Name: Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: 학습하세요 조혈줄기세포 이식 후 키메리즘 모니터링 방법을 흔혈병증 환자에게 적용하는 기술입니다. 유세포분석 및 콜로니형성분석을 결합하여 적혈구계 전구세포의 증식과 분화를 평가하고 이식 성공률을 높입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 Kinderkrebshilfe의 무지개 Südtirol에 의해 지원 되었다.

1. 절연의 조 혈 골 수 세포 다중 매개 변수 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 <ol><li><ol><li>샘플 얼룩이 지는 프로세스를 시작 하기 전에, 다음 항목 수집 필요가 준비: <ol><li>12 x 75 m m 흐름 관 얼룩 세포</li> <li>단의 준비에 대 한 그라데이션 미디어 (GM), 50 mL 원뿔 튜브 셀</li> <li>얼룩 버퍼: 인산 염 (PBS) + 3% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 버퍼링</li> <li>펫 < /l 난 > <li>FC 블록 및 항 체 (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450 BD Biosciences) 얼룩. 이 형광 색소 조합으로 다른 채널에 무시할 일 좀 하지만 다른 적합 한 형광 색소 결합도 가능 하다.</li>
			<li>보상 구슬 (필요한 경우)</li>
			<li>정지 버퍼: 행 크 &#39; s 균형 소금 솔루션 (HBSS) + 25mm HEPES + 3 %FCS</li>
			<li>Trypan 블루와 hemocytometer</li>
			<li>컬렉션 튜브: 정렬된 셀의 컬렉션에 대 한 높은 혈 청 튜브 (1 mL FCS + 25mm HEPES 포함)와 함께 풍부한 매체를 사용할 수 있습니다.</li>
			<li>골 수 샘플: 엉덩이 뼈의 뒤쪽의 장 골도 머리에서 골 수 생 검에 대 한 동의 일반적으로 필요. 골 수 샘플은 보다 얼룩까지 RT에서 heparinized 주사기에 보관. 다음 프로토콜 단계 기관의 지침에 따라 수행 됩니다 &#39; 인간의 복지에 대 한 s 인간 연구 윤리 위원회.</li>
		</ol></li> <li>골 수 샘플의 단일 세포 현 탁 액을 생성. 원심 분리기 튜브에 GM의 3 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 GM 솔루션에 단일 세포 현 탁 액 4 mL 레이어. 20 ° 섭씨 (C)에서 30 분 550 g에서 원심 분리기 (브레이크 해제). 플라즈마 및 인터페이스에서 단 셀 레이어를 그대로 두고 살 균 피 펫을 사용 하 여 혈소판을 포함 하는 상위 계층의 그립니다. 살 균 피 펫을 사용 하 여 메 마른 분리기 관에 단 세포의 레이어를 전송.</li>
		<li>버퍼 얼룩 5 mL로 세척 후 resuspend 2 mL 정지 버퍼에서 셀 및 셀 농도 결정. 나사 모자 테스트 튜브에 세포 현 탁 액의 장소 5 µ L. 0.2 %Trypan 푸른 얼룩의 95 µ L를 추가 합니다. 철저 하 게 혼합. 실 온에서 5 분 동안 서 서 허용. 셀 계산 서 hemocytometer를 입력 합니다. 현미경으로 관찰 가능한 아닌 경우는 얼룩이 지 고 가능한 셀.</li>
		<li>20 ° C에서 10 분 동안 250 g에서 세포를 원심, 삭제는 상쾌한 고 100 µ L 당 최대 1 x 10 6의 농도에 버퍼를 얼룩에 셀 resuspend.</li>
		<li>블록 FcR 2.5 µ g 당 10-15 분에 대 한 얼음에 1 x 10 6 셀 Fc 블록 사용 하 여</li>
		<li>1 x 10 6 세포 얼룩을 어둠 속에서, 4 ° C에서 20 분 동안 품 어 추가 10 µ g mAb의 적절 한 조합 3 mL 버퍼 얼룩 세척 단계 옵니다. 정확한 보상에 대 한 셀 (또는 선호 보상 구슬)의 작은 aliquots는 물 들일 단일 항 체를 각; 흠 없는 남은 한 약 수.</li>
		<li>20 x 10 6 셀/ml 농도 조정.</li>
		<li>세트 고 셀 정렬 최적화. 교류 cytometer 및 소프트웨어를 설정 하는 프로세스는 회사에서 제공 하는 상세한 지침을 표준화 하 고 적절 하 게 훈련 된 직원에 의해 수행 되어야 할.</li>
	</ol></li> <li>정렬 셀 정렬 <ol><li>단계의 1.1.1.9 컬렉션 튜브 준비.</li>
		<li>이항 음모 앞으로 분산형 (FSC) 및 측면 살포 (SSC) 표시를 포함 하는 서식 파일 설정.</li>
		<li>셀을 실행 하 고 금감위/SSC 규모의 인구를 조정</li>
		<li>부정적인 제어 튜브 기록.</li>
		<li>실행 하는 단일 긍정적인 통제 관, 각 관에 대 한 데이터를 기록.</li>
		<li>수집 소프트웨어에서 제공 하는 기능으로 수동 또는 자동으로 보상을 계산.</li>
		<li>실험 샘플을 확보 하 고에 이항 FSC/SSC 점 ( 그림 1A) 림프 및 골수성 세포를 포함 하도록 게이트. FSC (즉, 높이, 너비, 및 지역)의 다른 신호를 비교 하 여 남자와 집계 제외 ( 그림 1B). CD45 및 CD36 표시 이항 도트에 내의 셀을 시각화 ( 그림 1C). CD45에 대 한 긍정적인 이벤트는 백혈구 (를 포함 하 여 그들의 창시자), 그 CD45에 대 한 부정적인 CD36에 대 한 긍정적인 erythroid 창시자는. CD45 + 세포 제어 도구 정의 CD36 + (해당 되는 경우,이 세포 분할 될 수 있다 더 높은 CD36에 및 셀 낮은 표현)를 사용 하 여. CD45 + 이벤트 CD34 및 SSC 매개 변수를 표시 하는 또 다른 점 음모에서를 시각화 합니다. 게이팅 CD34 + 세포 (백혈구 창시자) 및 SSC 높은 세포 (골수성 세포 감 별 법의 다양 한 단계에서) 정의 하는 도구를 사용 하 여.</li>
		<li>게이츠 결정 되었습니다, 일단 성문 외부 컬렉션 튜브에 정렬 선택할 수 있습니다.</li>
		<li>셀의 필요한 수를 얻을 때까지 4 ° C에서 정렬 진행</li>
		<li>정렬된 세포 인구 ( 그림 1E, 1F)의 순도 결정 하는 정렬 후 분석을 수행.</li>
	</ol></li></ol> 2. Clonogenic 분석 결과 <ol><li>시 약의 준비 다음 항목을 수집 하 고 준비 해야 하는 프로세스를 시작 하기 전에: <ol><li>펫, 100 mm 접시</li> <li>Trypan 블루와 hemocytometer</li> <li>다시 구성 0.1% 이상 포함 하는 메 마른 PBS 500ml U에서 인간 재조합 형 erythropoietin (EPO) 인간 혈 청 알 부 민. 작은 aliquots에이 솔루션을 분할 하 고 반복된 동결-해 동을 피하기 위해-20 ° C에서 유지.</li>
		<li>준비 완료 Iscove &#39; s 수정 Dulbecco &#39; 5 %FCS, 2mm 글루타민, 100 단위/mL 페니실린/스 (PS)의 최종 농도와 매체 (IMDM) s. 완전 한 IMDM 매체에 별도 우물에 다른 농도에서 재조합 인간 erythropoietin (EPO) 추가: 3 단위 6 단위 EPO/잘 12 EPO 단위/잘 EPO/잘 (1 배속, 2 배속, 4 x EPO 각각).</li>
	</ol></li> <li>골 수 세포의 준비 <ol><li>20 mL PBS에 희석 골 수 샘플의 10 mL은 천천히 두 단계 사이 명확한 인터페이스를 유지 하는 50 mL 원뿔 튜브에 15 mL 밀도 그라데이션 매체 위에 층이 nder 멸 균 조건입니다. 다음 9로 설정 하는 가속 및 감속 0 (또는 브레이크 해제)으로 설정 실 온 (RT)에서 30 분 동안 550 x g에서 15 mL 원뿔 튜브 원심.</li>
		<li>원심, 후 새로운 50 mL 튜브에 인터페이스를 제거 하 고 최종 볼륨 50 mL의 PBS를 추가.</li>
		<li>250 g 10 ° C에서 10 분 동안 원심 분리 후에 상쾌한을 제거 하 고 약 0.5 x 10 6 셀/mL에서 완전 한 IMDM 매체에 셀 resuspend. 세포 현 탁 액의 10 µ L를 microtube, Trypan 블루 솔루션 (0.4%)의 같은 양으로 혼합 그리고는 hemocytometer를 사용 하 여 계산.</li>
		<li>O선택적: CD34 + 세포 Milteny CD34 구슬 제조에 의해 주어진 지침에 따라 정렬 하는 자기 세포에 의해 풍성 하 게. 이 농축 단계의 주요 장점은 50 ng/mL 줄기 세포 요소 (SCF), 20 ng/mL granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF), 20 ng/mL와 추가 반 고체 매트릭스에 재배 되는 조 혈 줄기 세포의 품질을 감지 하는 인터 루 킨-3 (3 일), 20 ng/mL 인터 루 킨-6 (일리노이-6), 20 ng/mL granulocyte 콜로 니 자극 인자 (G-CSF) 및 1.4에서 EPO의 3 다른 농도.</li>
		<li>희석 셀 0.1-0.15 x 10 6 단 셀/mL 또는 2 x 10 3 CD34 + 셀/mL 전체 IMDM 매체를 추가 하 여 보충 3 mL에 EPO 및 전송 300 µ L Methocult H4434 매체. 동요와 5 분 접시 3 짧은 보육 1, 1 시간 후 35 mm 접시에 mL. 2 제 3-물-로 가득 함께 이러한 문화 요리 100 mm 접시에 배치 됩니다.</li>
		<li>셀 5% CO 2 습도 37 ° C 배양 기에서 14 일에 대 한 교양.</li>
	</ol></li> <li>식민지의 분석 <ol><li>식민지는 득점 그리드로 표시 된 문화 접시에 40 배 확대에서 거꾸로 현미경으로 그들의 형태에 따라 주어진 다. 우리의 분석 결과에서는 콜로 니 형성 단위 (CFU) 4 종류로 분류 된다: multipotential 조상 세포 (CFU-GEMM), granulocyte-대 식 세포 조상 세포 (CFU-GM), 버스트 형성 단위-erythroid (BFU-E) 식민지 형성 단위-erythroid (CFU-E)입니다. 제조 업체를 참조 하십시오 &#39; 더 식민지 하위 분류에 대 한 지침 s.</li>
		<li>추가 분석을 위해 셀 CFU 시험 접시에서 복구 별도로 4 범주에 따라 4 mL 실내 온도 2%를 포함 하는 PBS에 일시 중단 하 여 FCS/IMDM. 4 ° C에서 10 분 동안 400 g에서 원심 분리 후 세포는 PBS에 resuspended, 계산, 및 DNA 추출 처리.</li>
	</ol></li></ol> 3. Chimerism의 분석 <ol><li>DNA 고립 <li>10 분 400 g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은</li> <ol>
		<li>격리 DNA 혈액 DNA 추출 킷 (QIAmp DNA 혈액 추출 kit)를 사용 하 여. 미리 eluted DNA의 수율을 향상 시키기 위해 37 ° C에서 차입 버퍼 (AE)를 따뜻한.</li>
		<li>는 Nanodrop ND-1000 스펙트럼 photometer와 DNA 농도 측정합니다. 1.8-2.0 사이 OD 260/280 샘플 추가 분석을 위해 사용 됩니다.</li>
		<li>DNAase 무료 H 2 O 50 µ L의 전체 볼륨에 0.1 ng / µ L 희석 DNA.</li>
	</ol></li> <li>STR 분석 <ol><li>반응 혼합, AmplTaq 골드 DNA 중 합 효소 및 프로파일러 플러스 뇌관 세트 20 µ L 게놈 DNA를 혼합 하 여 PCR 반응 설정 (0.1 ng / µ L) 설명서에 따라 (뇌관 키트 포함는 레이블이 없는 뇌관 증폭 STR loci D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, 및 D7S820, 그리고 성별 마커 amelogenin 버퍼에). 부정적인 통제로 nuclease 무료 물 등 긍정적인 통제로 9947A. 기증자와 받는 사람 모두에서 사전 이식 DNA도 포함 되어 있습니다.</li>
		<li>Eppendorf mastercycler 그라디언트를 사용 하 여 다음 조건으로 수행 PCR 반응: 11 분 동안 95 ° C 1 분, 1 분, 1 분에 72 ° C 59 ° C 95 ° C의 28 증폭 주기 다음 45 분 동안 60 ° C</li>
		<li>세트 조각 최대 분석 반응 12 µ L을 추가 하 여 안녕-디 Formamid 및 0.5 µ L GeneScan 500를 이용한 크기 표준 (모든 적용 농) PCR 제품의 1 µ L를. 첫 번째 및 마지막 위치에 사다리를 유전자 (Genotyper 앰프 플로리다 STR, 녹색 II 파란색과 노란색, 적용 농) 필요 하다.</li>
		<li>전기 악기와 전기 및 수집 시작.</li>
		<li>분석 Loci, 대립, 샘플 및 컨트롤 소프트웨어 13의 피크 높이.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Angelucci, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+thalassemia+major+and+sickle+cell+disease%3A+indications+and+management+recommendations+from+an+international+expert+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel.</a> Haematologica. 99, 811-820 (2014).</li>
<li>Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+thalassemia+and+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825(2012).</li>
<li>Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+chimerism+in+haemoglobinopathies%3A+from+risk+of+graft+rejection+to+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance.</a> Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).</li>
<li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+mixed+chimerism+in+patients+transplanted+for+the+treatment+of+thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia.</a> Blood. 87, 3494-3499 (1996).</li>
<li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+of+ex-thalassemic+patients+with+persistent+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation.</a> Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).</li>
<li>Kumar, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+prophylactic+ex+vivo+costimulated+donor+leukocyte+infusion+after+reduced-intensity+conditioned+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).</li>
<li>Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+follow-up+studies+of+recipients+of+T-cell+depleted+allogeneic+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow.</a> Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).</li>
<li>McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemopoietic+chimerism+following+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation.</a> Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).</li>
<li>Dewald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicenter+investigation+with+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+using+X-+and+Y-chromosome+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes.</a> Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).</li>
<li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitatively+different+red+cell%2Fnucleated+cell+chimerism+in+patients+with+long-term%2C+persistent+hematopoietic+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplantation+for+thalassemia+major+or+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease.</a> Haematologica. 96, 128-133 (2011).</li>
<li>Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+chimerism+between+nucleated+and+red+blood+cells+after+bone+marrow+transplantation+for+haemoglobinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Chimerism%22%5BJournal%5D)">Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies.</a> Chimerism. 2, 21-22 (2011).</li>
<li>Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+management+of+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplant+in+beta-thalassemia+major%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major.</a> Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).</li>
<li>Kimpton, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+DNA+profiling+employing+multiplex+amplification+of+short+tandem+repeat+loci%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci.</a> PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).</li>
<li>Centis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+erythroid+expansion+in+determining+the+extent+of+apoptosis+in+erythroid+precursors+in+patients+with+beta-thalassemia+major%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major.</a> Blood. 96, 3624-3629 (2000).</li>
<li>Miccio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+genetically+modified+erythroblastic+progenitors+leads+to+long-term+correction+of+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

현재 연구의 목적은 hemoglobinopathies 치료 분석 기증자/받는 사람 chimerism erythroid 창시자 HSCT 환자에서 다음에 대 한 관객에 게 두 가지 방법의 조합을 제공 하는: 1.) 형광 활성화 된 세포 분류 조상 조 혈 모 세포 골 수 샘플 짧은 탠덤 반복 및 2의 분석에 의해 다음에.) 콜로 니 형성 단위 성장, 골 수 세포의 다양 한 시 조 형식에 식민지의 분류 다음 짧은 탠덤 반복의 분석. 이 방법의 참신 개별 식민지에 기증자 또는 받는 사람 chimerism를 평가 하는 프로토콜에서 기술을 결합에 있다.
이 접근의 특별 한 중요성 hemoglobinopathies HSCT 환자 치료 후 혼합된 chimerism의 맥락에서 찾을 수 있습니다. 몇몇 학문은 설명 했다 erythroid의 전조 세포 혼합 조 혈 chimerism3, 긴-지속적인 안정에서 및 결과와 상관 관계가 기증자 골수성 세포의...

수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (HSCT)은 매우 손상에 대 한 90%의 질병-무료 생존 율을 달성 조 혈 시스템의 선천적인된 유전 질환의 다양 한 사용 가능한 유일한 치료 접근 및 생활 제한 환자1. 이 중요 한 치료 도구의 효능 중의 독성을 제한 하 여 최적화 된-이후의 regimens2, 이식 하지만 또한 개입 안정적인 이식 기능을 유지 하기 위한, 여는 정량의 가까운 모니터링 하 여 기증자 파생 셀3,,45.
완전 한 chimerism (CC) chimerism (MC) 혼합은 용어에 있을 때 기증자와 받는 사람 파생 셀 동시에 다양 한 반면 기증자 파생 된 세포에 의해 lymphohematopoietic 구획의 전체 교체를 의미 하는 일반적으로 비율입니다. 분할 chimerism (SC) 혼합된 chimerism erythroid 구획에서와 같은 단일 셀 계보에서 관찰의 동시 사용을 나타냅니다. 질병 재발 및 기증자 림프 구 혼합 또는 면역의 감소 등 시작 이후 immunomodulatory 전략 취약 환자를 식별할 수 있습니다 그것으로 chimerism 상태 HSCT 다음의 신속한 결정이 중요, 치료6.
HSCT 후 engraftment를 모니터링 하기 위한 여러 가지 방법이 개발 되었습니다. 면역 글로불린의 Isotyping 및 세포 유전학 분석 가난한 감도 있고 다형성7,8감지 하는 그들의 능력에서 제한 됩니다. 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)의 소개 chimerism HSCT, 후 모니터링에서 감도 향상 시킬 수 있습니다 하지만 섹스 불일치 이식9로 제한 됩니다. 현재, 연쇄 반응 (PCR) chimerism를 검색 하는 데 사용 가장 광범위 한 방법 이며 변수 번호 탠덤 반복 (VNTRs)의 전통적인 agarose-아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법에 따라 또는 짧은 탠덤 반복 (STRs). 일상적으로 사용 양이 많은 PCR는 HSCT 다음 잔여 기증자 세포의 아주 작은 비율을 감지 수 있습니다. 지금까지 연구의 주요 한계는 MC 탐지 nucleated 세포 보다는 성숙 적혈구의 존재로 거의 독점적으로 제한, 즉 그 환자에 대 한 기능적으로 중요 한 영향을 받는 hemoglobinopathies 세포. 환자에서 다른 혈액 그룹, 그것은 cytofluorometric 분석은 단일 클론 항 체는 적혈구 항 원 ABO와 C, c, D, E 및 e10 으로 이동 하 여 적혈구에서 chimerism를 식별할 수 있게 기억할 만한 가치가 , 11. erythroid 계보에서 chimerism 평가의 서로 다른, 하지만 매우 재미 있는 의미는 흐름 cytometric clonogenic 분석 실험, 배양에 의해 erythroid 창시자 및 다양 한 erythroid 조상 종류의 정렬의 조합 다음 STR12의 분석. 이 방법은 erythroid 구획에서 기증자와 받는 사람 chimerism의 상대 비율을 정할 수 이며 골 수 이식 유지 전략에 활용 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE 헬스케어</td><td>GE17-1440-02&nbsp;</td><td>RBC 제거</td></tr><tr><td>50mL 원뿔형 튜브</td><td>, Falcon</td><td>14-432-22</td>, <td>시료 준비</td></tr>, <tr><td>12 x 75mm 유동 튜브</td><td>, Falcon</td><td>352002</td>, <td>FACS 분류</td></tr><tr><td>, 인산염 완충 식염수</td>, <td>Gibco</td><td>10010023</td><td>PBS,</td></tr><tr><td>태아 종아리 혈청</td>, <td>Invitrogen Inc.</td><td>16000-044</td><td>FCS (열 불활성화)</td></tr> <tr><td>CD34 APC</td><td>BD 생명 과학</td><td>561209</td><td>FACS-Ab</td></tr><tr><td>CD36 FITC</td><td>BD 생명 과학</td><td>555454</td><td>FACS-Ab</td></tr><tr><td>CD45 V450</td><td>BD 생명 과학</td><td>642275</td><td>FACS-Ab</td></tr><tr><td>Trypan 블루</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>혈구 측정기 Invitrogen</td><td>Inc.</td><td>C10227</td><td>행크 자동 셀 카운</td></tr><tr><td>팅 s Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Suspension buffer in FACS analysis</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Element of suspension buffer</td></tr><tr><td>FcR</td><td>BD Bioscience</td><td>564220</td><td>Block FCR</td></tr><tr><td>FACS Aria I</td><td>BD Bioscience</td><td>23-11539-00</td><td>FACS Sorter</td></tr><tr><td>Recombinant&nbsp; human erythropoietin</td><td>Affimetrix eBioscience</td><td>14-8992-80</td><td>EPO</td></tr><tr><td>이소코브 s 수정된 둘베코' s Medium</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td>IMDM</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>배양 성분</td></tr><tr><td>CD34+ 자석 비드</td><td>Milteny Biotech</td><td>130-046-702</td><td>CD34+ 정제</td></tr><tr><td>재조합&nbsp; 인간 G-CSF</td><td>Gibco</td><td>PHC2031</td><td>CFU-Assay</td></tr><tr><td>재조합&nbsp; 인간 SCF</td><td>Gibco</td><td>CTP2113</td><td>CFU-Assay</td></tr><tr><td>재조합&nbsp; 인간 GM-CSF</td><td>Gibco</td><td>PHC2015</td><td>CFU-Assay</td></tr><tr><td>재조합&nbsp; 인간 IL-3</td><td>BD Bioscience</td><td>554604</td><td>CFU-Assay</td></tr><tr><td>재조합&nbsp; 인간 IL-6</td><td>BD Bioscience</td><td>550071</td><td>CFU-Assay</td></tr><tr><td>Methocult H4434 Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4444</td><td>CFU-Assay</td></tr><tr><td>QiAmp DNA 혈액 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>DNA Isolation</td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000 스펙트럼 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND 1000</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>DNAase free H2O</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEREN0521</td><td>DNA Preparation</td></tr><tr><td>AmplTaq Gold DNA Polymerase</td><td>Applied Bioscience</td><td>N8080240</td><td></td></tr><tr><td>PCR Eppendorf mastercycler gradient</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td>PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamid</td><td>응용 생명 과학</td><td>4311320</td><td>PCR</td></tr><tr><td>GeneScan 500 ROX 크기 표준</td><td>응용 생명 과학</td><td>4310361</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3130 유전자 분석기</td><td>응용 생명 과학</td><td>313001R</td><td>PCR</td></tr></tbody></table>

hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 erythroid 조상 세포의 검출

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

불완전 한 chimerism의 존재는 환자 thalassemia 메이저에 대 한 골 수 이식 또는 낫 세포 질병의 큰 비율에 기록 됩니다. 이 관찰으로 후속 치료 immunomodulation 전략 임상 결과 향상 시킬 수 있는 엄청난 의미를 갖는다. 통상, 짧은 탠덤 반복의 중 합 효소 연쇄 반응에 기초를 둔 분석 혈액 세포 기증자 파생 된 chimerism를 식별 하는 데 사용 됩니다. 그러나,이 메서드는 nucleated 세포에 제한 이며 천연된 단 세포 계보를 구분할 수 없습니다. 우리는 짧은 탠덤 반복 조 혈 조상 cytometric 정렬 셀 흐름의 분석을 적용 하 고이 짧은 탠덤 반복 선택 된 버스트 형성 단위-erythroid 식민지에서에서 얻은 두 뼈에서 수집 된의 분석에 비해 수입니다. 이 방법으로 우리는 서로 다른 확산 및 erythroid 구획에 기증자 세포의 수 있습니다. 이 기술은 설정 줄기 세포 이식에서 chimerism의 전류 모니터링 완료 수 이며 따라서 적용된 미래에 임상 연구, 줄기 세포 연구 그리고 유전자 치료 실험의 디자인 수 있습니다.

FACS 셀 정렬 lymphohematopoietic 창시자의 분리
우리 여기에서 다운스트림 STR 분석에 필요한 세포 인구를 정렬 결과 보여 줍니다. 골 수 세포 V450 활용 된 안티-CD45, FITC 활용 된 안티-CD36와 APC 활용 된 안티-CD34 얼룩이 있었다. 관심의 인구는 megakaryocyte erythroid 창시자 (MEP), nucleated 세포 적혈구의 개발에 대 한 책임 이다. 이러한 셀 CD36, 표현 하지만 백혈구 공통 항 원 CD45에 대 한 부정적 (그림 1C). 필요한 경우 이러한 셀 수 더 분화 될 따라 CD36 식 수준에. 몇 가지 추가 인구 컨트롤을 정렬할 수 있습니다. 우리는 성숙한 골수성 세포 (<strong class="xfig...

기증자에서 파생 된 셀의 정량화는 engraftment hemoglobinopathies 환자에 줄기 세포 이식 후 모니터링 해야 합니다. 교류 cytometry 기반 셀 정렬, 식민지 대형 분석 결과, 및 짧은 탠덤 반복 확산을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다의 후속 분석 및 erythroid 구획에 창시자의 차별화의 조합입니다.

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

이 절차의 전반적인 목적은 줄기세포 이식 환경에서 키메리즘(chimerism)을 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 헤모글로빈 병증 환자의 조혈줄기세포 이식 생착과 같은 이식 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 유세포 분석 기반의 세포 분리, 컬럼 정보 분석 및 이어지는 짧은 반복 서열(short term repeats) 분석을 결합하여 적혈구 계통 전구세포의 증식과 분화를 평가할 수 있다는 점입니다.이 기술의 함의는 이식편 하위 거부 반응 치료까지 확장되는데, 이는 질병 재발 가능성이 있는 환자를 식별하고 후속 면역 조절 전략을 수립하는 데 도움이 될 수 있기 때문입니다. 또한, 향후 임상 연구, 줄기세포 연구 및 피부 치료 임상 시험 설계에도 적용될 수 있습니다. 이 과정은 습득하기 어렵고 숙련된 전문가에 의해 수행되어야 하므로, 본 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.본 실험 과정은 저희 실험실의 테크니션인 Elisabeth Hoflehner가 시연하겠습니다. 먼저, 지방 염색을 위해 골수 샘플의 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 이를 위해 골수가 담긴 세포 스트레이너를 원심분리 튜브 위에 올리고 나사로 고정합니다.시린지 플런저를 사용하여 조직 조각들을 메쉬 사이로 강제로 밀어 넣습니다. 모든 물질을 수집하기 위해 수 밀리리터의 현탁 완충액으로 헹굽니다. 원심 분리관에 3 mL의 밀도 구배 배지를 넣고, 그 위에 단일 세포 현탁액을 조심스럽게 층이 지도록 층적합니다.튜브를 20 °C에서 550 G로 30분 동안 원심분리하며, 가속도는 9, 감속도는 0으로 설정합니다. 피펫을 사용하여 혈장과 혈소판이 포함된 상층액을 제거하되, 인터페이스의 단핵구 층이 흐트러지지 않도록 주의합니다. 이 단핵구 층을 원심분리 튜브로 옮깁니다.다음으로, 10 mL의 suspension buffer로 세포를 세척합니다. 튜브를 4 °C에서 250 G로 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고, 피펫팅을 통해 2 mL의 complete isokov's modified dulbecco's medium에 세포를 다시 현탁합니다.헤모사이토미터로 세포 농도를 측정하려면, 96웰 플레이트에 2% trypan blue 염색액 95 µL를 넣습니다. 여기에 세포 현탁액 5 µL를 추가하고 잘 섞은 후 실온에서 잠시 동안 배양합니다. 헤모사이토미터를 채우고 현미경으로 관찰합니다.염색된 생존 세포만 계수하십시오. 그 후, 세포 현탁액을 25°C에서 250 G로 10분 동안 원심분리하십시오. FC 수용체를 차단하려면 100 µL당 2.5 µg의 블록제를 사용하십시오.얼음 위에서 10분에서 15분 동안 배양합니다. 세포 염색에 사용할 부피에 적합하도록 미리 적정된 단클론 항체 혼합물을 첨가합니다. 4°C의 암실에서 20분 동안 배양합니다.세포를 3 mL의 염색 완충액으로 세척한 후 원심분리합니다. 세포 농도를 조절한 후, 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너(cell strainer)로 피펫팅하여 응집물을 제거하고 표준 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 그런 다음, 제조업체의 지침에 따라 세포 분리기(cell sorter)와 소프트웨어를 설정하고 최적화합니다.전방 산란광(forward scatter, FSC) 및 측방 산란광(side scatter, SSC)을 표시하는 이변량 도표(bivariate plot)를 포함하는 템플릿을 설정하십시오. 관심 세포군을 적절한 범위에 배치하기 위해, 소터(sorter)에서 세포를 분석하고 FSC와 SSC를 조정하십시오. 먼저 음성 대조군 튜브의 데이터를 기록한 후, 각 단일 염색 보정 대조군 튜브의 데이터를 기록하고 보정값을 계산하십시오.그 후, 림프구와 골수성 세포를 모두 포함하도록 실험 샘플을 FSC, SSC 이변량 도트 플롯(bivariate dot plot)으로 나타냅니다. FSC의 서로 다른 신호를 비교하여 더블렛(doublets)과 응집체를 제외하십시오. 그런 다음, CD45와 CD36을 발현하는 단일 세포를 이변량 도트 플롯으로 시각화합니다.CD45 양성 이벤트는 백혈구와 그 전구세포를 나타냅니다. CD45 음성 및 CD36 양성 이벤트는 적혈구계 전구세포를 나타냅니다. CD36 양성 및 CD45 양성 세포를 정의하려면 게이팅 도구를 사용한 후, CD45 양성 이벤트와 CD34 및 SSC 파라미터를 표시하는 또 다른 도트 플롯을 시각화하십시오.다음으로, 게이팅 도구를 사용하여 CD34 양성 세포 또는 백혈구 전구세포와 SSC high 세포 또는 다양한 분화 단계의 골수성 세포를 정의합니다. 그 후, 외부 수집 튜브로 분리하기 위한 게이트를 선택합니다. 마지막으로, 원하는 수의 세포를 얻을 때까지 4 °C에서 세포 분리를 계속합니다.인간 재조합 에리트로포이에틴(erythropoietin) 또는 EPO가 첨가된 완전 IMDM 배지를 추가하여 세포를 희석합니다. 희석된 세포 300 µL를 3 mL의 H4434 배지로 옮기고 실온에서 5분 동안 흔들어주며 배양합니다. 다음으로, 35 mm 디쉬 3개에 세포 현탁액을 각각 1 mL씩 분주합니다.배양 접시 두 개를 물이 채워진 세 번째 접시와 함께 100mm 플레이트에 넣습니다. 이 세포들을 습윤 인큐베이터에서 37°C, 5% CO₂ 조건으로 14일 동안 배양합니다. 40배율의 도립 현미경과 눈금 그리드가 표시된 배양 접시를 사용하여 콜로니의 형태에 따라 점수를 매깁니다.콜로니 형성 단위 또는 CFU를 다능성 전구세포, 과립구 단핵구 전구세포, 적혈구 형성 단위 및 적혈구 콜로니 형성 단위 세포로 분류합니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 따라 fax 또는 CFU 분석 플레이트에서 세포를 회수하고 DNA 추출을 진행합니다. 세포를 원심분리한 후, 자동 혈액 DNA 분리 장치를 사용하여 펠렛에서 핵산을 분리합니다.형광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정하십시오. 제조사의 지침에 따라 시료를 준비한 후, 형광 광도계의 시료 챔버에 시료를 넣으십시오. 매뉴얼에 따라 PCR 반응을 설정하기 위해 희석된 DNA를 DNA 중합효소, 프라이머 세트 및 반응 혼합물이 포함된 혼합액에 추가하십시오.음성 대조군으로 공여자 및 수혜자의 이식 전 DNA와 뉴클레아제 프리 워터를 포함시키고, 9947A를 양성 대조군으로 사용합니다. PCR 결과를 분석하려면 변성된 DNA 시료 10 µL를 96웰 반응 플레이트의 웰에 첨가합니다. 플레이트를 밀봉하고 짧게 원심 분리한 후 얼음에 놓아 둡니다.CD36 양성 및 CD45 항원 음성 집단으로 분리된 거핵구 및 적혈구 전구세포입니다. 추가적으로, CD45 양성 및 CD34 양성 세포는 림프구 및 골수구 전구세포로 식별하였으며, SSC 신호가 높은 CD45 양성 세포는 성숙한 골수구 세포로 식별하였습니다. 분리 후 적혈구 전구세포의 순도는 85% 이상이었으며, 골수구 세포의 순도는 95% 이상이었습니다. CD34 특이적 자성 비드로 분리한 골수 세포를 14일 동안 배양하였습니다.이러한 세포 중 일부는 증식하고 분화하여 콜로니를 형성하는 것으로 보입니다. 다양한 농도의 EPO로 자극했을 때 확연히 붉은색을 띠는 적혈구 콜로니의 형성이 증가했습니다. 수혜자와 공여자의 DNA에 특이적인 짧은 반복 서열(STR)에 대한 PCR 분석을 통해 세포 내 키메라 현상을 검출할 수 있습니다.이 방법은 골수 세포의 세포 분별법(cell sorting)을 통해 얻은 세포뿐만 아니라 클론 형성 분석(clonogenic assay)을 통해 얻은 세포 내의 수혜자 DNA와 공여자 DNA의 양을 성공적으로 측정하였습니다. 숙련된 상태에서 적절하게 수행한다면, 이 기술은 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 이 기술은 표준화되어야 하며 적절한 교육을 받은 인원에 의해 수행되어야 한다는 점을 유념하는 것이 중요합니다.이 절차를 통해, 유전적으로 교정된 적혈구 줄기세포의 선택적 이점과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 잔류 공여자 유래 적혈구 전구세포를 추가로 분석할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 줄기세포 이식 분야의 연구자들은 적혈구 구획 내 전구세포의 증식과 분화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 헤모글로빈병 환자의 줄기세포 이식 후 생착을 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

detection-residual-donor-erythroid-progenitor-cells-after

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

직접 갓 수확 마우스 골수, 비장이나 태아의 간장에서 분화 단계 특정 murine erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질의 식별 및 분자 분석을 위해 흐름 cytometric 방식입니다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119 및 셀 크기에 의존합니다.

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

배아줄기세포(ESC)를 분화할 때 시간적 유전자 발현을 조작하는 것은 유도성 유전자 시스템을 사용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이러한 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 이 프로토콜은 ES 유래 세포를 분화시키고 다운스트림 조혈 분화에 대한 후속 분석에서 전이유전자의 빠른 발현을 달성합니다.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

이 프로토콜은 세포 분류에 의한 줄기세포의 사전 정제 없이 조혈 줄기세포/전구 세포 기능을 연구하기 위해 경쟁력 있는 마우스 골수 이식 실험을 설정하기 위한 단계별 지침을 제공합니다.

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

우리는 유전자 조작된 조 혈 모 세포의 악성 잠재력을 평가 하기 위해 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)의 사용을 설명 합니다. HSCT 소설 치료를 평가 하 형성 증후군 (MDS) 또는 백혈병 생쥐의 대형 코 호트 생성 뿐만 아니라 다양 한 악성 조 혈 모 세포에 vivo에서 평가 대 한 유용 합니다.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

우리는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)의 분리를 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.

장기 및 단기 조혈모세포의 분리 방법

여기서, 우리는 손상된 조혈 및 면역 체계의 재건을 위해 치료용 조혈 줄기세포/전구 세포를 수확하기 위해 뼈 형태 유전 단백질-2 로딩 젤라틴 골격에 의해 유발되는 생체 내 골 오가노이드를 확립했습니다. 전반적으로 이 접근법은 세포 치료를 위한 유망한 세포 공급원을 제공할 수 있습니다.

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

적혈구 모델링은 이 과정에서 행위자의 생물학적 중요성을 이해하고 분화 결함을 완화할 수 있는 새로운 치료 접근법을 평가할 수 있는 귀중한 기회를 제공합니다. 여기에서는 CD34+ 조혈모세포와 전구세포를 체외에서 효율적으로 구별할 수 있는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.

In vitro 및 ex vivo human erythropoiesis의 효율성을 평가하기 위한 포괄적인 파이프라인

학습하세요 조혈줄기세포 이식 후 키메리즘 모니터링 방법을 흔혈병증 환자에게 적용하는 기술입니다. 유세포분석 및 콜로니형성분석을 결합하여 적혈구계 전구세포의 증식과 분화를 평가하고 이식 성공률을 높입니다.

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

더 많은 동영상 탐색