하고 10 분 동안 품어. </li><li> 유리 항아리에 슬라이드를 놓고 각각 5 분 50 ML 3 번 그들을 씻으십시오. </li><li> DAB - peroxidase 기판 솔루션을 섞어 각 슬라이드에 솔루션의 200 μL를 적용하고 1 분 동안 품어. </li><li> 유리 항아리에 슬라이드를 놓고 5 분 동안 수돗물로 헹굽니다. </li><li> 대항균Mayer의 hematoxylin과 1 분간 접촉시켰다. </li><li> DW로 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 단계 2.6에서 슬라이드를 탈수 및 마운트하십시오. </li></ol></li><li> 탈수 및 장착 <ol><li> 슬라이드를 70 %, 80 %, 90 % 및 100 % EtOH (각각 30 초) 100mL를 통해 순차적으로 이동시켜 탈수합니다. </li><li> 슬라이드를 각각 1 분 동안 두 번의 크실렌 변화로 담그십시오. </li><li> coverslips에 장착 솔루션 50 μL를 추가하고 상단에 슬라이드를 놓으십시오. </li></ol></li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜은 CBMC로부터 hiPSCs를 성공적으로 생성했습니다. 야마나카 요인을 포함하는 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 CBMCs를 hiPSCs로 재 프로그램 화했다. 세 가지 경우가 분화에 사용되었으며, 모든 실험은 성공적으로이 프로토콜을 사용하여 연골 펠릿을 생성했습니다. 많은 연구에 의해 hiPSC가 연골 세포로 분화되는 프로토콜이보고되었다 25 , 26 , 27 , 28 . 그러나 CBMC-hiPSCs의 연골 재생 및 회복 후보 물질의 사용을 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요하다. 연골 형성은 다양한 체세포 유형 11 , 25 <s...

hiPSC의 사용은 약물 스크리닝 및 다양한 질병에 대한 기계 론적 연구를위한 새로운 전략을 대표합니다. 재생산 관점에서, hiPSC는 또한 관절 연골 1,2 와 같은 치유력이 제한적인 손상된 조직의 대체를위한 잠재적 인 원천입니다. 네이티브 관절 연골의 재생은 수십 년 동안 도전 과제였습니다. 관절 연골은 부드럽고 하얀 조직으로 뼈의 끝 부분을 덮어 마찰로부터 보호합니다. 그러나 손상시 재생 능력이 제한되어있어자가 수리가 거의 불가능합니다. 따라서 연골 재생에 초점을 맞춘 연구가 수십 년 동안 진행되어왔다. 이전에, 연골 세포 계통으로의 시험 관내 분화는 보통 무릎 관절로부터 분리 된 BMSC 또는 천연 연골 세포로 수행되었다. 원인o 연골 세포의 잠재력, BMSC 및 천연 연골 세포는 연골 형성에서의 사용을 지원하는 많은 장점을 가지고있다. 그러나, 제한된 팽창 및 불안정한 표현형 때문에, 이들 세포는 관절 연골 결손의 재건에 몇 가지 한계점에 직면한다. 시험 관내 배양 조건 하에서,이 세포들은 3-4 계대 후 자신의 특성을 잃어 버리는 경향이 있으며, 결과적으로 분화 능력에 영향을 미친다. 또한, 천연 연골 세포의 경우, 이들 세포를 수득 할 때 무릎 관절에 부가적인 손상이 불가피하다. BMSC 또는 천연 연골 세포와는 달리, hiPSC 는 시험 관내에서 무한히 확장 될 수있다. 적절한 배양 조건에서, hiPSC는 연골 분화의 대체 원으로서의 큰 가능성을 가지고있다. 그러나 hiPSCs 5 의 본질적인 특성을 변경하는 것은 어렵습니다. 또한, 그것은 몇 가지 복잡한 in vitro steps는 특정 세포 유형으로 hiPSCs의 운명을 지시합니다. 이러한 합병증에도 불구하고, 높은 자체 재생 능력과 chondrocytes 6 을 포함하여 표적화 된 세포로 분화 할 수있는 능력 때문에 hiPSCs의 사용이 권장됩니다. 연골 세포 분화는 일반적으로 펠렛 배양 또는 마이크로 럼 배양과 같은 3 차원 배양 시스템을 사용하여 MSC 유사 전구 세포를 사용하여 수행됩니다. hiPSCs를 사용하는 경우 MSC 유사 전구 세포를 생성하는 프로토콜은 기존 프로토콜과 다릅니다. 일부 그룹에서는 표현형을 MSC 유사 세포로 직접 변환하기 위해 hiPSC의 단일 층 배양액을 사용합니다. 그러나 대부분의 연구에서는 EBs를 사용하여 MSCs 8 , 9 , 10 , 11 과 유사한 세포를 생성합니다. 다양한 형태의 성장 인자가 chondroge 유도에 사용됩니다.네 시스. 일반적으로, BMP 및 TGFβ 계열 단백질은 단독으로 또는 조합하여 사용됩니다. GDF5, FGF2, IGF1 12,13,14,15와 같은 다른 인자들도 분화가 유도되었다. TGFβ1은 MSCs 16 에서 용량 의존적으로 연골 형성을 자극하는 것으로 나타났다. 다른 isotype, TGFβ3와 비교하여, TGFβ1은 연골 전엽 간질 농축을 증가시킴으로써 연골 형성을 유도한다. TGFβ3은 간엽 세포 증식을 유의 적으로 증가시킴으로써 연골 형성을 유도한다. 그러나 TGFβ3은 TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 보다 연구자들에 더 자주 사용된다. BMP2는 인간의 연골 기질 성분과 관련된 유전자 발현을 증가시킨다체외 조건 하에서 관절 연골 세포 20 . BMP2는 TGFβ 단백질 21 과 함께 MSCs에서 연골 형성에 중요한 유전자의 발현을 증가시킵니다. 또한 BMP2가 Smad와 MAPK 경로를 통해 TGFβ3의 효과를 상승적으로 향상 시킨다는 것이 밝혀졌다. 이 연구에서, CBMC-hiPSCs는 낮은 부착 배양 접시에서 EB 배지를 사용하여 EB로 응집되었다. EBs를 젤라틴 코팅 접시에 부착시킴으로써 외생 세포를 유도 하였다. outgrowth 세포를 이용한 연골 세포 분화는 pellet 배양으로 수행 하였다. BMP2와 TGFβ3 모두의 치료는 성공적으로 연축 성 펠렛 형성을 위해 세포를 응축시키고 세포 외 기질 (ECM) 단백질 축적을 유도했다. 이 연구는 CBMC-hiPSCs를 사용하여 간단하지만 효율적인 연골 세포 분화 프로토콜을 제안합니다.

<table><tbody><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Dish</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 일회용 피펫</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 일회용 피펫</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Description</td></tr><tr><td>E8 Medium Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>E8 매체 (500 mL)</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>E8 매체 (Conc.: 543 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>나트륨 셀레나이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>S5261</td><td>E8 중간&nbsp; (농도: 14ng/mL)</td></tr><tr><td>인간 Transfferin</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T3705</td><td>E8 매체 (Conc.: 10.7 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>기본 FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>E8 중간&nbsp; (농도: 100ng/mL)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>E8 Medium (Conc.: 20 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>인간 TGF&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 중간 (Conc.: 2 ng/mL)</td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A8960</td><td>E8 중간&nbsp; (Conc.: 64 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>설명</td></tr><tr><td>Quality Control Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Cover Glass</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알디히드</td><td>Tech & 혁신</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>벡터 랩</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 항체</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4 항체</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 anti-mouse IgG (H+L) 항체</td><td>Molecular Probe</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) 항체</td><td>Molecular Probe</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>분자 프로브</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>연장 금 퇴색 방지 시약</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알디히드</td><td>기술 및 혁신</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>벡터 랩</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>안티콜라겐 II 항체</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>알시안 블루</td><td>시그마 알드리치</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>패스트 그린 FCF</td><td>시그마 알드리치</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>사프라닌 O</td><td>시그마 알드리치</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>핵 빠른 빨간색</td><td>Americanmastertech</td><td>STNFR100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>자일렌</td><td>덕산</td><td>115&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>덕산</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>메이어의 헤마톡실린 용액</td><td>wako pure chemical industries</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 유리, 코팅</td><td>현일 Labmate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마 Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA 합성 키트</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td> 설명</td></tr><tr><td>Chondrogenic Differentiation Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>연골 생성 매체 성분 (500 mL)</td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>연골 형성 매체 성분 (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>연골 생성 매체 성분 (Conc.: 64 &mu; g/mL)&nbsp;</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>연골 생성 매체 성분 (농도 : 100 mM)</td></tr> <tr><td>rhBMP-2</td><td>R & D</td><td>355-BM-050</td><td>연골 생성 매체 성분 (Conc. : 100 ng / ml)</td></tr> <tr><td>재조합 Hman TGF-beta3</td><td>R & D</td><td>243-B3-002</td><td>연골 생성 매체 구성 요소 (Conc.:10 ng/ml)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>연골 생성 매체 성분 (합성: 1%)</td></tr><tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD</td><td>354352</td><td>연골 형성 매체 성분 (합성: 1%)</td></tr><tr><td>Dexamethasone-Water Soluble&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>연골 생성 매체 성분 (Conc.:10-7 M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>연골 생성 매체 성분 (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>나트륨 피루브산 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td>연골 생성 매체 성분 (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>L-프롤린</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>연골 생성 매체 구성 요소(40 &mu; g/ml)</td></tr></tbody></table>

제대혈 유래 다 능성 줄기 세포로부터 연골 형성 펠렛 형성

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

인간 관절 연골 자체를 복구하는 능력이 부족합니다. 따라서 연골 퇴행은 치유 적 치료가 아니라 보존 적 치료로 치료됩니다. 현재, 생체 외 팽창 된 연골 세포 또는 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 (BMSC)로 손상된 연골을 재생시키기위한 노력이 진행되고있다. 그러나, 이들 세포의 생존력 및 불안정성이 제한적이어서 연골 재건에 대한 적용이 제한적이다. 인간 유도 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs) 재생 응용 프로그램에 대한 새로운 대안으로 과학적 관심을 받았다. 무제한자가 재생 능력과 다 기능성을 가진 hiPSCs는 연골 수리를위한 새로운 대체 세포원으로 주목 받았다. 그러나 고품질의 연질 펠릿을 대량으로 얻는 것은 임상 적용에 중요한 과제입니다. 이 연구에서 우리는 연쇄상 구별을 위해 배아 체 (EB) 유래 증식 세포를 사용했다. 성공적인 연골 형성은 PCR 및알 시안 블루, 톨루이딘 블루, 콜라겐 타입 I 및 II에 대한 항체 (각각 COL1A1 및 COL2A1)로 염색 하였다. 우리는 제대혈 단핵 세포 유래 iPSCs (CBMC-hiPSCs)를 연골 알약으로 분화시키는 방법을 상세히 제시한다.

이 연구에서, 우리는 EBs에서 번식 세포를 유도하여 CBMC - hiPSCs에서 연골 펠렛을 생성했습니다. 연골 형성 분화는 CBMC-hiPSCs를 사용하여 유도되었다. 우리의 프로토콜의 간단한 구성이 그림 1A 에 나와 있습니다. 분화하기 전에 iPSC 콜로니가 확장되었습니다 ( 그림 1B ). 확장 된 iPSCs는 EB로 분화를 시작하기 위해 조립되었습니다 ( 그림 1C ). 생성 된 EBs는 젤라틴 코팅 접시에 첨부되어 ( 그림 1D ) outgrowth 세포를 유도했다. 그런 다음, 성장 세포를 수확하여 연골 성 펠릿을 생성시켰다. 분화 21 일 후 작고 구슬 모양의 연골 형성 펠렛을 얻어 더 특...

여기, 우리는 제대혈 단핵 세포 유래 인간 유도 pluripotent 줄기 세포에서 연골 분화에 대한 프로토콜을 제안합니다.

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

이 절차의 전반적인 목표는 제대혈 유래 유도만능줄기세포로부터 연골 형성 펠릿을 생성하는 것입니다. 이 프로토콜을 통해 비교적 많은 양의 연골 형성 펠릿을 생성할 수 있습니다. 생성된 연골 형성 펠릿은 연구나 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 연골의 특성에 대한 이해를 넓히기 위한 의약 연구에 활용될 수 있습니다.인간의 연골은 지난 수년간 재생이 더디게 이루어져 왔습니다. 따라서 연골 퇴행은 보존적 치료를 통해 관리되어야 합니다. 인간 iPSCs는 무한한 자가 재생 능력과 다분화 능력을 갖추고 있어 연골 재생을 위한 새로운 대체 세포원으로 주목받고 있습니다.시연을 진행할 연구원은 제 실험실의 대학원생인 Eugene Nam과 Arie Alice Ream입니다. 프로토콜을 시작하기 위해 15 mL 원추형 튜브에 혈구 세포를 수집하고, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정하십시오. 3×10⁵ 개의 세포를 준비하고 상온에서 515×g로 5분 동안 원심분리하십시오.흡입기를 사용하여 상층액을 제거하고, 0.5 milliliters의 혈구 배지로 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 세포를 코팅되지 않은 24 well 플레이트의 웰로 옮기고, 제조업체의 권장 사항에 따라 Sendai 바이러스 혼합물을 첨가합니다. 플레이트를 1, 150 times G, 30 degrees celsius에서 30분 동안 원심 분리합니다.원심분리 후, 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 여출액 세포를 코드가 부여된 매트릭스 웰로 옮깁니다. 플레이트를 원심분리합니다.원심분리 후 상층액을 제거하고, iPSC 배지 1 mL를 첨가하여 세포를 유지합니다. 배지는 매일 신선한 iPSC 배지로 교체해 줍니다. 인간 유도 만능 줄기세포(HIPSCs)를 배양 및 유지합니다.배양액을 매일 교체하고, 이를 신선한 essential eight 또는 E8 배지로 대체하십시오. vitronectin이 코팅된 100 mL 배양 접시에 2 x 10⁶개의 HIPSC와 E8 배지를 준비하십시오. 그다지, 배양 접시에서 E8 배지를 제거하고 멸균된 phosphate buffered saline 또는 PBS로 세포를 세척하십시오.1 mM EDTA 1 mL를 첨가하고, 디쉬를 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 3 mL의 E8 배지로 세포를 회수하여 새로운 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 세포를 실온에서 250 ×g로 2분 동안 원심분리합니다.세포 층이 흐트러지지 않도록 상층액을 흡입하여 제거하고, 5 mL의 E8 배지에서 세포를 재현탁합니다. 헤모사이토미터로 세포 수를 측정한 후, 100 mm 페트리 접시당 2 × 10⁶개의 세포를 준비합니다. 준비된 세포를 10 µM의 ROCK 억제제(ROCK inhibitor)가 포함된 E8 및 EB 배지의 1:1 혼합액 10 mL에 재현탁합니다.세포를 하룻밤 동안 배양하여 응집시킵니다. 다음 날, 파이펫팅을 통해 응집된 EB를 수확합니다. 상층액을 제거하고, 신선한 E8 배지 10 milliliters에 EB를 다시 현탁합니다.생성된 EB를 5일 동안 배양하며, 매일 신선한 E8 배지로 교체해 줍니다. 추가 숙성을 위해 배양액을 E7 배지로 교체합니다. EB를 37 °C, 5% CO2 조건에서 5일 더 유지하며, 매일 신선한 E7 배지로 배지를 교체합니다.1% 젤라틴 6 mL를 100 mm 디시에 넣고, 30분 동안 배양합니다. 젤라틴을 제거하고, 사용 전 2~3시간 동안 이 디시를 완전히 건조시킵니다. EB를 50 mL 원심분리관으로 옮깁니다.원추형 튜브 바닥에 EB가 가라앉도록 둡니다. EB가 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다. 다음으로, 20% 태아 송아지 혈청(FBS)이 포함되어 미리 가온된 shilbecco's modified equals medium 또는 DMEM 10 milliliters에 EB를 재현탁합니다.EB를 젤라틴 코팅된 100 millimeter 디쉬로 옮깁니다. 10 micromolar의 rock inhibitor를 첨가합니다. 세포를 7일 동안 배양 및 유지합니다.ROCK 억제제를 추가하지 않고 이틀마다 배지를 교체하십시오. 디시에서 배양액을 흡입하여 제거합니다. 즉시 1 mM EDTA 1 mL를 디시에 넣고, 세포를 2분 동안 배양하십시오.다음으로, 20% FBS가 포함된 DMEM 5 mL를 사용하여 세포를 회수하고, 이를 새로운 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 상온에서 250 ×g로 2분 동안 세포를 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고, 펠렛을 20% FBS가 포함된 DMEM 10 mL에 재부유시킵니다.40 µm 세포 스트레이너를 사용하여 세포 덩어리를 걸러내어 제거하고, 단일 세포를 수집합니다. 혈구계수기를 사용하여 단일 세포 수를 측정합니다. 세포를 원심분리합니다.상층액을 제거하고, 15 mL 원뿔형 튜브에 300 µL의 연골 분화 배지(chondrogenic differentiation medium, CDM)와 함께 펠렛당 3 × 10⁵개의 세포를 분주합니다. 펠렛 형성을 위해 세포를 원심 분리한 후, 하룻밤 동안 배양합니다. 3일 이내에 펠렛은 납작한 구형의 형태를 나타내게 됩니다.펠렛을 21일 동안 유지합니다. 임베딩 전, 58 °C에서 파라핀을 준비하여 녹입니다. 1.5 mL 튜브에 4% 파라포름알데히드 1 mL를 넣어 펠렛을 상온에서 2시간 동안 고정합니다.카세트에 거즈 한 층을 깔고 파이펫을 사용하여 고정된 펠렛을 옮깁니다. 거즈를 접어 펠렛을 덮은 후 카세트 뚜껑을 닫습니다. 70% ethanol 100 milliliters를 사용하여 탈수를 시작합니다.80% 및 95% 에탄올을 이용한 순차적 말단 세척을 통해 펠릿을 탈수합니다. 펠릿을 100% 에탄올로 옮겨 10분 동안 유지합니다. 투명화를 위해 용액을 에탄올과 자일렌의 1:1 혼합액 100 mL로 교체하여 10분 동안 둡니다.다음으로, 1:1 용액을 에탄올과 자일렌의 1:2 혼합액으로 교체하여 10분 동안 처리합니다. 펠렛을 100% 자일렌에서 배양하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 파라핀 침투를 위해, 펠렛을 순차적인 자일렌 및 파라핀 혼합액에서 배양합니다.전체 파라핀 침투 과정을 58 °C에서 수행합니다. 펠렛을 자일렌과 파라핀의 2:1 혼합액 100 mL에 넣고 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 용액을 자일렌과 파라핀의 1:1 혼합액 100 mL로 교체하고 30분 동안 배양합니다.그 후 용액을 자일렌과 파라핀의 1:2 혼합액 100 milliliters로 교체하고 30분 동안 배양합니다. 최종 침투를 위해 펠렛을 100%파라핀의 첫 번째 배스로 옮기고 2시간 동안 배양합니다. 펠렛을 100%파라핀의 두 번째 배스로 옮기고 58 degrees celsius에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 핀셋을 사용하여 펠릿을 몰드로 조심스럽게 옮깁니다. 파라핀 디스펜서를 사용하여 몰드에 파라핀을 넣습니다. 4 °C에서 30분 동안 파라핀을 응고시킵니다.절편을 7 µm 두께로 자르고 슬라이드로 옮깁니다. 슬라이드를 하룻밤 동안 건조시킨 후, 사용 전까지 상온에서 보관합니다. 분화 전, iPSC 콜로니를 확장 배양하였습니다.확장 배양된 iPSC를 EB로 조립하여 분화를 유도하였다. 생성된 EB를 젤라틴 코팅 접시에 부착하여 외성장 세포(outgrowth cells)를 유도하였다. 분화 21일 후, 작은 구슬 형태의 연골 형성 펠릿을 얻어 추가 특성 분석에 사용하였다.연골 분화 펠렛의 품질은 21일째에 조직학적으로 평가되었으며, BMSC 연골 분화 펠렛을 양성 대조군으로 사용하였습니다. 분화된 연골세포에 의해 분비된 ECM 단백질의 축적은 Alcian blue 및 Toluiodine blue 염색을 통해 확인되었습니다. CDMC HIPSCs로부터 생성된 연골 분화 펠렛은 CBMSC HIPCs 유래 펠렛보다 더 높은 COL2A1을 발현하였습니다.섬유성 연골의 마커인 collagen type one의 발현은 COL2A1의 발현과 비교하여 CBMC HIPSC 유래 펠렛에서 더 낮게 나타났습니다. 21일 차 연골 분화 펠렛에서 연골 세포외 기질 단백질의 유전자 발현을 실시간 PCR로 확인하였습니다. CBMC HIPSC 유래 펠렛의 aggracan 발현은 BMSC 유래 펠렛과 유사하였습니다.본 영상에서는 제대혈 단핵구 유래 iPSC를 연골 형성 펠렛으로 분화시키는 상세한 방법을 제공하였습니다. 이 기술을 숙달하고 적절히 수행한다면 2개월 이내에 완료할 수 있습니다. 본 영상을 시청한 후에는 iPSC로부터 연골 형성 펠렛을 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

기계적 스트레스는 줄기세포의 연골형성 분화를 유도하여 손상된 연골 복구를 위한 잠재적인 치료법을 제공할 수 있습니다. 원심 중력(CG)을 사용하여 지방 유래 줄기세포(ASC)의 연골 분화를 유도하는 프로토콜을 제시합니다. SOX9의 CG 유도 상향 조절은 연골 형성 표현형의 발달을 초래합니다.

원심 중력에 의해 지방이 유래 줄기 세포의 연골 분화 유도

줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

여기서, 우리는 인간 탯줄 (UC)와 코드에 태아 태반 샘플 분리 용 (CL), 왓슨의 젤리 (WJ), 코드 - 태반 접합부 (CPJ) 태아 태반 (FP) 라이닝 박리를위한 프로토콜을 제시 상기 이식편 배양 기술을 이용하여 중간 엽 간질 세포 (MSC들)의 특성화.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

우리는 배아 체 형성 (EB) 형성, 섬유 아세포 세포 확장 및 연골 형성 유도를 포함하는 통합없는 방법을 사용하여 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 통해 인간 말초 혈액 (PB)으로부터 연골 세포 계통을 생성하는 프로토콜을 제시한다.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

우리는 이러한 keratinocytes 및 섬유 아 세포를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 keratinocytes 및 섬유 아 세포 분화 및 3D 피부 organoid, 생성 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜 humanized 마우스 모델을 생성 하는 추가 단계를 포함 합니다. 여기에 제시 된 기술 피부과 연구를 향상 됩니다.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

이 프로토콜은 hiPSC를 중간엽 기질 세포(MSC)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법을 설명하고 비교합니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 더 쉬운 것이 특징입니다. 배아체(EB) 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

이 프로토콜은 인간 관절 연골에서 연골 세포, 피브로넥틴 접착 분석 유래 연골 형성 동물(FAA-CP) 및 이동 연골 형성 동물(MCP)을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다. 여기에는 효소 분해, 피브로넥틴 부착 및 이러한 세포를 분리하고 특성화하기 위한 마이그레이션 기반 분석이 포함됩니다.

Fibronectin Adhesion and Migratory Assay를 사용한 연골세포와 연골형성세포의 분리

본 연구는 중력을 이용하여 저접착 조건에서 세포를 스페로이드로 응집한 후 생성된 스페로이드를 미니 생물반응기에서 배양하여 연골세포 스페로이드를 생산하는 방법을 설명합니다.

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

배우세요 제대혈 유래 iPSC에서 연골 형성 펠렛을 생성하는 방법을. 이 기술은 대량 생산과 질병 모델링, 약물 스크리닝에 활용되어 재생의학 연구에 기여합니다.

제대혈 유래 다 능성 줄기 세포로부터 연골 형성 펠렛 형성

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