기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

본 절차의 전반적인 목표는 두 가지 서로 다른 종류의 태아 줄기세포로부터 에피솜 재프로그래밍을 통해 유도만능줄기세포를 효율적으로 유도하는 것입니다. 이 방법은 조직 공학, 질환 모델링, 기초 연구 또는 종단 연구를 위한 만능줄기세포 공급원을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 iPSC의 재프로그래밍과 성숙이 화학적으로 정의된 조건에서 이루어지며, 잠재적인 소아 세포 기반 치료를 위해 조기에 확보 가능하다는 점입니다.

본 절차의 시연은 책임 연구자인 Steven McClellan과 제가 진행하겠습니다. 출산 후 가능한 한 빨리 태반을 확보하십시오. 양막을 9cm² 크기의 분절로 절단한 후, 항생제 및 항진균제 솔루션이 첨가된 PBS 30mL가 담긴 50mm 원심분리 튜브에서 세척하십시오.

막에서 혈전물을 제거한 후, 미세 메스 한 쌍을 사용하여 멸균된 10-centimeter 조직 배양 접시에서 막을 미세한 조각으로 잘게 다집니다. 메스 날을 사용하여 다져진 막 조직 덩어리를 4.7 milliliters의 RPMI-1640 배지가 들어 있는 조직 해리 튜브 하나로 옮깁니다. 해리 효소를 넣어 섞습니다.

튜브를 조직 해리기에 장착하고 h_tumor_01 프로그램을 실행합니다. 그런 다음 튜브를 로킹 플랫폼(rocking platform) 위에서 37 °C로 30분 동안 배양합니다. 현탁액을 35 mL의 RPMI-1640으로 추가 희석한 후, 50 mL 원심분리 튜브 위에 놓인 70 µm 스트레이너에 통과시킵니다.

상온에서 200 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 펠렛을 5 mL의 RPMI-1640에 재현탁하고 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 항생제 및 항진균제 솔루션이 첨가된 갓 제조한 AFMC 배지가 담긴 조직 배양 플라스크에 세포 클러스터 형태로 cm²당 약 10,000개의 세포 밀도로 분주합니다.

T75 플라스크 1개에 들어있는 세포 시트에 세포 분리 효소 2 mL를 첨가하여 리프로그래밍을 위한 저계대 양수 및 양막 줄기세포를 수확합니다. 37°C에서 5~8분 동안 배양합니다. 200 ×g에서 45분 동안 원심분리한 후, 펠렛을 1 mL의 PBS에 재부유시키고 잘 섞어 혈청 성분을 세척합니다.

헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 그 다음 세포 밀도를 PBS 1mL당 100,000 cells가 되도록 조정하고, 1.5mL 마이크로원심분리 튜브에 4등분하여 분주합니다. 일반적인 스윙 버킷 로터에서 원심분리가 가능하도록 마이크로원심분리 튜브를 5mL 폴리스티렌 튜브에 넣고, 상온에서 200 ×g로 4분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후 튜브를 뒤집어 상층액을 폐기물 용기에 버리고, 200 ×g에서 3분 동안 추가 원심분리 단계를 수행합니다. 원심분리가 끝나면 200 µL 피펫을 사용하여 튜브에 남아 있는 액체를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. transfection 팁, 튜브, 재현탁 완충액 및 전해질 완충액을 조직 배양 캐비닛에 넣습니다.

트랜스펙션 장치를 가까이 이동시켜 튜브 스테이션을 캐비닛 안에 직접 배치하십시오. 트랜스펙션 튜브 하나에 전해질 버퍼 3 mL를 채우고, 튜브를 슬롯 끝까지 밀어 넣어 스테이션에 장착하십시오. 이전에 준비하여 -80 °C 보관함에 넣어두었던 리프로그래밍 플라스미드 용액 분주액을 꺼내어, 배양 캐비닛 내 실온에서 해동시키십시오.

장치에서 transfection 파라미터를 950 V에서 40 ms 동안 1회 펄스가 전달되도록 설정하십시오. 100,000개의 세포가 포함된 펠릿을 10 µL의 재현탁 버퍼에 재현탁하십시오. 신속하게 작업을 진행하여, 재현탁된 세포에 리프로그래밍 플라스미드 용액의 1/10을 첨가하십시오.

트랜스펙션 팁을 트랜스펙션 피펫에 장착합니다. 그런 다음 공기 방울이 생기지 않도록 주의하며 세포 현탁액을 트랜스펙션 팁으로 흡입합니다. 트랜스펙션 피펫을 트랜스펙션 튜브에 삽입합니다.

트랜스펙션 장비 화면의 시작 버튼을 누릅니다. 트랜스펙션 성공 여부에 관한 화면 메시지가 나타날 때까지 기다립니다. 그 후 즉시 튜브에서 피펫을 제거합니다.

현탁액을 대상 6-웰 플레이트의 한 웰에 분주합니다. 인접한 웰의 배지와 혼합한 후, 현탁액을 두 웰에 동일하게 나누어 분배합니다. 세포가 들어 있는 각 마이크로원심분리 튜브에 대해 트랜스펙션을 반복합니다.

먼저 5개의 PCR 튜브에 0.5 millimolar EDTA 30 µL와 PBS를 첨가합니다. 그런 다음 2 µL로 설정한 10 µL 피펫에 팁을 장착합니다. 피펫 팁을 콜로니 가장자리에 비스듬히 대고, 표면에서 콜로니 전체를 조심스럽고 서서히 긁어냅니다.

즉시 콜로니 전체를 피펫 팁으로 흡입하여 EDTA가 들어 있는 준비된 PCR 튜브 중 하나로 옮깁니다. 다른 4개의 콜로니에 대해 이 과정을 반복한 후, 실온에서 4~6분 동안 배양합니다. 더 큰 피펫 팁을 사용하여 각 세포 현탁액을 부드럽게 파이펫팅함으로써 콜로니를 더 작은 덩어리로 분쇄합니다.

단일 세포 현탁액을 만들지 않도록 주의하십시오. 그런 다음, 현탁액을 recombinant vitronectin이 코팅된 24-well 플레이트의 대상 웰에 직접 분주하십시오. 나머지 콜로니에 대해 이 과정을 반복한 후, 3~6일 동안 배양하십시오.

4~6일 후, 콜로니가 성장하여 조밀해지면 세포 시트를 300 µL의 0.5 mM EDTA로 세척한 후 즉시 흡입하여 제거합니다. 그다음 300 µL를 추가로 넣고 상온에서 5분 동안 배양합니다. EDTA를 흡입하여 제거한 후, 1 mL 피펫을 최대 용량으로 설정하고 1 mL wide bore tip을 장착하여 vitronectin이 코팅된 6-well plate의 대상 웰에서 E8 배지를 흡입합니다.

배지를 소스 플레이트의 웰 하나에 분사하여 iPSC 배양물을 씻어냅니다. 그런 다음 현탁액을 타겟 웰로 옮기고, 피펫팅을 여러 번 반복하여 콜로니를 20~40개의 세포 덩어리로 분리합니다. 모든 세포를 분주한 후, 플레이트를 부드럽게 흔들어 덩어리들이 고르게 분포되도록 합니다.

그런 다음 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 클럼프 부착과 콜로니 성장을 유도합니다. 리프로그래밍을 위한 소스 세포인 양수 및 양막 줄기세포는 길쭉하고 위상차 현미경 상에서 밝게 보이는 전형적인 중간엽 형태를 나타냅니다. 이 세포들은 중간엽-상피 전이를 거치며 상피 특성을 획득하게 되며, 이는 자갈 모양의 세포들로 구성된 콜로니 형성으로 이어집니다.

이러한 콜로니들은 증식하여 MET 세포의 불규칙한 세포 덩어리를 형성합니다. 리프로그래밍의 후기 단계에서는 완전히 리프로그래밍된 세포의 콜로니가 나타나며, 이들은 경계가 뚜렷하고 개별적으로 구별 가능한 세포들입니다. 이러한 완전히 리프로그래밍된 세포들은 더 많은 수의 MET 콜로니와 함께 존재합니다.

완전히 리프로그래밍된 단리 성숙 클론이 여기에 제시되어 있습니다. iPSC 유도 및 성숙 과정 이후, 이들은 상세한 특성 분석을 거칠 수 있으며 다양한 세포 유형으로의 분화를 유도할 수 있습니다. 병원균 존재 여부가 테스트되지 않은 인체 조직을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구 착용 및 생물안전작업대 내 작업과 같은 예방 조치를 취해야 함을 유의하십시오.

이 영상을 시청한 후, 귀하는 태아 줄기세포에서 다분화능을 유도하는 방법, 사용할 시약 및 장비, 그리고 다분화능 줄기세포를 일상적으로 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.