Name: 이미징 센터의 형광 질량으로 Golgi 단백질의 양적 지역화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: 배우세요 형광 이미징을 이용해 Golgi 단백질을 나노미터 해상도로 정량적 지역화하는 방법을. HeLa 세포 배양과 소프트웨어 분석 도구를 활용하여 Golgi 소기관의 구조와 기능을 연구할 수 있습니다.

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우리는 소프트웨어 최적화와 도움 뿐만 아니라 락 쉬 미와 Narasimhan Govindarajan TPST1 EGFP DNA 플라스 미드, 디 스티븐 스 (브리스톨의 대학, 브리스톨, 영국) 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 L.L. 국립 의학 연구 위원회 (NMRC/CBRG/007/2012), 교육 (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 및 RG132/15 AcRF Tier2 MOE2015-t 2-2-073)에서 교부 금에 의해 지원 되었다

<ol><li>Glick, B. S., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+Golgi+traffic%3A+a+critical+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Models for Golgi traffic: a critical assessment.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215(2011).</li>
<li>Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mammalian+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mammalian Golgi.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).</li>
<li>Lu, L., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+endosomes+to+the+trans-Golgi+network%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From endosomes to the trans-Golgi network.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li>
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<li>Trucco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+traffic+triggers+the+formation+of+tubular+continuities+across+Golgi+sub-compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).</li>
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<li>Roth, J., Berger, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+localization+of+galactosyltransferase+in+HeLa+cells%3A+codistribution+with+thiamine+pyrophosphatase+in+trans-Golgi+cisternae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae.</a> J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).</li>
<li>Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+sulfation+is+a+trans-Golgi-specific+protein+modification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification.</a> J Cell Biol. 105 (6), Pt 1 2655-2664 (1987).</li>
<li>Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Arf-1+to+the+early+Golgi+by+membrin%2C+an+ER-Golgi+SNARE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE.</a> J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).</li>
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<li>Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+large+ADP-ribosylation+factor-guanine+nucleotide+exchange+factors+to+different+Golgi+compartments%3A+evidence+for+distinct+functions+in+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).</li>
<li>Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy-based+linescan+methodologies+for+intra-Golgi+localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins.</a> J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).</li>
<li>Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-independent+secretion+requires+functional+maturation+of+Golgi+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements.</a> J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).</li>
<li>Volchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Countercurrent+distribution+of+two+distinct+SNARE+complexes+mediating+transport+within+the+Golgi+stack%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack.</a> Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).</li>
<li>Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+budding+within+the+Golgi+stack%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">COPI budding within the Golgi stack.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231(2011).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이전, 가벼운 현미경 검사 법에서 골 지 단백질의 지 방화는 주로 상관 관계 또는 알려진된 지역화15,16, Golgi 마커 이미지와 단백질의 이미지의 중첩의 정도 의해 계량 17. 결과 상관 관계 또는 겹치는 계수 얼마나 가까운 테스트 단백질이 골 마커를 공간적으로 반영 합니다. 이 접근에 대 한 적어도 3 개의 경고가 있다. 첫째, 상관 관계 또는 겹치는 계수 비선형 이며 직접 공간적 거리 표시 하지 않습니다. 둘째, 상관 관계의 정도 비판적으로 현미경 시스템의 해상도에 따라 달라 집니다. 따라서, 두 골 단백질 사이의 계수 시스템 상수 아니다. 셋째, 같은 축 지역화 cisternae 따라 다른 측면 배포와 두 골 단백질 고유 계수를 가질 수 있습니다. 따라서, 상관 관계 또는 겹치는 계수 나타내지 않습니다 Golgi 단백질의 축 지역화. Dejgaard ...

골 복잡 한 포유류 세포1,2,3분 비/endocytic 단백질과 지질 (이 화물)의 인신 매매에 필수적인 역할을 재생 합니다. 골에서 화물은 다양 한 하위 세포질 구획 정렬 뿐만 아니라 또한 다양 한 유형의 glycosylation 수정. 포유류 골 복잡 한 일반적으로 구성 된 4-11 밀접 하 게 인접 하 고 평평한 막 낭 cisternae 라는 수많은 옆으로 연결 된 골 스택 구성 되어 있습니다. 순차적으로 누적된 골 cisternae 더로 분류 됩니다, 다른 한쪽 끝에서 cis, 중간 및 트랜스-cisternae. 트랜스에서-Golgi 스택, 트랜스의 측면-대부분 막 sac 트랜스라고 하는 관 및 그물 막 네트워크로 개발-Golgi 네트워크 (TGN)4. 분 비 통로에서 바인딩과 그물 (응급실)에서 파생 된 화물의 cis에 Golgi 스택에 입력-측면 및 다음 순차적으로 통과 중간 및 트랜스-cisternae. 화물 결국 종료 트랜스에서 골-골 또는 TGN destining 원형질 막, endosomes 또는 분 비과 립.
어떻게 화물 운송 Golgi 스택 및 어떻게는 Golgi의 cisternal 조직 유지의 분자 및 세포 메커니즘 신비로운 남아 있다 고 현재 열띤된 토론1의 밑에 아직도. 이 분야에 있는 어려움 중 하나는 Golgi cisternae만 확인할 수 전자 현미경 (EM) 아래는 광학 현미경의 해상도 때문입니다 (~ 200 nm) 개별 Golgi cisternae 두 cisternal 두께에서 (< 100 nm를 해결 하기 위해 충분 하지 않습니다 그리고 거리)입니다. 따라서, 거주 단백질과 외계 화물의 하위 Golgi 지역화 통상 면역-골드 EM에 의해 결정 됩니다. 그러나, 면역-골드 그들은 매우 기술적으로 요구 하 고 그것은 대부분의 세포 생물학 실험실의 기능. EM의 해상도 하위 나노미터 수 면역-골드 엠에서 제공 하는 해상도 크게 복잡 한 항 체의 크기 (1 차 및 이차 항 체)와 금 입자에 의해 방해 하 고 20 보다 더 나쁠 수 있다 nm. 또한, EM 이미지 2D 얇은-섹션 대신 상대 위치 및 2D 섹션5의 방향에 따라 잘못 된 결론에 발생할 수 있습니다 골의 3 차원 세계 보기에서에서 얻을 수 있습니다. 예를 들어 EM 단일 섹션 공부 아니다 안정적으로 구별할 수 있는 소포는 관의 직교 보기 때문에 둘 다 동일한 라운드 막 프로필을 표시할 수 있습니다. 3 차원 구조화 조명 현미경 (3D-SIM) 같은 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술의 최근 출현 자극 방출 소모 (호텔 위치), photoactivated 지역화 현미경 (팜)와 추계 광 재건 현미경 ( 폭풍), 가벼운 현미경6에서 하위 골 구조를 해결 하기 위해 가능 하 게. 그러나, 적어도 4 개의 단점이 크게는 Golgi의 세포 생물 학적 연구에 그들의 사용을 제한할 수 있습니다. 1) 현재 슈퍼 해상도 기법 대부분 세포 생물학 실험실 넘어는 비싸고 특별 한 하드웨어 구성이 필요 합니다. 2) 특별 한 형광 라벨 프로토콜 슈퍼 해상도 기법 필요 합니다. 최고의 조건 하에서 이러한 기술을 공간 해상도에 20-110 nm 주장, 3) 하지만, 실제 샘플에서 얻은 실용적인 해상도 훨씬 더 수 있습니다. 4) 비교에 전통적인 현미경 검사 법, 이러한 슈퍼 해상도 기법 여전히 어려움에서 다 색, 3D 또는 라이브 셀 이미징, 단독으로 또는 조합에서. 아마 가장 중요 한 것은, 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술 및 면역-골드 그들 항복 질적 양적 지역화 데이터 대신.
부분적으로 위에서 언급 한 문제를 해결 하려고, 우리는 최근 개발 센터의 질량 (GLIM), 체계적이 고 양적 지역화는 골을 이미징 하 여 골 단백질 지 방화 라는 기반으로 하는 기존의 가벼운 현미경 검사 법 방법 면역-골드 엠7의 동일한 해상도에서 단백질. 이 방법에서는, 경작된 한 포유류 세포에서 골은 골 지 미니-스택으로 nocodazole, microtubule depolymerizing 약물의 치료에 의해 분산 됩니다. 광범위 한 학문은 nocodazole 유도 골 미니-스택 (이 골 지 미니-스택)에 유사한 조직에 세포 기능8,,910, 기본 골 더미는 설명 했다 11. 테스트 단백질의 지역화 지 수 (LQ) GLIM 통해 취득 될 수 있다 그리고 그것은 양적 하위-Golgi 지역화를 나타냅니다. LQs의 숫자 값을 비교할 수 있습니다 하 고 25 개 이상의 골 마커의 LQ 데이터베이스 사용할 수 있다.
GLIM, 골 지 미니-스택 트리플 생 또는 것 표현 GM130, 갈 트 mCherry 및 테스트 단백질 (x)에 의해 표시 된 있습니다. GM130와 갈 트-mCherry, cis-및 트랜스-Golgi 마커 각각12,13, 제공 참조 포인트. 트리플 형광, 빨강 (R), 녹색 (G), 빨강 (B), 인위적으로 각각 빨강, 녹색 및 파랑으로 표시 됩니다. 형광 질량 (이 하 센터)의 센터 하위 픽셀 해상도 달성 하기 위하여 채택 된다. 골 축 GalT mCherry의 GM130의 센터에서 벡터로 정의 됩니다. 골 지 미니 스택 Golgi 축을 무한 회전 대칭 구조를 원통형으로 모델링 됩니다. 따라서, 골 지 미니 스택 골 축 1 차원 구조 더 모델링 될 수 있습니다. LQ 테스트 단백질의 x dx/d1, 있는 dx GM130의 x의 중심 으로부터 거리 d1 은 GM130의 갈 트 mCherry의 센터에서 거리로 정의 됩니다. X의 중심 축에서 인 경우에, 그것의 프로젝션 축 거리 계산을 위해 사용 됩니다. 골 축, 축 각도, dx, d1, 각도 α와 각도 β를 포함 하 여 GLIM에 대 한 변수는 그림 1에서 개요로 설명 된다. LQ는 Golgi 미니-스택 방향 셀에 무작위로 비록 골 축 각도 무관 합니다.
골 지 미니-스택 휘도가 이미지에 나타납니다. 우리는 GLIM에 대 한 analyzable 골 미니-스택 선택 하 세 기준 개발. 골 지 미니 스택 백그라운드의 표준 편차 (SD)의 총 강도의 비율 ≥ 30 각 채널에는, 1)는 신호 대 잡음 비율 기준. 이 표준은 골 미니-스택의 신호 대 잡음 비율에 달려 있는 질량의 중심의 위치 정확도 지키기 위하여 이다. 2) 축 각도 또는 거리 기준을는 d1≥ 70 nm. d1 골 축 각도의 증가 함께 감소합니다. 때 축 각도 90 °에 도달 또는 수직, 미니 스택 d1 으로 확인할 수 없는 0에 접근 하는. d1≥ 70 nm 세로 골 지 미니-스택 근처 효과적으로 제외할 수 있습니다. 어느 하나에서 3) co 선형성 기준 | α 탄 | 또는 | β 탄 | ≤ 0.3입니다. 이 기준 미니 스택 세 센터는 골 지 미니 스택 1 차원 모델에 대 한 공동 선형 충분히 보장 합니다. 모든 가벼운 현미경 빨강, 녹색 및 빨강 형광 센터의 상대적 위치를 왜곡 심각 하 게 수 있는 색수차에서 고통. 색수차 현미경 시스템의 실험적으로 110 nm 구슬, 트리플-이라고 표시 된 빨간색, 녹색 및 빨강 형광을 이미징 하 여 보정 됩니다. 각 구슬 이미지에 대 한 레드의 중심은 구슬의 진정한 위치도 정의 하며 반음계 녹색과 빨강 센터의 교대 있습니다 1 차 다항식 함수. 골 지 미니-스택 센터 녹색 및 빨강 채널의 색채 변화를 해결 하기 위해 다항식 함수를 받게 됩니다.
GLIM 통해 우리의 해상도 얻을 수 있습니다 ~ 30 nm 표준 조건 하에서 골 축. 중요 한 것은, 양적 어떤 골 단백질 지도 하는 체계적인 방법을 제공 합니다. GLIM는 넓은 필드와 같은 기존의 현미경 또는 confocal 현미경, 일반적인 형광 라벨 프로토콜을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이미징 및 데이터 처리는 짧은 한 시간 걸릴 수 있습니다. GLIM를 통해 우리는 직접 증명 분 비 화물의 진보적인 전환에서 cis- 트랜스-7골 측면.

<table><tbody><tr><td>형광 구슬. 상업명: TetraSpeck 비즈</td><td>인비트로젠</td><td>T7279</td><td>현미경의 색 이동을 보정하기 위한 다색 비즈로서도</td></tr><tr><td>유리 커버슬립 & 파이; 12mm (번호 1.5)</td><td>멘젤</td><td>CB00120RAC</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립 & 파이; 25mm (번호 1.5)</td><td>멘젤</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>카프리콘</td><td>DMEM-HPA-P50</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE 하이클론</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>노코다졸</td><td>머크</td><td>487928</td><td></td></tr><tr><td>형질전환 시약. 상업명: 리포펙타민 2000</td><td>인비트로젠</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>형질전환 배지. 상업명: 옵티멤</td><td>인비트로젠</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TPST1-EGFP</td><td>애드진</td><td>66617</td><td>D. 스티븐스(브리스톨 대학교, 브리스톨, 영국)의 기증</td></tr><tr><td>갤트-m체리</td><td></td><td></td><td>우리 연구실에서 만든 거야</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>머크</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>시그마-올드리치</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>폴리(비닐 알코올) (Mw ~31,000). 상업명: Mowiol-488</td><td>칼바이오케미</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마-올드리치</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-GM130</td><td>BD 생명과학</td><td>610823</td><td>인간 GM130에 대한 1차 항체</td></tr><tr><td>원적색 형광 결합 염소 항쥐 IgG. 상업명: Alexa Fluor 647 접합 염소 항생쥐 IgG</td><td>인비트로젠</td><td>A-21235</td><td>원적색 형광 결합 2차 항체</td></tr></tbody></table>

이미징 센터의 형광 질량으로 golgi 단백질의 양적 지역화

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

Cis를 포함 하 여 하위 골 지역으로 더 분류 될 수 있다 직렬 스택된 막 cisternae 골 복잡 한 구성-골, 중간-골, 트랜스-골 및 트랜스-Golgi 네트워크. 골 세포 기능 그것의 거주 단백질의 특성 분포에 의해 결정 됩니다. 기존의 가벼운 현미경의 공간 해상도 하위 골 구조 또는 cisternae 해결 하려면 너무 낮습니다. 따라서, 면역-골드 전자 현미경 지역화 하위 골 수준에서 단백질을 선택 하는 방법 이다. 그러나, 기술과 악기는 대부분 세포 생물학 실험실의 기능을 넘어. 여기 이미징 센터의 질량 (GLIM) 체계적이 고 양적 Golgi 단백질을 지역화 하 여 골 단백질 지 방화 라는 우리의 최근에 개발한 슈퍼 해상도 방법을 설명 합니다. GLIM 표준 형광 라벨 프로토콜 및 일반적인 넓은 필드 또는 confocal 현미경을 기반으로 합니다. 그것은 현미경 시스템, 이미지 수집 및 사후 수집 분석의 시프트 반음계 수 차 보정을 포함 한다. 테스트의 하위 Golgi 지역화 지역화 몫으로 양적 표현 된다. GLIM;의 4 개 주요 이점이 있다 그것은 급속 한, 전통적인 방법과 도구에 따라, 지역화 결과 양적, 그리고 요 극 ~ 골 축 30 nm 실용적인 해상도. 여기는 지역화 테스트 Golgi 단백질 GLIM의 상세한 프로토콜에 설명 합니다.

우리 실험실에서 사용 하는 것과 같은 계획 apochromatic 렌즈를 갖춘 현대 연구 급료 가벼운 현미경 최소한의 색수차 (그림 2A)를 보여줍니다. 그러나, 다 색 형광 구슬 이미지의 주의 깊은 검사는 같은 구슬 (그림 2B)의 다른 컬러 이미지의 변화를 알아낼 수 있습니다. 빨강 채널 색수차의 무료 이며 따라서 빨간색 형광의 센터는 구슬의 진정한 위치를 정의 합니다. 녹색과 빨강 형광의 상대 반음계 교대 붉은 형광 (그림 2C)의 중심에서 발생 하는 녹색 및 파랑 벡터에 의해 나타낼 수 있습니다. 이미징-비행기 내에서 반음계 시프트 경험적으로 각 구슬 (그림 2<...

골의 정확한 지역화는 Golgi의 세포질 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 그러나, 기존의 광학 현미경은 하위 골 구조를 해결 하기 위해 수 없습니다. 여기는 양적 단백질의 하위 Golgi 지역화가 결정을 기반으로 하는 기존의 현미경 슈퍼 확인 방법에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.

이미징 센터의 형광 질량으로 Golgi 단백질의 양적 지역화

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

이 영상 기반 방법의 전반적인 목표는 골지체 단백질을 나노미터 해상도로 정량적으로 위치시키는 것입니다. 이 방법은 골지의 조직과 작동 원리 등 골지체 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 전통적인 광학 현미경과 소프트웨어 도구를 사용한다는 점입니다.우선, 10% FBS를 보조한 DMEM에서 T25 플라스크에서 HeLa 세포를 배양하고, 37도 섭씨와 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 세포가 약 80% 합류에 도달하면 배양지를 흡인하고 25% 트립신 EDTA 1밀리리터를 플라스크에 추가합니다. 세포를 37도 섭씨에서 2분간 배양하세요.인큐베이터에서 세포를 꺼내 1밀리리터의 완전한 배지를 넣어 플라스크 벽에서 세포를 부드럽게 씻어내세요. 분리된 세포를 멸균 원심분리관으로 옮기고, 튜브를 500g에서 2분간 돌려 세포를 알리게 합니다. 상원액을 흡인한 후, 1밀리리터의 완전 배지를 사용해 세포 펠릿을 현탁합니다.멸균된 유리 덮개 슬립이 포함된 24웰 플레이트의 웰에서 배지를 제거하고 약 100,000개의 셀을 웰에 씨앗 뿌립니다. 웰의 부피를 5밀리리터까지 채우기 위해 완전한 매체를 사용하세요. 그 다음 5% 이산화탄소와 함께 37도 섭씨에서 배양합니다.세포가 80% 합율에 도달하면, 제조사 프로토콜에 따라 80나노그램의 GalT-mCherry와 320나노그램의 TPST1-EGFP 플라스미드 DNA 및 형질전환 시약을 사용해 세포를 트랜스펙션합니다. 세포를 4시간에서 6시간 배양한 후 배양지를 교체하고 세포를 인큐베이터에 다시 12시간 보관합니다. 우물에서 배지를 흡입한 후 33 마이크로몰드 노코다졸 5밀리리터를 완전 배지를 첨가한 후, 세포를 37도 섭씨, 5% 이산화탄소 환경에서 3시간 배양합니다.글 프로토콜에 따라 유리 커버 슬립을 세척한 후, BSA 마이크로리터당 1마이크로그램이 들어 있는 PBS를 1회 사용해 110나노미터 다색 형광 구슬을 80배로 희석합니다. 튜브를 잠시 소용돌이로 돌려 구슬 집합체를 분산시킵니다. 피펫 팁을 사용해 희석한 구슬 60마이크로리터를 깨끗한 커버 슬립에 바르세요.어두운 곳에서는 커버 슬립을 35밀리미터 접시에 넣고 알루미늄 호일로 덮으세요. 진공 펌프에 연결된 건조기 안에서 커버를 어두운 곳에서 말리세요. 그 다음 50마이크로리터의 마운팅 매체를 사용해 커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착하세요.형광 이물질을 제거하려면 적절히 깨끗한 커버

quantitative-localization-golgi-protein-imaging-its-center

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 전자 micrographs에 휘황 태그 단백질을 지역화하는 방법을 설명합니다. 형광 먼저 ultrathin 섹션에 사진 활성 현지화 현미경을 사용하여 지역화되어 있습니다. 이러한 이미지는 다음 같은 섹션의 전자 micrographs으로 정렬되어 있습니다.

나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

시냅스에서 신경 전달 물질 수용체 클러스터의 풍부한 강력히 시냅스 강도에 영향을 미칩니다. 이 방법에서는 단일 시냅스 해상도로 가로, 세로, 높이로 fluorescently-라벨이 신경 전달 물질 수용체를...

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

여기에서는 단백질의 형광 강도를 적절한 내부 표준물질의 농도로 정규화하여 중심체에서 단백질의 수준 변화를 측정하기 위해 새로운 정량적 형광 분석법이 개발되었습니다.

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

이 문서는 하나 이상의 플라즈마 포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 (GSD) 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 여 세포 막 단백질의 검출에 대 한 프로토콜을 설명. 여기, 우리 토론 혜택과 시각화 및 세포 단백질의 정량화에 대 한 이러한 접근을 사용 하 여 고려 사항.

포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 영상

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

스모는 필수적이 고 고도로 보존 된, 작은 유비퀴틴 같은 수정자 단백질입니다. 이 프로토콜에서 우리는 스트레스를 견딜 수 있는 재조합 스모-포착 단백질 (kmUTAG)의 사용을 설명 하 여 다양 한 세포 유형에 서 고유 하 고 태그가 지정 되지 않은 스모 결합체와 그 현지화를 시각화 합니다.

스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

이 프로토콜은 면역형광 후 이미지 분석, 일시적인 과발현 고려 사항, 웨스턴 블롯을 사용한 ATG9A 당화 상태 조사를 포함하여 ATG9A 생물학 연구에 도움이 될 수 있는 다양한 방법을 설명합니다.

ATG9A, Multi-Spanning Membrane 단백질 이미징

여기 이미지는 기본 프로토콜을 설명하고 siRNA의 transfection 후 라이브 포유 동물 조직 배양 세포의 mitotic 타이밍을 계량.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

배우세요 형광 이미징을 이용해 Golgi 단백질을 나노미터 해상도로 정량적 지역화하는 방법을. HeLa 세포 배양과 소프트웨어 분석 도구를 활용하여 Golgi 소기관의 구조와 기능을 연구할 수 있습니다.

이미징 센터의 형광 질량으로 Golgi 단백질의 양적 지역화

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