Name: 기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 학습하세요 태아 줄기세포에서 비통합 에피소말 재프로그래밍을 이용한 유도만능줄기세포(iPSC) 유도법을 화학적 정의 배지에서 효율적으로 수행하는 방법을. 이 기술은 재생의학 및 조직공학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 대학 취리히, 취리히 대학, 동호회 10.216 및 12.176에 스위스 사회의 심장, 스위스 국가 과학의 SCIEX NMS채널 의 Forschungskredit Fonds Medizinische Forschung에 의해 지원 되었다 재단 보조금 [320030-122273] 아래와 [310030-143992], 7 프레임 워크 프로그램, 생활 밸브, 그랜트 [242008], 올가 Mayenfisch 재단, EMDO 재단, 대학 병원 취리히 시작 그랜트 2012 유럽 위원회 및 미첼 암 연구소의 내부 자금입니다.

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<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

태아 줄기 세포에서 iPSC 생성의 초기 단계 태아 조직, 그들의 문화, 확장, 및 episomal 재활 플라스 미드의 소개에서 원본 셀의 추출 수반. 이 단계 뒤에 문화 기간 약 14 ~ 18 일 전에 첫 번째 완전히 재설정된 식민지 확장 될 수 있다. 마지막 단계는 iPSC 클론의 성숙. 양수 막 줄기 세포의 초기 추출은 amnion의 결합 된 기계 및 효소 소화에 의해 이루어집니다. 우리는 30 분의 부 화 시간이 결과 높은 생존 능력으로 추출 셀 수가 가장 발견. 소화 절차 조직 및 세포 덩어리의 작은 조각을 생성할 수 있습니다. 단일 셀을 기준으로 이들의 비율이 높은 경우, 이후 모든 부착 셀 outgrowths에 기여할 수 있는 한 그릇에 모든 덩어리와 단일 세포를 도금 하는 것이 좋습니다. 셀만 문화 매체와 혼합 하 고 알을 품을 부착 셀의 식민지는 충분 한 크기에 도달할 때까지 액체 양수 줄기 세포를 도금 하는 것은 간단 합니다. 일반 조직 문화 취급 plasticware 완벽 하 게 적합 한 고도 불구 하 고 이...

유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 기술 발달 모델링, 잠재적인 세포 대체 요법, 질병 및 약물 및 독물학 심사1,2,3에 대 한 제공합니다. 대체 요법 개념적 세포 주입에 의해 달성 될 수 있다, 체 외에서 분화 (심장 패치) 등 조직 이식 또는 조직 공학에 의해 재생을 유도 합니다. 양수 (AFSC)와 막 줄기 세포 (AMSC)도 이러한 개입에 대 한 셀의 훌륭한 소스가 직접4,5,,67 또는 프로그래밍에 대 한 시작 셀 인구 로 pluripotency8,,910,,1112.
정의 되지 않은 문화 시스템을 사용 하는 초기 접근 또는9,10,,1112생성 방법의 수반 게놈 통합을 요구 하는 프로그래밍. 더 최근의 연구 iPSC 양수 유체 상피 세포에서 생성 하는 덜 정의 된 지하실 멤브레인 첨부 매트릭스 (BMM) 사용 되었다 하더라도 이종 무료 매체를 채택. 그러나, 기형종 형성 분석 결과 시험관 및 분자 데이터 함께 연구에 포함 되지. 양수 내 유체 상피 세포는 신생아 fibroblasts13에 비해 한 약 원죄 높은 재활 효율성이 있다을 발견 했다. 또 다른 연구에서는 양수에서 중간 엽 줄기 세포 또한 iPSC는 훨씬 더 높은 효율12로 재설정을 발견 했다.
만능 줄기 세포 조직 대표자 모든 3 세균 층으로 분화 될 수 있다 하 고 따라서 광범위 한 잠재력을가지고. 소아 환자 prenatally 수확, 프로그래밍, 그리고 그들의 헌 양수 액체 줄기 세포의 조직 공학에서 혜택을 수 있는 그리고 양수 막 줄기 세포 perinatally. 또한, 태아 줄기 세포 (성체 줄기 세포14,15보다 낮은)의 상대적으로 낮은 수준의 수 이론적으로 iPSC16소스 셀에서 관찰된 고정 후 바이어스의 해결에 도움이 됩니다.
여기에 우리가 현재 양수 프로그래밍에 대 한 프로토콜 및 막 줄기 세포의 pluripotency 화학적으로 재조합 vitronectin17 (VTN)18episomal 플라스 미드 사용 하 여 이종 무료 E8 매체를 정의. 프로그래밍에 대 한 셀의 원천으로 양수 액체와 막 셀의 주요 이점은 그들의 가용성을 사전에 속이 고 이렇게 주로 소아 조직 공학에 연구를 도움이 될 것 이라고 perinatally 및 따라서.

<table><tbody><tr><td>종양 해리 키트, 인간</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>조직 해리 시스템, 시약 키트, 조직 해리 튜브 및 조직 해리 효소</td></tr><tr><td>포함 gentleMACS 해리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>조직 해리 시스템, 해리기</td></tr><tr><td>Thermo Scientific &trade; Shandon&trade; 일회용 메스 No. 10, 멸균, 개별 포장, 5.75 (14.6cm)</td> <td>Thermo-Fisher</td><td>3120032</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>10054-456</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체</td><td>Thermo-Fisher</td><td>32404014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>흔들 플랫폼</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원심분리기 튜브</td><td>Thermo-Fisher</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원심분리기 튜브</td><td>Thermo-Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 기초 매체</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>AFMC 매체용 기초 매체</td></tr><tr><td>FGF 2 Human (E. coli, non-glycosylated로 표현)</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-218</td><td>bFGF, AFMC 매체</td></tr><tr><td>EGF Human, Pichia</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-332 보충제;</td><td>EGF, AFMC 배지용 보충제</td></tr><tr><td>LR3 인슐린 유사 성장 인자-1 인간 재조합</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-022</td><td>IGF, AFMC 매체</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum 보충제, 배아 줄기세포 자격이 부여된</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10439024</td><td>FBS</td></tr><tr><td>항생제-항진균제 (100X)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15240062&nbsp;</td><td>원발성 AFSC/AMSC의 경우, 일상적인 AFSC/AMSC의 경우 필요하지 않으며, 형질주입된 세포의 경우 배지에서 사용하지 마십시오!</td></tr><tr><td>Accutase 세포 분리 솔루션</td><td>StemCell Technologies</td><td>07920</td><td>세포 분리 효소</td></tr><tr><td>CryoStor&trade; CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>07930</td><td>완전 동결 매체</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>10010023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>for plasmid isolation</td></tr><tr><td>pEP4 E02S EN2K</td><td>Addgene</td><td>20925</td><td>EN2K, 리프로그래밍 인자 Oct4+Sox2, Nanog+Klf4</td></tr><tr><td>pEP4 E02S ET2K</td><td>Addgene</td><td>20927</td><td>ET2K, 리프로그래밍 인자 Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4</td></tr><tr><td>pCEP4-M2L</td><td>Addgene</td><td>20926</td><td>M2L, 리프로그래밍 인자 c-Myc+LIN28</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c UV-Vis 분광 광도계</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000C</td><td>분광 광도계</td></tr><tr><td>Neon&reg; Transfection System</td><td>Thermo-Fisher</td><td>MPK5000</td><td>Transfection System, 구성품: Neon 피펫 - Transfection 피펫 Neon device - Transfection device</td></tr><tr><td>Neon®reg; 형질주입 시스템 10 &마이크로; L Kit</td><td>Thermo-Fisher</td><td>MPK1025</td><td>Neon Transfection System용 소모품 키트, 포함 사항: Neon tip - transfection tip Neon tube - transfection tube buffer R - resuspension buffer buffer E - 전해 완충액</td></tr><tr><td>Stemolecule&trade; 나트륨 부티레이트</td><td>StemGent</td><td>04-0005</td> 재프로그래밍 TeSR-E8 StemCell Technologies 05940 E8 매체 Vitronectin XF&trade<td>의 소분자 강화제</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>;</td><td>StemCell Technologies</td><td>07180</td><td>VTN, 재고 농도 250 &마이크로; g/ml, 1 &micro에서 코팅에 사용; g/cm2 in vitronectin 희석 (CellAdhere) 완충액</td></tr><tr><td>CellAdhere&trade; 희석 완충액</td><td>StemCell Technologies</td><td>07183</td><td>vitronectin 희석 완충액</td></tr><tr><td>UltraPure&trade; 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td>15575020 사용 전에 PBS로 0.5 mM까지 희석</td></tr><tr><td>EVOS&reg; FL 이미징 시스템</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>AMF4300</td><td>LCD 이미징 현미경 시스템</td></tr><tr><td>CKX53 반전 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td>위상 대조 세포 배양 현미경</td></tr><tr><td>피어스&트레이드; 16% 포름알데히드 (w/v), 메탄올-프리</td><td>Thermo-Fisher</td><td>28908</td>은 <td>사용 전에 PBS로 4%로 희석, 희석된 경우 2-8°C에서 저장할 수 있습니다; C 1 주 동안</td></tr><tr><td>Perm Buffer III</td><td>BD Biosciences</td><td>558050</td><td>투과 완충액, -20 &deg로 냉각; C 마우스</td></tr><tr><td>IgG1을 사용하기 전에&kappa; 이소타입 컨트롤, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>557782</td><td>Oct3/4A, Nanog</td></tr><tr><td>Mouse IgG1, &kappa에 대한 동형제어; 이소타입 컨트롤, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>557783</td><td>isotype control for Sox2</td></tr><tr><td>Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>561628</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>560791</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>562139</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgGM, &kappa; 이소타입 컨트롤, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>401617</td><td>TRA-1-60 마우스 IgGM에 대한 isotype control</td></tr><tr><td>, &kappa; 이소타입 컨트롤, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>401618</td><td>이소타입 제어 TRA-1-81</td></tr><tr><td>마우스 항-인간 TRA-1-60, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>마우스 항-인간 TRA-1-81, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>330705</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1, &kappa; 이소타입 컨트롤, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>400129</td><td>SSEA-1</td></tr><tr><td>Mouse IgG3에 대한 동형, &kappa; 이소타입 컨트롤, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>401321</td><td>이소타입 제어 SSEA-4</td></tr><tr><td>마우스 안티-휴먼 SSEA-1, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>323010</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-휴먼 SSEA-4, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>330407</td><td></td></tr><tr><td>Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-606-068</td><td>1:600의 희석으로 사용 또는</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-546-068</td><td>1:600의 희석으로 사용 또는</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>D21490</td><td>원액 10mM을 추가로 최적화, 작업 용액 Corning®reg의 경우 1:12.000으로 추가 희석</td></tr><tr><td>; 마트리겔&reg; 성장 인자 감소, Phenol Red-Free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>기저막 매트릭스 (BMM)</td></tr> <tr><td>scid 베이지 마우스, 암컷</td><td>Taconic</td><td>CBSCBG-F</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit (50)</td> <td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RNA 분리 키트</td></tr><tr><td>T-25 플라스크, 조직 배양 처리</td><td>된 Thermo-Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 플라스크, 조직 배양 처리</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td>156499</tr><tr><td>Nunc&trade; 조직 배양 접시</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-567-650&nbsp;</td><td>10cm 조직 배양 접시</td></tr><tr><td>6-웰 플레이트, 조직 배양 처리된</td><td>Thermo-Fisher</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 계수 챔버(혈구계)</td><td>VWR</td><td>15170-173</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty&trade; 냉동 용기</td><td>Thermo-Fisher</td><td>5100-0001&nbsp;</td><td>냉동 용기</td></tr><tr><td>FACS 튜브, 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 5ml</td><td>코닝</td><td>352058</td><td>5ml 폴리스티렌 튜브</td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브, 1.5ml</td><td>Thermo-Fisher</td><td>05-402-96</td><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>PCR 튜브, 200 &micro; l</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14-222-262</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 100 - 1250 &마이크로; l</td><td>Thermo-Fisher</td><td>02-707-407</td><td>좁은 구멍 1 mL 팁</td></tr><tr><td>피펫 팁, 5-300 &마이크로; l</td><td>Thermo-Fisher</td><td>02-707-410</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 0.1 to 10 &micro; l</td><td>Thermo-Fisher</td><td>02-707-437</td><td></td></tr><tr><td>광경 피펫 팁, 1000 &마이크로; l</td><td>VWR</td><td>89049-166</td><td>광각 1mL 팁</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Thermo-Fisher</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 200 증거</td><td>Thermo-Fisher</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>와류 믹서</td><td>VWR</td><td>10153-842</td><td></td></tr><tr><td>챔버 커버 유리, 8-well, 1.5mm 붕규산 유리</td><td>Thermo-Fisher</td><td>155409</td><td>유리 바닥 공초점 등급 cultureware</td></tr><tr><td>22G 바늘</td><td>VWR</td><td>82002-366</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>Thermo-Fisher</td><td>22-253-260</td><td></td></tr><tr><td>포르말린 용액, 중성 완충, 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>이식된 기형종 고정</td></tr><tr><td>Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip</td><td>Illumina</td><td>BD-103-0204</td><td>발현 마이크로어레이, PluriTest에서 지원, 제조업체에서 단종</td></tr><tr><td>PrimeView Human Genome U219 Array Plate</td><td>Thermo-Fisher</td><td>901605</td><td>발현 마이크로어레이(이전의 Affymetrix 브랜드), 곧 PluriTest</td></tr><tr>GeneChip&trade에 의해 지원될 예정<td>; Human Genome U133 Plus 2.0 Array</td><td>Thermo-Fisher</td><td>902482</td><td>expression microarray(이전 Affymetrix 브랜드), CellNet에서 지원, 곧 PluriTest</td></tr><tr><td>PluriTest&reg</td>에서 지원;<td>Coriell Institute</td><td></td><td>www.pluritest.org, 다능성의 생물 정보 평가를 위한 무료 서비스, 곧 U133, U219 마이크로어레이 및 RNA 시퀀싱 데이터 CellNet Johns Hopkins University cellnet.hms.harvard.edu 를 지원하기 위해 HT-12 v4 플랫폼에서 마이크로어레이 데이터 - *.idat 파일을 수락</td></tr>합니다.<tr><td></td><td></td><td></td><td> 데이터 염기서열분석</td></tr></tbody></table>

기본 양수 및 pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

자가 세포 기반 요법 유도 만능 줄기 세포의 소개와 함께 현실로 한 걸음 더 가까이 있어. 양수 등 막 중간 엽 줄기 세포, 태아 줄기 세포는 독특한 조직 공학에서 및 iPSC 미래 소아 개입 및 줄기 세포 은행으로 프로그래밍에 대 한 약속을 가진 미 분화 세포의 종류를 나타냅니다. 여기에 제시 된 프로토콜 추출에 대 한 최적화 된 절차를 설명 하 고 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포를 배양 하 고 episomal 생성 유도 만능 줄기 세포 화학적으로 완전히 정의 된 문화에서이 세포에서 인간 재조합 형 vitronectin 고 E8 매체를 이용 하는 조건. -Cytometry, confocal 영상, 기형종 형성과 transcriptional 프로 파일링-엄격한 방법을 적용 하 여 새로운 라인의 특성은 또한 기술 된다. 새로 생성 된 라인 SSEA-1 표식에 대 한 부정 되 고 있는 동안 배아 줄기 세포-Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4-마커를 표현 한다. 줄기 세포 라인 teratomas scid 베이지색 쥐에 6-8 주에 고 teratomas는 포함 모든 3 개의 세균 층의 대표적인 조직. 따라서이 방식은 동물 테스트 하는 매력적인 대안 그리고 모든 라인 만능 간주 bioinformatic pluripotency 평가 알고리즘 글로벌 식 microarray 데이터 전송 라인의 transcriptional 프로 파일링. 새로운 iPSC 라인 차별화 및 조직 공학의 최적화를 포함 하는 다운스트림 실험에서 쉽게 사용할 수 있습니다.

정보 서 면된 동의 유전자 테스트 및 연구에 대 한 액체의 작은 약 수를 누리고 양수를 수확 하기 전에 환자 로부터 얻은 것입니다. 아무 동의 태 반 의료 폐기물을 나타냅니다 연구에 양수 막의 사용에 대 한 필요 합니다. 양수 및 막 줄기 세포는 전형적인 엽 속성을 표시, 형태학 상으로 그들의 세포는 스핀 들-모양 및 위상-밝은. 프로그래밍, 셀 엽-상피 (메트로) 전환 받을 고 조약돌 모양의 형태와 공간 조직 상피 속성을 나타내는 식민지의. 이 과정은 48-72 h episomal 플라스 미드를 프로그래밍의 도입에 따라 일찍 시작 됩니다. 하루 5 프로그래밍의 이러한 식민지의 부재 실험의 실패를 나타내는 것 이다. 메트로 식민지의 세포 증식 하 고 결과적으로 식민지 될 소형 주 5와 14 사이. 소형 메트로 식민지는 개별적으로 쉽게 인지할 수 (그림 1A) 있지 않은 셀의 구성 되어 있습니다. 하루 14, 완전히 재...

이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

본 절차의 전반적인 목표는 두 가지 서로 다른 종류의 태아 줄기세포로부터 에피솜 재프로그래밍을 통해 유도만능줄기세포를 효율적으로 유도하는 것입니다. 이 방법은 조직 공학, 질환 모델링, 기초 연구 또는 종단 연구를 위한 만능줄기세포 공급원을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 iPSC의 재프로그래밍과 성숙이 화학적으로 정의된 조건에서 이루어지며, 잠재적인 소아 세포 기반 치료를 위해 조기에 확보 가능하다는 점입니다.본 절차의 시연은 책임 연구자인 Steven McClellan과 제가 진행하겠습니다. 출산 후 가능한 한 빨리 태반을 확보하십시오. 양막을 9cm² 크기의 분절로 절단한 후, 항생제 및 항진균제 솔루션이 첨가된 PBS 30mL가 담긴 50mm 원심분리 튜브에서 세척하십시오.막에서 혈전물을 제거한 후, 미세 메스 한 쌍을 사용하여 멸균된 10-centimeter 조직 배양 접시에서 막을 미세한 조각으로 잘게 다집니다. 메스 날을 사용하여 다져진 막 조직 덩어리를 4.7 milliliters의 RPMI-1640 배지가 들어 있는 조직 해리 튜브 하나로 옮깁니다. 해리 효소를 넣어 섞습니다.튜브를 조직 해리기에 장착하고 h_tumor_01 프로그램을 실행합니다. 그런 다음 튜브를 로킹 플랫폼(rocking platform) 위에서 37 °C로 30분 동안 배양합니다. 현탁액을 35 mL의 RPMI-1640으로 추가 희석한 후, 50 mL 원심분리 튜브 위에 놓인 70 µm 스트레이너에 통과시킵니다.상온에서 200 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 펠렛을 5 mL의 RPMI-1640에 재현탁하고 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 항생제 및 항진균제 솔루션이 첨가된 갓 제조한 AFMC 배지가 담긴 조직 배양 플라스크에 세포 클러스터 형태로 cm²당 약 10,000개의 세포 밀도로 분주합니다.T75 플라스크 1개에 들어있는 세포 시트에 세포 분리 효소 2 mL를 첨가하여 리프로그래밍을 위한 저계대 양수 및 양막 줄기세포를 수확합니다. 37°C에서 5~8분 동안 배양합니다. 200 ×g에서 45분 동안 원심분리한 후, 펠렛을 1 mL의 PBS에 재부유시키고 잘 섞어 혈청 성분을 세척합니다.헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 그 다음 세포 밀도를 PBS 1mL당 100,000 cells가 되도록 조정하고, 1.5mL 마이크로원심분리 튜브에 4

reprogramming-primary-amniotic-fluid-membrane-cells-to-pluripotency

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

마우스 배아 섬유아세포는 전사 인자 Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc의 강제 발현에 의해 낮은 효율로 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍할 수 있습니다. 재프로그래밍 반응의 드문 중간체는 세포 표면 제작자 Thy-1.2, Ssea-1 및 Epcam에 대한 항체 표지를 통해 분리된 FACS입니다.

재 프로그래밍 가능한 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 중간체의 세포 표면 마커 중재 정화

제노푸스 배아에서 배반구의 지붕에 있는 세포는 만능이며 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 양서류 배반구 지붕 외식을 분석 시스템으로 사용하여 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 체외 기능을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

여기에 설명된 프로토콜은 최소 전사 인자 세트의 과발현을 통해 마우스 배아 섬유아세포에서 혈액 프로그램의 유도를 자세히 설명합니다. 이 기술은 조혈, 혈액 질환 및 조혈 줄기 세포 이식에 대한 향후 연구를 위한 플랫폼을 제공하기 위해 인간 시스템으로 변환될 수 있습니다.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

이 연구에서는 비바이러스 기반 전이(transposon) 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포에서 유도 만능 줄기 세포를 생성합니다.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

여기 우리 재활 요인 인코딩 수정된 mRNAs를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 인간의 기본 섬유 아 세포를 재 설 정할 임상 관련, 높은 효율, 피더 무료 메서드를 설명 하 고 성숙한 예측에 관한-367/302 모방. 또한는 재활 효율성을 평가 하는 방법 클론 iPSC 식민지 확장 및 pluripotency 마커 TRA-1-60의 식을 확인 있습니다.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

여기에서는 신경 줄기세포에 대한 세포 자율 및 비자율적, 틈새 의존적 효과를 별도로 분석할 수 있는 성인 심실-심실하 신경인성 틈새에서 신경 줄기 세포 및/또는 인접한 뇌실막 세포의 장기 유전자 변형을 위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기반으로 하는 절차를 설명합니다.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

학습하세요 태아 줄기세포에서 비통합 에피소말 재프로그래밍을 이용한 유도만능줄기세포(iPSC) 유도법을 화학적 정의 배지에서 효율적으로 수행하는 방법을. 이 기술은 재생의학 및 조직공학 연구에 활용됩니다.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

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