madSTORM을 이용한 T 세포의 고해상도 이미징

본 이미징 프로토콜의 전반적인 목표는 단분자 국소화 현미경법(single molecule localisation microscopy)을 사용하여 활성화된 T 세포 내의 여러 단백질을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 TCR 또는 마이크로클러스터 구성 성분의 단분자 분포와 같은 T 세포 활성화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 현재의 지도 학습 기반 솔루션 현미경법으로 달성한 것보다 더 높은 다중 분석(multiplexing)이 가능하다는 점입니다.

먼저, 제조사에서 제공한 라벨링 프로토콜에 따라 Alexa 647 항체 라벨링 키트를 사용하여 항체를 Alexa 647 염료와 직접 결합시킵니다. 라벨링된 항체를 20,800 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 응집된 항체를 제거하기 위해 상층액을 수집합니다. 다음으로, A12 커버슬립 챔버를 0.1% poly-l-lyzine 250 µL로 15분 동안 코팅합니다.

그런 다음, 헹구지 않고 용액을 흡입하여 제거한 후 65 degree celsius에서 30분 동안 챔버를 건조합니다. 1 PBS로 100 nanometer 형광 나노다이아몬드(FNDs) 희석액을 준비하며, 각 시야에서 충분한 FNDs가 관찰될 수 있도록 다양한 희석 배율을 테스트합니다. 희석된 FNDs를 1분 동안 볼텍싱합니다.

다음으로, FND 상층액을 고출력 설정에서 30초 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리된 FND 상층액을 poly-l-lyzine이 코팅된 A12 커버슬립 챔버에 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 1x PBS로 챔버를 5회 세척한 후, turf 현미경에서 647 nanometer 레이저 여기를 사용하여 FND가 코팅된 챔버를 시각화합니다.

61 by 61 micron 시야각을 가진 100x 대물렌즈를 사용하십시오. FND를 적절히 희석했을 때, 시야 내에 4개에서 10개의 개별 FND가 보여야 하며, 이미징 필드의 각 사분면에 최소 하나 이상의 FND가 존재해야 합니다. 적절한 FND 밀도가 확보되면, 각 웰에 250 microliters의 anti-CD3 항체를 첨가하십시오.

챔버를 37 °C에서 1시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 웰에서 용액을 제거하고 1x PBS를 30초 동안 첨가합니다. 이 세척 단계를 5회 반복합니다.

1 mL의 Jurkat T 세포를 800 ×g에서 6분 동안 원심분리합니다. 원심분리 전 Jurkat T 세포의 농도는 가급적 0.5~1 × 10⁶ cells/mL가 되어야 합니다. 세포를 300 µL의 1x HBS 용액에 재현탁합니다.

그동안 챔버의 각 웰에 1x HBS 용액 150 µL를 넣고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음, 재현탁된 Jurkat T 세포 50 µL를 각 웰에 넣고 37 °C에서 3분 동안 배양합니다. 이어서 4% paraformaldehyde 300 µL를 각 웰에 넣고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.

1x PBS로 3회 세척한 후, 0.1% Triton x 용액 250 microliters를 첨가하여 상온에서 5분 동안 세포를 투과화합니다. 1x PBS로 3회 추가 세척한 다음, 각 웰에 1% fish gelatin 용액 250 microliters를 첨가하고 상온에서 30분 동안 유지합니다. 마지막으로, 1x PBS로 세포를 3회 더 세척합니다.

고정된 세포에 0.1~0.5 $\mu$g/ml 농도의 표지 항체 200 $\mu$l를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킵니다. 1x PBS로 세포를 5회 세척한 후, STORM 버퍼 1ml를 첨가하고 노출을 제한하기 위해 챔버를 유리 커버슬립으로 덮습니다. 현미경 스테이지의 클램프를 사용하여 커버슬립 챔버를 제자리에 고정합니다.

여러 차례의 세척 및 배양 과정 이후에도 동일한 시야가 유지되어야 하므로, 이 단계는 대규모 멀티플렉싱에서 매우 중요합니다. turf 모드에서 647 nanometer 레이저 전력을 낮게 설정하여 시야 내에서 FND가 최소 3개 이상 염색된 세포를 찾으십시오. 이후 647 nanometer 레이저 전력을 높여 이미지를 획득하십시오.

일반적인 파라미터는 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 1x tris-buffered saline 또는 1x TBS로 세포를 5회 세척합니다. 그 다음, 용출 버퍼 1 mL를 첨가하고 상온에서 1분 동안 배양합니다.

용출 과정을 3회 반복하십시오. 각 항체에 대해 지정된 정확한 용출 조건과 신호가 제거되는 데 필요한 횟수만큼 용출 세척을 수행하십시오. 그 후, 1x TBS로 세포를 3회 세척하고 1x PBS 1 mL를 첨가하십시오.

이 용출 단계를 적절하게 수행하면 이전에 결합된 항체가 제거되어 이후의 항체 표지 효율을 높일 수 있습니다. 용출 단계 사이의 침전을 최소화하기 위해 세척 시 TBS를 사용하는 것이 중요합니다. 고출력의 647 nm 레이저를 사용하여 세포를 광퇴색시키고, 2~5 mW의 405 nm 레이저를 사용하여 암상태(dark state)에 있는 Alexa 647 염료를 광활성화하십시오.

용출되지 않은 항체의 잔여 신호가 모두 광퇴색될 때까지 기다립니다. 일반적으로 레이저 노출에 2~5초가 소요됩니다. 용출 및 광퇴색 후의 STORM 설정을 사용하여 샘플 이미지를 획득함으로써 신호가 제거되었는지 확인합니다.

다음으로, 4% paraformaldehyde 250 µL를 첨가하여 15분 동안 처리합니다. 이는 세포 내 고정된 분자들의 역가교를 방지합니다. 1x PBS로 세포를 세 번 세척합니다.

여러 표적을 순차적으로 라벨링하려면 이 단계들을 반복하십시오. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다중 표적 이미지 스택의 드리프트 보정 및 정렬을 수행합니다. 활성화된 Jurkat T 세포 내의 마이크로클러스터 및 기타 구조에 대한 다중 표적 MET STORM 이미지를 생성하기 위해 순차적 환상 및 정지법이 사용되었습니다.

최종 MET STORM 이미지는 평균 피듀셜 보정과 FND 피듀셜 마커를 사용하여 드리프트 및 정렬을 보정하였습니다. 여기에는 평균 피듀셜 보정을 이용한 드리프트 보정 전후에 30,000개의 이미지 프레임 내에 국소화된 단일 FND의 단일 분자 국소화 현미경 이미지가 나타나 있습니다. 마찬가지로, 여기에는 anti-phosphorelated SLP76 항체와 FND 피듀셜 마커로 염색된 활성화된 Jurkat T 세포의 단일 분자 국소화 현미경 이미지가 평균 피듀셜 보정을 이용한 드리프트 보정 전후의 상태로 나타나 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면 MET STORM을 사용하여 활성화된 T 세포 내 단백질의 다중 슈퍼 해상도 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 각 다중화 라운드당 3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 시료를 현미경 스테이지의 동일한 위치에 유지하는 것이 중요하다는 점을 유의하십시오.

이는 스테이지 클램프를 사용하여 수행할 수 있습니다. 변형된 STORM 버퍼를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 호흡기와 고글 같은 보호 장구를 착용해야 함을 잊지 마십시오.