조사 항목의 모드와 항진균 공장 Defensins의 Subcellular 지 방화 하는 곰 팡이 세포의 라이브 셀 이미징

식물 defensins 병원 균에 대 한 식물 방어에 중요 한 역할을 재생. 대 한 항진균 요원, 액션 (MOA)의 그들의 모드를 이해로 이러한 항진균 펩 티 드의 효과적인 사용이 중요 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 방법 공부 이러한 펩 티이 드의 MOA의 중요 한 측면을 설명 합니다.

이 생세포 이미징 방법의 전반적인 목표는 진균 세포에서 항진균 식물 방어제의 작용 메커니즘의 중요한 측면을 연구하는 것입니다. 첨단 컨포칼 현미경 기술의 출현으로 라이브 셀 이미징은 항진균 식물 방어제의 작용 모드를 연구하는 강력한 도구가 되었습니다. 이 기술을 활용하여 여기에서는 항진균성 식물 방어제의 작용 방식을 이해하는 데 도움이 되는 핵심 질문에 답하는 데 도움이 되는 방법을 제시합니다.

우리의 초점은 이러한 펩타이드가 어떻게 곰팡이 세포에 내재화되는지, 그리고 이러한 펩타이드가 어떻게 세포 소기관에 국한되거나 세포질에서 확산되는지입니다. Fusarium graminearum의 PH-1 균주의 원뿔 현탁액을 만들기 위하여는, 첫째로 완전한 매체를 포함하는 판에 긴장의 배양을 설치하십시오. 5일 동안 섭씨 28도에서 배양합니다.

분생포자를 생산하려면 5일 된 배양액의 10mm 직경 플러그 4개를 50ml의 카르복시메틸 셀룰로오스 배지에 접종합니다. 이 플러그를 섭씨 28도에서 4-7일 동안 180rpm으로 설정된 회전식 셰이커에서 배양합니다. 배양물이 붉은색을 띠면 분생포자(conidia)가 형성된 것입니다.

현탁액에서 분생포자를 수집하려면 액체 배양액을 와류로 가열하고 두 층의 여과 물질을 통해 1밀리리터를 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 여과합니다. 현탁액을 2분 동안 원심분리하고 상등액을 버립니다. 그런 다음 1ml의 멸균수로 펠릿을 씻고 원심분리를 반복합니다.

다음으로, 펠릿을 1밀리리터의 2x SFM에 재현탁합니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 분생포자를 세고 현탁액의 밀도를 밀리리터당 100, 000 분생포자로 조정합니다. Neurospora crassa conidial 현탁액을 만들려면 스톡 배양에서 Vogel의 한천 배지를 포함하는 경사 튜브로 분생포자를 옮기고 튜브를 5일 동안 일정한 빛 아래 실온에서 배양합니다.

5일 후, 접종 루프를 사용하여 소량의 성장 배양액을 2밀리리터의 Vogel's liquid medium이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 루프에서 분생포자를 혼합해야 합니다. 그런 다음 현탁액을 여과하고 원심분리한 다음 세척 단계 없이 Vogel의 배지에 분생포자 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

마지막으로 최종 서스펜션을 밀리리터당 100, 000 코니디아로 조정합니다. 컨포칼 현미경 검사를 위한 세균 준비를 위해 35mm 배양 접시에 50마이크로리터의 분생포자 현탁액을 피펫팅하고 실온에서 3-6시간 동안 분생포자를 발아시킵니다. 컨포칼 현미경 검사의 경우, 50마이크로리터의 원뿔형 현탁액을 10mm 유리 바닥 접시의 마이크로웰에 피펫팅합니다.

그런 다음 미리 결정된 최소 억제 농도에서 50마이크로리터의 형광 표지된 디펜신을 현탁액에 첨가하고 실온에서 2.5시간 동안 표지된 디펜신과 함께 분생포자를 배양합니다. 배양 후, 5 마이크로 몰의 최종 농도를 위해 멤브레인 선택적 염료 FM4-64의 2 마이크로 리터를 첨가하십시오. 그런 다음 분생포자를 검사하기 전에 실온에서 30분 동안 배양물을 배양합니다.

컨포칼 현미경을 설정하려면 백색광 레이저를 선택합니다. 488 나노미터 및 550 나노미터 레이저를 사용하여 각각 로다민 표지 디펜신과 FM4-64 염료를 여기시킵니다. 이 레이저를 1%의 강도로 설정한 다음 로다민 표지 디펜신의 경우 검출 파장을 580-700나노미터로, FM4-64 염료의 경우 690-800나노미터로 설정합니다.

이제 이미지를 수집합니다. 타임 랩스 이미징의 경우 50마이크로리터의 원뿔형 현탁액을 유리 바닥 마이크로웰 접시에 추가합니다. 다음으로, 현미경에 마이크로웰 접시를 장착하고 저전력으로 세포를 찾습니다.

그런 다음 100x, 1.44 오일 목표로 전환합니다. DyLight550 라벨링 디펜신을 관찰하려면 여기의 경우 레이저 라인을 550나노미터로, 검출의 경우 560나노미터에서 600나노미터로 설정합니다. 그런 다음 스캔 모드를 xyzt로 설정합니다.

그런 다음 필요에 따라 Z 위치, 확대/축소, 이미지 캡처 빈도 등을 설정합니다. 이제 원뿔형 현탁액에 3마이크로몰의 최소 억제 농도에서 50마이크로리터의 형광단 표지 디펜신을 추가하고 5마이크로몰의 최종 농도를 위해 2마이크로리터의 멤브레인 선택적 염료 FM4-64를 추가합니다. 그런 다음 필요한 경우 광학 장치의 초점을 다시 맞춥니다.

이미지를 캡처하기 전에 증발을 방지하기 위해 마이크로웰 접시에 작은 젖은 여과지 조각을 놓으십시오. 그런 다음 2.5시간 동안 3.5분마다 이미지를 캡처하여 처리합니다. Medicago truncatula에서 유래한 두 가지 디펜신의 내재화 및 세포 내 국소화를 추적하고 비교하기 위해 생세포 이미징을 수행했습니다.

화학적으로 합성된 로다민 표지 디펜신 4는 Neurospora crassa 및 Fusarium graminearum에서 다르게 밀매되었습니다. FM4-64는 두 곰팡이의 원형질막을 라벨링했습니다. 그러나 Fusarium에서는 디펜신 4가 세포질에 확산되어 있습니다.

반면 Neurospora에서는 소포체로 운반됩니다. 비교를 위해 Defensin Five는 FM4-64에 의한 원형질막 라벨링과 함께 Neurospora crassa의 DyLight550 라벨을 사용하여 시각화되었습니다. 타임 랩스 이미징은 이 디펜신이 30-40분 이내에 세포에 들어간 다음 세포질을 통해 확산되는 것을 보여줍니다.

이것은 세포에 들어가 3시간 후에도 수포체 내에 갇혀 있는 디펜신 4호의 이동과 다릅니다. 요약하면, 살아있는 세포 이미징은 항진균 식물 차이의 작용 방식에 대한 이해를 높이는 강력한 도구입니다. 다른 중요한 형광 염료 및 세포 마커를 사용하면 다른 항균 펩타이드를 위해 변형할 수 있는 유연성을 가지고 있습니다.

궁극적으로 이 기술은 농업 및 의학에서 항균제로 항균 펩타이드를 사용하기 위한 새로운 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.