이미징 센터의 형광 질량으로 Golgi 단백질의 양적 지역화

이 영상 기반 방법의 전반적인 목표는 골지체 단백질을 나노미터 해상도로 정량적으로 위치시키는 것입니다. 이 방법은 골지의 조직과 작동 원리 등 골지체 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 전통적인 광학 현미경과 소프트웨어 도구를 사용한다는 점입니다.

우선, 10% FBS를 보조한 DMEM에서 T25 플라스크에서 HeLa 세포를 배양하고, 37도 섭씨와 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 세포가 약 80% 합류에 도달하면 배양지를 흡인하고 25% 트립신 EDTA 1밀리리터를 플라스크에 추가합니다. 세포를 37도 섭씨에서 2분간 배양하세요.

인큐베이터에서 세포를 꺼내 1밀리리터의 완전한 배지를 넣어 플라스크 벽에서 세포를 부드럽게 씻어내세요. 분리된 세포를 멸균 원심분리관으로 옮기고, 튜브를 500g에서 2분간 돌려 세포를 알리게 합니다. 상원액을 흡인한 후, 1밀리리터의 완전 배지를 사용해 세포 펠릿을 현탁합니다.

멸균된 유리 덮개 슬립이 포함된 24웰 플레이트의 웰에서 배지를 제거하고 약 100,000개의 셀을 웰에 씨앗 뿌립니다. 웰의 부피를 5밀리리터까지 채우기 위해 완전한 매체를 사용하세요. 그 다음 5% 이산화탄소와 함께 37도 섭씨에서 배양합니다.

세포가 80% 합율에 도달하면, 제조사 프로토콜에 따라 80나노그램의 GalT-mCherry와 320나노그램의 TPST1-EGFP 플라스미드 DNA 및 형질전환 시약을 사용해 세포를 트랜스펙션합니다. 세포를 4시간에서 6시간 배양한 후 배양지를 교체하고 세포를 인큐베이터에 다시 12시간 보관합니다. 우물에서 배지를 흡입한 후 33 마이크로몰드 노코다졸 5밀리리터를 완전 배지를 첨가한 후, 세포를 37도 섭씨, 5% 이산화탄소 환경에서 3시간 배양합니다.

글 프로토콜에 따라 유리 커버 슬립을 세척한 후, BSA 마이크로리터당 1마이크로그램이 들어 있는 PBS를 1회 사용해 110나노미터 다색 형광 구슬을 80배로 희석합니다. 튜브를 잠시 소용돌이로 돌려 구슬 집합체를 분산시킵니다. 피펫 팁을 사용해 희석한 구슬 60마이크로리터를 깨끗한 커버 슬립에 바르세요.

어두운 곳에서는 커버 슬립을 35밀리미터 접시에 넣고 알루미늄 호일로 덮으세요. 진공 펌프에 연결된 건조기 안에서 커버를 어두운 곳에서 말리세요. 그 다음 50마이크로리터의 마운팅 매체를 사용해 커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착하세요.

형광 이물질을 제거하려면 적절히 깨끗한 커버 슬립이 필수적입니다. 녹색, 빨간색, 원빨간 채널의 다색 비즈를 촬영하려면, 영상 세션 시작 시 최적의 초점면 위아래 세 구역을 3D 스택으로 수집합니다. 스택을 TIFF 파일로 저장하세요.

골지체 미니 스택을 이미징하기 위해, TPST1-EGFP와 GalT-mCherry를 형광 표지 슬라이드에 트랜스펙션하여 TPST1-EGFP와 저준위 또는 중간 수준의 GalT-mCherry를 발현하는 세포를 찾아야 합니다. 방금 시연한 대로 3D 이미지 스택을 획득하세요. 이미지를 분석하려면 이미지 J를 열고 File, Image, Open을 선택하여 세 개의 TIFF 파일로 구성된 비드 이미지 세트를 엽니다.

Image, Stacks, Z Project를 선택해서 빨간 채널에서 가장 집중된 섹션 주위에 연속된 세 개의 섹션을 평균화하세요. 시작 단면과 정지 단면의 단면 번호를 입력하고, 투영 유형 옵션 중에서 평균 강도를 선택합니다. 이미지에 비즈가 없는 배경 투자 수익률(ROI)을 그리세요.

그 다음 '분석, 측정값 설정'에서 평균 회색값과 표준편차 또는 SD만 확인하세요. 배경 평균 강도와 표준편차를 얻기 위해 분석, 측정을 실행하세요. Process, Math, Detract를 선택하여 배경 평균 강도에 표준편차의 6배를 더한 값을 뺄 이미지를 선택하세요. 그 후 이 채널에 대응하는 계산된 값을 입력합니다.

같은 시작 및 정지 슬라이스와 같은 배경 ROI를 사용하여 녹색과 원빨간 채널 이미지 스택에 대해 평균화와 뺄셈을 반복합니다. Image, Color, Merge Channels를 사용하여 세 개의 처리된 이미지를 병합하세요. 채널 R을 빨간색, 채널 G를 초록색, 채널 B를 파란색으로 선택하세요. 분석, 도구, ROI 관리자를 선택하여 ROI Manager를 실행하세요.

단일 비드에 정사각형 ROI를 그리세요. 그 다음 키보드의 T키를 눌러 ROI 매니저에 ROI를 추가하세요. 분석, 측정값 설정에서 무게중심만 체크하세요.

ROI Manager에서 채널 R을 선택하고 Measure를 클릭하면 결과 창에서 ROI 중심의 X와 Y 좌표를 얻을 수 있습니다. 두 열을 복사해서 스프레드시트에 붙여넣으세요. 채널 G와 채널 B의 ROI 중심 좌표를 얻으세요. 스프레드시트를 beads.csv 상태로 저장하세요.

이미지 J에서 플러그인을 사용해 두 개의 매크로, 매크로 골지체 ROI 검사와 매크로 출력 3채널 데이터를 설치합니다. ROI 매니저와 결과 창을 비우세요. 세 개의 TIFF 파일로 구성된 골지체 미니 스택 이미지 세트를 열어보세요.

앞서 이 영상에서 보여준 것처럼 배경 감산 이미지를 생성하여 나중에 사용할 수 있습니다. 그 다음 이미지를 복제하세요. 프로세스, 이미지 계산기에서 배경에서 빼고 채널 G, 채널 R, 채널 B 이미지를 추가하세요.

결과 이미지에서 Image, Adjust, Threshold 항목에서 'Set to input one'을 최저 임계값 레벨로 선택하세요. 분석, 입자 분석 항목에서 픽셀 크기 범위도 입력하세요. 50을 무한대에 입력하고, 간지의 제외 항목을 확인한 후 매니저에 추가하세요.

다음으로, Image, Color, Merge Channels를 사용해 이전에 생성된 세 개의 배경 감량 이미지를 합치고, 채널 R을 빨간색, 채널 G를 녹색, 채널 B를 파란색으로 선택하세요. 그 다음 플러그인, 매크로, 골지 ROI 검사를 선택하여 매크로 매크로 골지 ROI 검사를 실행하세요. 이미지 세트에 단일 골지체 미니 스택을 포함하는 ROI를 최대한 많이 선택하는 것이 중요합니다.

분석, 측정값 설정에서 면적, 평균 회색값, 질량 중심만 체크하세요. 매크로 도구를 실행하여 데이터를 획득하세요. 출력 3채널 데이터. 여기 나열된 순서대로 중심 좌표를 스프레드시트에 복사하세요.

그 다음 스프레드시트를 ministacks.csv 상태로 저장하세요. 텍스트 프로토콜에 따라 중심의 색 이동 보정과 국소화 몫(LQ) 계산을 진행하세요. 여기 사용된 것과 같은 일반 아포크로매틱 렌즈를 장착한 현대 연구용 광각 현미경은 색 이동이 거의 없다.

하지만 다채로운 구슬 이미지를 자세히 살펴보면 그 점이 드러난다. 붉은 형광 중심은 구슬의 실제 위치로 정의됩니다. 녹색과 먼 빨간색 형광의 상대적 색 이동은 벡터로 표현할 수 있습니다.

영상 평면 내의 색 이동은 각 비드의 녹색과 파란색 벡터로 나타난다. 여기서 보시다시피, 크로매틱 시프트 보정은 크로매틱 시프트를 크게 줄여줍니다. 포유류 세포에서는 골지체 복합체가 핵주위 부위에 집착하는데, 이는 보통 기존 광학 현미경으로는 해석하기 어렵습니다.

노코다졸 치료 후 핵 주변 골지체 복합체는 사라지고, 세포질 전반의 소포체 출구 부위에 수십 개의 골지 미니 스택이 모입니다. 이 영상에서 시연된 이미지 분석을 사용해 생성된 예시 이미지가 여기 있습니다. 매크로 골지 ROI 검사 도구를 사용해 40개의 선택된 골지 미니 스택이 나열되었습니다.

세 가지 기준을 적용한 후, TPST1-EGFP LQ 계산을 위해 21개의 골지체 미니 스택을 분석하였습니다. 이 기술을 숙달하면 형광 표지 후 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 방법이 개발된 후, 이 방법은 골지체 연구자들이 면역전자현미경과 동등한 해상도로 골지체 단백질을 정량적으로 위치시키는 길을 열었습니다.