기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

이 절차의 전반적인 목표는 두 가지 다른 종류의 태아 줄기 세포에서 일회 재프로그래밍을 통해 유도 만능 줄기 세포를 효율적으로 유도하는 것입니다. 이 방법은 조직 공학, 질병 모델링, 기초 연구 또는 종단 연구를 위한 만능 줄기 세포의 공급원을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 iPSC의 재프로그래밍과 성숙이 화학적으로 정의된 조건에서 이루어지면서 잠재적인 소아 세포 기반 치료에 조기에 사용할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 수석 연구원인 Steven McClellan과 저입니다. 출생 후 가능한 한 빨리 태반을 확보하십시오. 양막의 9제곱센티미터 분절을 자르고 항생제, 항진균 용액이 보충된 PBS 30밀리리터가 있는 50밀리미터 원심분리기 튜브로 세척합니다.

멤브레인에서 혈전을 제거한 다음 한 쌍의 미세한 메스를 사용하여 10cm 멸균 조직 배양 접시에서 멤브레인을 미세한 조각으로 다집니다. 메스 날을 사용하여 다진 막 조직 덩어리를 4.7ml의 RPMI-1640 배지가 들어 있는 하나의 조직 해리 튜브로 옮깁니다. 해리 효소를 섞습니다.

튜브를 조직 해리기에 장착하고 프로그램 h_tumor_01 실행합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 흔들 플랫폼에서 30분 동안 튜브를 배양합니다. 35ml의 RPMI-1640으로 현탁액을 더 희석하고 50ml 원심분리기 튜브 위에 놓인 70미크론 스트레이너에 적용합니다.

실온에서 200 배 g에서 5 분 동안 원심 분리기. 상등액을 버린 후, 펠릿을 RPMI-1640 5ml에 재현탁시키고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 대략 10의 조밀도에 세포 송이의 세포를 씨를 뿌려서, 항생제, antimycotic 해결책으로 보충된 갓 준비한 AFMC 매체를 가진 조직 배양 플라스크로 평방 센티미터 당 세포를 씨를 뿌린다.

세포 시트에 2ml의 세포 분리 효소를 첨가하여 하나의 T75 플라스크에서 재프로그래밍을 위한 낮은 계경 수의 양수 및 막 줄기 세포를 수확합니다. 섭씨 37도에서 5-8분 동안 배양합니다. 200 배 g에서 45 분 동안 원심 분리 한 후 펠릿을 PBS 1 밀리리터에 재현탁시키고 잘 혼합하여 혈청 성분을 씻어 낸다.

혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 그런 다음 셀 밀도를 PBS 밀리리터당 100, 000 셀로 조정하고 이제 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 쿼드합니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 5ml 폴리스티렌 튜브에 넣어 일반 스윙 러더에서 원심분리를 하고 실온에서 4분 동안 200배 g으로 원심분리합니다.

탈수 후 튜브를 뒤집어 상층액을 폐기물 용기에 버리고 200 회 g에서 3 분 동안 추가 원심 분리 단계를 수행합니다. 탈수 후 200마이크로리터 피펫을 사용하여 튜브에 남아 있는 액체를 조심스럽게 흡입합니다. transfection 팁, 튜브, 재현탁액 및 전해 완충액을 조직 배양 캐비닛에 넣습니다.

튜브 스테이션을 캐비닛에 직접 배치할 수 있도록 transfection 장치를 가까이 이동합니다. 트랜스펙션 튜브 하나에 3ml의 전해 버퍼를 채우고 튜브를 슬롯 안쪽으로 끝까지 밀어 넣어 스테이션에 장착합니다. 이전에 준비된 재프로그래밍 플라스미드 용액의 부분 표본을 섭씨 영하 80도의 저장소에서 꺼내 배양 캐비닛에서 실온에서 해동시킵니다.

950볼트에서 40밀리초의 펄스를 한 번 전달하도록 장치에서 트랜스펙션 매개변수를 설정합니다. 100, 000 세포를 포함하는 펠렛을 10 마이크로리터의 재현탁액에 재현탁합니다. 빠르게 작업하여 재프로그래밍 플라스미드 용액의 1/10을 재현탁 세포에 추가합니다.

transfection 팁을 transfection 파이펫에 장착합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 형질 주입 팁으로 흡입하되 기포 형성을 조심스럽게 피합니다. transfection 피펫을 transfection tube에 삽입합니다.

그리고 transfection 장치의 화면에 있는 시작 버튼을 누릅니다. transfection의 성공에 대한 화면 메시지를 기다립니다. 그런 다음 즉시 튜브에서 피펫을 제거하십시오.

현탁액을 대상 6웰 플레이트의 한 웰로 배출합니다. 이웃 우물에서 매체를 섞고, 현탁액을 두 우물에 동등하게 배부하십시오. 세포가 있는 각 마이크로 원심분리 튜브에 대해 transfection을 반복합니다.

먼저 30마이크로리터의 0.5밀리몰 EDTA 및 PBS를 5개의 PCR 튜브에 추가합니다. 그런 다음 2마이크로리터로 설정된 10마이크로리터 피펫에 팁을 로드합니다. 피펫 끝을 군집 가장자리에서 비스듬히 잡고 조심스럽게 그리고 점차적으로 표면에서 전체 군체를 긁어냅니다.

즉시 전체 콜로니를 피펫 팁으로 흡인하고 EDTA가 있는 준비된 PCR 튜브 중 하나로 옮깁니다. 4개의 다른 군체로 이 과정을 반복한 후 실온에서 4-6분 동안 배양합니다. 더 큰 피펫 팁을 사용하여 각 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 콜로니를 더 작은 덩어리로 분해합니다.

단일 세포 현탁액을 생성하지 마십시오. 그런 다음 현탁액을 재조합 비트로넥틴으로 코팅된 24웰 플레이트의 타겟 웰에 직접 플레이트합니다. 나머지 군체에 대해 이 과정을 반복한 후 3-6일 동안 부화합니다.

4-6일 후 군집이 성장하고 조밀해지면 300마이크로리터의 0.5밀리몰 EDTA로 세포 시트를 세척하고 즉시 흡인합니다. 그런 다음 300마이크로리터를 더 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. EDTA를 흡입한 후 1ml 피펫을 용량으로 설정하고, 1ml 너비의 보어 팁에 장착하고, 비트로넥틴이 코팅된 6웰 플레이트의 타겟 웰에서 E8 배지를 흡입합니다.

소스 플레이트의 한 웰에서 배지 스트림을 분출하여 iPSC 배양을 씻어냅니다. 그런 다음 현탁액을 타겟 웰로 옮기고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 콜로니를 20-40개의 세포 덩어리로 분해합니다. 모든 세포를 도금한 후 플레이트를 부드럽게 흔들고 흔들어 덩어리가 고르게 분포되도록 합니다.

그런 다음 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어 덩어리 접착과 콜로니 성장을 위해 합니다. 재프로그래밍을 위한 소스 세포를 나타내는 양수 및 막 줄기 세포는 길쭉하고 위상적으로 밝은 전형적인 중간엽 형태를 나타냅니다. 세포는 중간엽에서 상피로의 전이를 거친 후 상피 특성을 획득하며, 이는 조약돌과 같은 세포를 가진 군체를 형성합니다.

이러한 군체는 증식하여 불규칙한 MET 세포 덩어리를 생성합니다. 재프로그래밍의 후반 단계에서, 완전히 재프로그래밍된 세포의 군체가 나타나며, 잘 정의된 경계를 가진 개별적으로 식별할 수 있는 세포가 나타납니다. 이렇게 완전히 재프로그래밍된 세포는 더 많은 수의 MET 콜로니와 함께 존재합니다.

완전히 재프로그래밍된 분리된 성숙 클론이 여기에 나와 있습니다. iPSC 유도 및 성숙 후, 상세한 특성화를 수행하고 다양한 세포 유형으로 분화를 지시할 수 있습니다. 병원체의 존재 여부에 대해 테스트되지 않은 인체 조직으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 및 생물 안전 캐비닛에서 작업과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

이 동영상을 시청한 후에는 태아 줄기세포에서 다능성을 유도하는 방법, 어떤 시약과 장비를 사용해야 하는지, 만능 줄기세포를 일상적으로 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.