Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

이 절차의 전반적인 목적은 줄기세포 이식 환경에서 키메리즘(chimerism)을 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 헤모글로빈 병증 환자의 조혈줄기세포 이식 생착과 같은 이식 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 유세포 분석 기반의 세포 분리, 컬럼 정보 분석 및 이어지는 짧은 반복 서열(short term repeats) 분석을 결합하여 적혈구 계통 전구세포의 증식과 분화를 평가할 수 있다는 점입니다.

이 기술의 함의는 이식편 하위 거부 반응 치료까지 확장되는데, 이는 질병 재발 가능성이 있는 환자를 식별하고 후속 면역 조절 전략을 수립하는 데 도움이 될 수 있기 때문입니다. 또한, 향후 임상 연구, 줄기세포 연구 및 피부 치료 임상 시험 설계에도 적용될 수 있습니다. 이 과정은 습득하기 어렵고 숙련된 전문가에 의해 수행되어야 하므로, 본 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

본 실험 과정은 저희 실험실의 테크니션인 Elisabeth Hoflehner가 시연하겠습니다. 먼저, 지방 염색을 위해 골수 샘플의 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 이를 위해 골수가 담긴 세포 스트레이너를 원심분리 튜브 위에 올리고 나사로 고정합니다.

시린지 플런저를 사용하여 조직 조각들을 메쉬 사이로 강제로 밀어 넣습니다. 모든 물질을 수집하기 위해 수 밀리리터의 현탁 완충액으로 헹굽니다. 원심 분리관에 3 mL의 밀도 구배 배지를 넣고, 그 위에 단일 세포 현탁액을 조심스럽게 층이 지도록 층적합니다.

튜브를 20 °C에서 550 G로 30분 동안 원심분리하며, 가속도는 9, 감속도는 0으로 설정합니다. 피펫을 사용하여 혈장과 혈소판이 포함된 상층액을 제거하되, 인터페이스의 단핵구 층이 흐트러지지 않도록 주의합니다. 이 단핵구 층을 원심분리 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 10 mL의 suspension buffer로 세포를 세척합니다. 튜브를 4 °C에서 250 G로 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고, 피펫팅을 통해 2 mL의 complete isokov's modified dulbecco's medium에 세포를 다시 현탁합니다.

헤모사이토미터로 세포 농도를 측정하려면, 96웰 플레이트에 2% trypan blue 염색액 95 µL를 넣습니다. 여기에 세포 현탁액 5 µL를 추가하고 잘 섞은 후 실온에서 잠시 동안 배양합니다. 헤모사이토미터를 채우고 현미경으로 관찰합니다.

염색된 생존 세포만 계수하십시오. 그 후, 세포 현탁액을 25°C에서 250 G로 10분 동안 원심분리하십시오. FC 수용체를 차단하려면 100 µL당 2.5 µg의 블록제를 사용하십시오.

얼음 위에서 10분에서 15분 동안 배양합니다. 세포 염색에 사용할 부피에 적합하도록 미리 적정된 단클론 항체 혼합물을 첨가합니다. 4°C의 암실에서 20분 동안 배양합니다.

세포를 3 mL의 염색 완충액으로 세척한 후 원심분리합니다. 세포 농도를 조절한 후, 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너(cell strainer)로 피펫팅하여 응집물을 제거하고 표준 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 그런 다음, 제조업체의 지침에 따라 세포 분리기(cell sorter)와 소프트웨어를 설정하고 최적화합니다.

전방 산란광(forward scatter, FSC) 및 측방 산란광(side scatter, SSC)을 표시하는 이변량 도표(bivariate plot)를 포함하는 템플릿을 설정하십시오. 관심 세포군을 적절한 범위에 배치하기 위해, 소터(sorter)에서 세포를 분석하고 FSC와 SSC를 조정하십시오. 먼저 음성 대조군 튜브의 데이터를 기록한 후, 각 단일 염색 보정 대조군 튜브의 데이터를 기록하고 보정값을 계산하십시오.

그 후, 림프구와 골수성 세포를 모두 포함하도록 실험 샘플을 FSC, SSC 이변량 도트 플롯(bivariate dot plot)으로 나타냅니다. FSC의 서로 다른 신호를 비교하여 더블렛(doublets)과 응집체를 제외하십시오. 그런 다음, CD45와 CD36을 발현하는 단일 세포를 이변량 도트 플롯으로 시각화합니다.

CD45 양성 이벤트는 백혈구와 그 전구세포를 나타냅니다. CD45 음성 및 CD36 양성 이벤트는 적혈구계 전구세포를 나타냅니다. CD36 양성 및 CD45 양성 세포를 정의하려면 게이팅 도구를 사용한 후, CD45 양성 이벤트와 CD34 및 SSC 파라미터를 표시하는 또 다른 도트 플롯을 시각화하십시오.

다음으로, 게이팅 도구를 사용하여 CD34 양성 세포 또는 백혈구 전구세포와 SSC high 세포 또는 다양한 분화 단계의 골수성 세포를 정의합니다. 그 후, 외부 수집 튜브로 분리하기 위한 게이트를 선택합니다. 마지막으로, 원하는 수의 세포를 얻을 때까지 4 °C에서 세포 분리를 계속합니다.

인간 재조합 에리트로포이에틴(erythropoietin) 또는 EPO가 첨가된 완전 IMDM 배지를 추가하여 세포를 희석합니다. 희석된 세포 300 µL를 3 mL의 H4434 배지로 옮기고 실온에서 5분 동안 흔들어주며 배양합니다. 다음으로, 35 mm 디쉬 3개에 세포 현탁액을 각각 1 mL씩 분주합니다.

배양 접시 두 개를 물이 채워진 세 번째 접시와 함께 100mm 플레이트에 넣습니다. 이 세포들을 습윤 인큐베이터에서 37°C, 5% CO₂ 조건으로 14일 동안 배양합니다. 40배율의 도립 현미경과 눈금 그리드가 표시된 배양 접시를 사용하여 콜로니의 형태에 따라 점수를 매깁니다.

콜로니 형성 단위 또는 CFU를 다능성 전구세포, 과립구 단핵구 전구세포, 적혈구 형성 단위 및 적혈구 콜로니 형성 단위 세포로 분류합니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 따라 fax 또는 CFU 분석 플레이트에서 세포를 회수하고 DNA 추출을 진행합니다. 세포를 원심분리한 후, 자동 혈액 DNA 분리 장치를 사용하여 펠렛에서 핵산을 분리합니다.

형광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정하십시오. 제조사의 지침에 따라 시료를 준비한 후, 형광 광도계의 시료 챔버에 시료를 넣으십시오. 매뉴얼에 따라 PCR 반응을 설정하기 위해 희석된 DNA를 DNA 중합효소, 프라이머 세트 및 반응 혼합물이 포함된 혼합액에 추가하십시오.

음성 대조군으로 공여자 및 수혜자의 이식 전 DNA와 뉴클레아제 프리 워터를 포함시키고, 9947A를 양성 대조군으로 사용합니다. PCR 결과를 분석하려면 변성된 DNA 시료 10 µL를 96웰 반응 플레이트의 웰에 첨가합니다. 플레이트를 밀봉하고 짧게 원심 분리한 후 얼음에 놓아 둡니다.

CD36 양성 및 CD45 항원 음성 집단으로 분리된 거핵구 및 적혈구 전구세포입니다. 추가적으로, CD45 양성 및 CD34 양성 세포는 림프구 및 골수구 전구세포로 식별하였으며, SSC 신호가 높은 CD45 양성 세포는 성숙한 골수구 세포로 식별하였습니다. 분리 후 적혈구 전구세포의 순도는 85% 이상이었으며, 골수구 세포의 순도는 95% 이상이었습니다. CD34 특이적 자성 비드로 분리한 골수 세포를 14일 동안 배양하였습니다.

이러한 세포 중 일부는 증식하고 분화하여 콜로니를 형성하는 것으로 보입니다. 다양한 농도의 EPO로 자극했을 때 확연히 붉은색을 띠는 적혈구 콜로니의 형성이 증가했습니다. 수혜자와 공여자의 DNA에 특이적인 짧은 반복 서열(STR)에 대한 PCR 분석을 통해 세포 내 키메라 현상을 검출할 수 있습니다.

이 방법은 골수 세포의 세포 분별법(cell sorting)을 통해 얻은 세포뿐만 아니라 클론 형성 분석(clonogenic assay)을 통해 얻은 세포 내의 수혜자 DNA와 공여자 DNA의 양을 성공적으로 측정하였습니다. 숙련된 상태에서 적절하게 수행한다면, 이 기술은 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 이 기술은 표준화되어야 하며 적절한 교육을 받은 인원에 의해 수행되어야 한다는 점을 유념하는 것이 중요합니다.

이 절차를 통해, 유전적으로 교정된 적혈구 줄기세포의 선택적 이점과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 잔류 공여자 유래 적혈구 전구세포를 추가로 분석할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 줄기세포 이식 분야의 연구자들은 적혈구 구획 내 전구세포의 증식과 분화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 헤모글로빈병 환자의 줄기세포 이식 후 생착을 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.