Name: 식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 배우세요 Arabidopsis thaliana 잎 원형질에서 mRNA 결합 단백질을 분리하고 동정하는 최적화된 프로토콜입니다. 생리학적 환경에서 직접 mRNA 결합 프로테옴을 분석하여 식물 전사 후 유전자 조절 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 기존 UV 램프가 장착 된 UV 가교 장치를 제공 한 Joris Winderickx 교수의 실험실을 인정합니다. KG는 KU Leuven 연구 기금이 지원하며 FWO 교부금 G065713N의 지원을 인정합니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

우리는 성공적으로 효모 및 인간 세포를 위해 개발 된 mRNA 상호 작용 포획을 엽초 엽 원형 엽록체에 적용했다. 잎 초 필 세포는 식물 잎의 지상 조직의 주요 유형입니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 생체 환경에서 단백질을 발견하기 위해 생체 내 가교 결합을 사용한다는 것입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 주로 최적의 실험 조건 (50) (예를 들어, 원형질체의 개수와 재료 UV 조사의 지속 시간을 시작으로 사용하기 위해)의 다수를 제시한다. CL 샘플에서 포획 된 단백질은 최소 10 7 개의 원형질체 (중간 규모)가 사용될 때 (단계 1.5.5) SDS-PAGE 및은 염색법으로 만 검출 될 수 있습니다. 농도가 낮 으면 SDS-PAGE에서 관찰 가능한 mRBP 패턴이 생성되지 않으므로 proteomics의 추가 분석에는 사용하지 않아야합니다. 실제로 10 7...

진핵 생물은 세포 생물학적 과정을 유지하기 위해 다중 RNA 생합성 조절 경로를 사용합니다. 알려진 종류의 RNA 중에서 mRNA는 매우 다양하며 단백질과 그 이소 형의 코딩 용량을 가지고 있습니다 1. PTGR 경로는 pre-mRNA 2 , 3 의 운명을 지시합니다. 서로 다른 유전자 군의 RBP가 RNA의 조절을 조절하고, PTGR에서는 특정 mRBP가 기능적 mRNP를 형성하는 직접적인 물리적 상호 작용을 통해 mRNA를 유도합니다. 따라서, 식별 및 mRBPs의 특성과 mRNPs 것은 지난 30 년 .Over 세포의 mRNA 대사 2의 규정을 이해하는 데 중요하다, 다양한 시험 관내 방법 - RNA 전기 영동 이동성의 변화 (REMSA) 분석, 지수 농축 분석에 의한 리간드의 체계적 발전을 포함하여 (RBNS), 방사성 표지 또는 정량 분석 ​​(RNA Bind-n-Seq, RBNS)형광 RNA 결합 분석, X 선 결정학 및 NMR 분광법은 4, 5, 6, 7, 8, 9 - 널리 주로 포유 동물 세포에서 RBPs 연구에 적용되어왔다. 포유류 RBP에 대한 이러한 연구의 결과는 RNA-binding Protein DataBase (RBPDB)를 통해 검색 할 수 있으며, 이는 공개 된 관측치 10 을 수집합니다. 이러한 in vitro 접근법은 강력한 도구이지만 주어진 RNA 풀 시퀀스로부터 결합 된 RNA 모티프를 결정하므로 새로운 표적 RNA를 발견 할 수있는 능력이 제한적입니다. 계산 전략은 단백질 서열의 보존을 기반으로 게놈 전체의 RBPs을 예측하고 (15)를 구성하는 마찬가지입니다. 이를 극복하기 위해 새로운 실험 방법 인 ha이는 관심의 RBP가 상호 작용하는 RNA 모티프의 식별 및 결합의 정확한 위치 결정을 가능하게합니다. &quot;crosslinking and immunoprecipitation&quot;(CLIP)이라고 불리는이 방법 은 생체 내 UV 가교 결합 후 면역 침전 11로 구성 됩니다. 초기 연구에 따르면 245 nm보다 큰 자외선 파장에서 DNA 및 RNA 뉴클레오티드의 광 활성화가 발생할 수 있습니다. 티미 딘을 통한 반응이 선호되는 것으로 보인다 (광 반응성 감소 순서 : dT ≥ dC&gt; rU&gt; rC, dA, dG) 12 . 파장이 254 nm (UV-C) 인 UV 광을 사용하여 단 몇 옹스트롬 (Å) 범위에서 RNA 뉴클레오타이드와 단백질 잔기 사이의 공유 결합이 생성되는 것으로 관찰되었습니다. 따라서이 현상을 RNA와 RBP의 &quot;zero-length&quot;가교라고합니다. 이것은 엄격한 정화 과정<html> 배경이 거의없는 채약 13 , 14 . CLIP에 보완적인 전략은 RBP의 풍경을 기술하기 위해 단백질 확인과 생체 내 UV 교차 결합을 결합하는 것입니다. 이러한 게놈 전체 mRNA에 결합 된 프로테옴의 수는, &quot;mRNA의 상호 작용 체 캡처&quot;(18)라고, 효모 세포, 배아 줄기 세포 (는 ESC),이 새로운 실험 방법을 사용하여 인간의 세포 라인 (즉, HEK293와 헬라)에서 분리 된 19 , 20 , 21 . 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합과 mRNP 정제 및 MS 기반 프로테오믹스로 구성됩니다. 이 전략을 적용함으로써, 비표준 RBD를 포함하는 많은 새로운 &quot;달빛&quot;RBP가 발견되었고, 더 많은 단백질이 이전에 상상했던 것보다 RNA 결합 능력을 가지고 있음이 분명 해졌다&quot;&gt; 15, 16, 17.이 방법의 사용은 새로운 애플리케이션과 RBPs을 조사 할 때 새로운 생물학적 질문에 대답 할 수있는 기능을 허용합니다. 예를 들어, 최근의 연구는 mRNA에 결합 된 프로테옴 (핵심 RBP의 보존을 조사하고있다 proteome) 22 . 식물 RBP는 이미 성장과 발달에 관여하고있다 ( 예 : 개화시기의 후 전사 조절, 24 시간주기, 미토콘드리아와 엽록체의 유전자 발현) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . 또한, 그들은 비 생물 적 스트레스에 반응하는 세포 과정에서 기능을 수행하는 것으로 생각된다 ( 예, 감기, 가뭄, salinity 및 abscisic acid (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . RNA 인식 모티프 (RRM) 및 K 상 동성 (KH) 도메인 서열 모티프에 기초하여 애기 장대 게놈에 200 개 이상의 예측 된 RBP 유전자가 존재하며; 쌀에는 대략 250 개가 35 , 36 으로 기록되어있다. 예상되는 많은 RBP가 식물에만 고유 한 것으로 여겨지는 것은 주목할 만하다. ( 예를 들어, RRM 도메인을 포함하는 예측 된 Arabidopsis RBP의 약 50 %에 걸친 metazoan ortholog는 없다) 35) , 이는 많은 사람들이 새로운 기능을 수행 할 수 있음을 시사한다. 대부분의 예측 RBPs의 기능은 23지지 않은 남아있다. Arabidopsis 에서 발현 된 mRNA- 결합 된 프로테옴의 분리는 모종, 잎 조직, 배양 된 뿌리 세포 및 잎의 엽초 원형질체를mRNA의 상호 작용 체 캡처은 최근 39 (38)보고되었다. 이 연구는 가까운 장래에 식물에서 기능적 RBP를 체계적으로 목록화할 강력한 가능성을 보여줍니다. 여기, 우리는 식물 protoplasts ( 즉, 세포 벽이없는 세포)에서 mRNA interactome 캡처에 대한 프로토콜을 제시한다. Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형 엽 세포는 잎 세포의 주요 유형이다. 분리 된 원형질체는 세포에 자외선을 최적으로 닿게합니다. 이 세포 유형은 기능적 특성을 위해 단백질을 일시적으로 발현하는 분석법에서 사용할 수 있습니다 40 , 41 . 또한 protoplasting 다른 여러 식물 세포 종류 및 종을 42, 43, 44에 적용되어왔다 (., Bargmann 바움 및 2010; 예를 들어, 피터슨 등, 2009 년 홍콩 등, 2012).. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt;이 방법은 총 11 단계 ( 그림 1A )를 포함합니다. Arabidopsis 엽초 엽 원형체를 먼저 단리하고 (단계 1) UV 조사를하여 가교 결합 된 mRNP를 형성한다 (단계 2). 원형질체가 변성 조건 (단계 3) 하에서 용해 될 때, 가교 결합 된 mRNP는 용해 / 결합 완충액에서 방출되고 oligo-d (T) 25 비드에 의해 당겨진다 (단계 4). 몇 차례의 엄격한 세척 후에, mRNP를 정제하고 추가로 분석한다. mRBPs의 변성 펩티드는 가교 결합 mRNA가 정제되기 전에 프로 테이나 제 K에 의해 분해되고 RNA 품질은 qRT-PCR (단계 5 및 6)에 의해 검증된다. RNase 처리 및 단백질 농도 (단계 7) 후에, 단백질 품질은 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 및은 염색 (단계 8)에 의해 조절된다. 단백질 밴드 패턴의 차이점은 가교 샘플 (CL)과 비가 교 샘플 (non-crosslinked sample) 사이에서 쉽게 시각화 될 수 있습니다.UV 조사를받지 않은 원형질체로부터의 음성 대조군 샘플). 단백질의 확인은 MS 기반 프로테오믹스를 통해 이루어집니다. CL 샘플의 단백질은 1 차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (1D-PAGE)으로 분리되어 가능한 배경 오염을 제거하고, 트립신을 사용하여 짧은 펩타이드로 &quot;in-gel digestion&quot;되고 정제됩니다 (9 단계). 질량 분광기 (nano-LC-MS)에 결합 된 나노 역상 액체 크로마토 그래피는 mRNA- 결합 프로테옴에서 결정적인 단백질의 양을 결정할 수있게합니다 (단계 10). 마지막으로, 확인 된 mRBPs는 생물 정보학 분석을 사용하여 특성화되고 목록 화됩니다 (11 단계).

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.8 M 만니톨</td><td>시그마</td><td>M1902-500G</td><td>1차 등장 효소 용액 및 MMg 용액</td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>MERCK</td><td>Art. 4935</td><td>1차 등장 효소 용액 및 W5 완충액</td></tr><tr><td>0.2 M MES (pH 5.7) (4-모르폴린에탄술폰산)</td><td>시그마-알드리치</td><td>M2933</td><td>1차 등장성 효소 용액, W5 완충액 & MMg 해결책, 여과</td></tr><tr><td>살균 셀룰라아제 R10</td><td>Yakult 제약 산업 Co., 주식 회사.</td><td>셀룰라아제 " 오노즈카" R-10, 10g</td><td>최종 등장 효소 용액</td></tr><tr><td>Macerozyme R10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>MACEROZYME R-10, 10g</td><td>최종 등장 효소 용액</td></tr><tr><td>10 % (w / v ) BSA (소 혈청 알부민)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>A7906-100G</td><td>최종 등장 효소 용액 & 여과 살균</td></tr><tr><td>1 M CaCl2</td><td>Chem-Lab NV</td><td>CL00.0317.1000</td><td>최종 등장 효소 용액, W5 버퍼 & 분해 버퍼</td></tr><tr><td>1 M NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3160/60</td><td>W5 버퍼</td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td>MMg 용액</td></tr><tr><td>1 M LiCl (리튬 클로라이드)</td><td>Acros</td><td>199885000</td><td>용해/결합 버퍼, 세척 버퍼 1, 세척 버퍼 2 & 저염 버퍼</td></tr><tr><td>5%(w/v) LiDS (리튬 도데실 황산염)</td><td>시그마-알드리치</td><td>L4632-25G</td><td>용해/결합 버퍼, 세척 버퍼 1 & 여과 살균</td></tr><tr><td>1 M DTT (Dithiothreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific 세척 버퍼 1 & 세척 버퍼 2</td><td>307866</td><td>용해/결합 버퍼,</td></tr> <tr><td>1 M 트리스-HCl(pH 7.5) (트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 염산 SG(HCl))아</td><td>크로스 & 피셔 화학</td><td>167620010 & H/1200/PB15</td><td>용해/결합 완충액, 세척 완충액 1, 세척 완충액 2, 저염 완충액 & 용리 완충액</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (에틸렌디아민테트라아세트산)</td><td>시그마-알드리치</td><td>ED-500G</td><td>용해/결합 완충액, 세척 완충액 1, 세척 완충액 2, 저염 완충액 & 용리 완충액</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>8.22184.0500</td><td>올리고-d(T)25 비드의 재생</td></tr><tr><td>0.1 M NaOH</td><td>VWR PROLABO CHEMICALS</td><td>28244.295</td><td>올리고-d(T)25 비드의 재생</td></tr>, <tr><td>1x PBS(pH 7.4) (인산염 완충 식염수) 함유 (NaCl; 케이클; Na2HPO4; KH2PO4)</td><td>Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC</td><td>S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G & 60230</td><td>올리고-d(T)25 비드</td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K 용액의 재생(2 &mu; 지/&무; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11789020</td><td>단백질 분해</td></tr><tr><td>로딩 염료</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>qPCR 마스터 믹스</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>qRT-PCR 분석</td></tr><tr><td>RNase 칵테일</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2286</td><td>RNA 분해</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>322415</td><td>겔 고정 및 겔 탈색</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma-aldrich</td><td>537020</td><td>젤 고정 및 젤 탈염</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20278</td><td>젤 염색</td></tr><tr><td>1 M NH4HCO3 (중탄산 암모늄) &nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>09830-500G</td><td>젤 수화 및 소화 완충액</td></tr><tr><td>CH3CN (아세토니트릴)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>34851-100ML</td><td>겔 탈수 및 펩타이드 용해액</td></tr><tr><td>IAA (요오드아세트산)</td><td>시그마-알드리치</td><td>I4386-10G</td><td>알킬화제</td></tr><tr><td>TFA (트리플루오로아세트산)</td><td>시그마-알드리치</td><td>302031-10X1ML</td><td>펩타이드 용해액</td></tr><tr><td>FA (포름산)</td><td>시그마-알드리치</td><td>06554-5G</td><td>펩타이드 추출</td></tr><tr><td>트립신 용액(6 ng/&mu; L)</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>소화 완충액</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Peltracom</td><td>LP2D</td><td>식물 성장</td></tr><tr><td>질석 3</td><td>Sibli AS</td><td>05VERMICULIET</td><td>식물 성장</td></tr><tr><td>페트리 접시 (150 x 20 mm)</td> <td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>프로토 플라스트 현탁액 용 캐리어</td></tr><tr><td>0.22 &mu; m 필터</td><td>Millipore</td><td>SE2M229104</td><td>최종 등장성 효소 용액의 균질화</td></tr><tr><td>Razorblade</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>Rosette 잎 스트립</td></tr><tr><td>35-75 &mu; m 나일론 메쉬</td><td>SEFAR NITEX</td><td>74010</td><td>Protoplast 현탁액 여과</td></tr><tr><td>50 mL 라운드 바닥 튜브</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1918-10EA</td><td>캐리어 for protoplast 현</td></tr><tr><td>탁액 혈구계 (B&uuml; rker 혈구계)</td><td>MARIENFELD</td><td>650030</td><td>Protoplast 세포 계수</td></tr><tr><td>UV 가교 장치 (HL-2000 HybriLinker)</td><td>UVP, LLC</td><td>UVP95003101</td><td>in vivo UV 가교</td></tr><tr><td>UV 램프 (Sankyo-Denki G8T5)</td><td>SANKYO DENKI</td><td>SD G8T5</td><td>생체 내 UV 가교</td></tr><tr><td>50mL 유리 주사기</td><td>FORTUNA Optima</td><td>Z314560</td><td>프로토플라스트 용해물의 균질화</td></tr><tr><td>좁은 바늘(0.9 x 25mm)</td><td>Becton Dickinson microlance 3</td><td>2021-04</td><td>프로토플라스트 용해물의 균질화</td></tr><tr><td>로테이터 모델 L26</td><td>Labinco BV</td><td>26110912</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-d(T)25 magnetic beads (5 mg/mL)</td><td>New England BioLabs</td><td>S1419S</td><td>mRNP 및 mRNA 결합 및 pull-down</td></tr><tr><td>Magnetic rack</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td>mRNP 및 mRNA 결합 및 풀다운</td></tr><tr><td>원심 필터 장치 (Amicon Ultra-4 원심 필터 장치)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>mRBP 농도</td></tr><tr><td>Pierce Silver Stain Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24612</td><td>은 염색 분석</td></tr><tr><td>RNA 정제 키트 (InviTrap Spin Plant RNA 미니 키트)</td><td>STRATEC 분자</td><td>1064100300</td><td>RNA 정제</td></tr><tr><td>분광 광도계 장치 (NanoDrop 1000 분광 광도계)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>RNA 품질 및 수량</td></tr><tr><td>Real-Time PCR cycler (StepOne Real-Time PCR cycler)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td>cDNA quantification</td></tr><tr><td>&micro;-C18 columns (Millipore Zip Tip &micro;-C18 columns)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>720046-960EA</td><td>펩타이드 정제</td></tr><tr><td>질량분석기 (Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap 질량분석기)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>질량분석기 기반 단백질체</td></tr>학 <tr><td>액체 크로마토그래피 기기(Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) 기기)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td>질량 분석 기반 단백질체학</td></tr><tr><td>C18 column (Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ES800</td><td>질량 분석 기반 단백질체학</td></tr><tr><td>C18 precolumn (Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td>질량 분석 기반 단백질체</td></tr>학<tr><td>Name</td><td> 회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>qRT-PCR 분석용 프라이머</td><td>Sequences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UBQ10 mRNA (Li et al., 2014)</td><td>Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA (Durut et al., 2014)</td><td>Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

식물 원형질에서 mrna interactome 캡처

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA 결합 단백질 (RBP)은 RNA의 운명을 결정합니다. 그들은 모든 RNA 생합성 경로에 참여하며 특히 mRNA (messenger RNAs)의 전사 후 유전자 조절 (post-transcriptional gene regulation, PTGR)에 기여합니다. 지난 몇 년 동안, 효모 및 포유류 세포주의 많은 mRNA 결합 단백질은 mRNA 결합 단백질 (mRBPs)의 동정을 가능케하는 &quot;mRNA 상호 작용 체 포획 (interaction)&quot;이라는 새로운 방법의 사용을 통해 성공적으로 분리되었다. 생리적 인 환경에서 직접적으로. 이 방법은 올리고 (dT) 비드에 의한 메신저 리보 뉴클레오타이드 복합체 (mRNP)의 생체 내 자외선 (UV) 가교 결합, 풀다운 및 정제, 및 질량 분석기 (MS)에 의한 가교 결합 단백질의 후속 확인으로 구성된다. 아주 최근에 같은 방법을 적용하여 여러 가지 식물 mRNA 결합 프로테옴이 다른 Arabidopsis 조직 공급원에서 동시에보고되었다 : 뿌리 뽑힌 묘목, 잎 조직,엽초 엽 모세포 및 배양 된 뿌리 세포를 포함한다. 여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형질에 대한 최적화 된 mRNA 인터랙티브 캡쳐 방법을 제시하는데, 이는 다양한 세포 분석을 포함하는 실험을위한 다용도 도구의 역할을하는 세포 유형이다. 최적의 단백질 수율을위한 조건에는 조직의 시작과 UV 조사 시간이 포함됩니다. 중간 규모 실험 (10 7 세포)에서 얻은 mRNA 결합 프로테옴에서 RNA 결합 능력을 가진 RBP가 과다하게 나타 났으며 많은 새로운 RBP가 확인되었다. 실험을 확대 (10 9 세포) 할 수 있으며 최적화 된 방법을 다른 식물 세포 유형 및 종에 적용하여 식물에서 mRNA 결합 단백질을 광범위하게 분리, 분류 및 비교할 수 있습니다.

우리는 세척 버퍼 2 ( 그림 1B )와 함께 세척 단계 4.3에서 CL 샘플의 비드 펠렛을 둘러싼 특징적인 후광을 관찰했습니다. 그것이 조사되지 않았지만,이 현상은 자성 포획 동안 가교 결합 된 mRNP 복합체가 비드 응집체와 간섭하여보다 확산 된 응집체가 형성되는 것으로 설명 될 수있다. 그것은 (T) (25)의 비드 포착 올리고 D 14 효과적이라는 것을 나타낸다. 비 CL 대조군과 CL 표본 모두에서 18S rRNA보다 유의하게 높은 UBQ10 기준 mRNA 수준이 도 1c에 제시되어 있다 . 이것은 poly (A) ...

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

이 최적화된 mRNA 인터랙톰 캡처의 전반적인 목표는 식물 세포로부터 mRNA 결합 프로테옴을 분리하고 식별하는 것입니다. 이 방법은 다양한 세포 분석에서 다목적 도구로 사용되는 세포 유형인 애기장대(Arabidopsis thaliana) 잎 책상 조직 원형질체에 적용됩니다. 이 방법은 식물 전령 RNA 결합 단백질의 역할을 발견하고 이해하는 것과 같이 전사 후 유전자 조절 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 결합된 프로테옴 상의 식물 메신저를 생리적 환경에서 직접 분리하고 식별할 수 있다는 점입니다. 따라서 이 방법은 애기장대 잎 책상 조직 프로토플라스트의 메신저 RNA 결합 단백질에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 다른 식물의 프로토플라스트나 조직과 같은 다른 시스템에도 적용 가능합니다.우리는 이 방법이 효모 및 포유류 세포주에 성공적으로 적용되었다는 점에 주목하여 처음 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 두 개의 서로 다른 샘플에 대해 애기자라기 잎 책상 조직 원형질체를 분리하십시오. UV 가교 결합을 하지 않을 대조군 샘플(비가교 샘플)은 얼음에 보관하십시오.가교 결합할 프로토플라스트 현탁액(또는 CL-시료)을 커다란 페트리 접시에 옮깁니다. 표면이 덮이도록 얼음처럼 차가운 MMG 용액 30 milliliters를 접시에 추가하고, 부드럽게 피펫팅하여 세포를 펼쳐줍니다. UV 가교 장치로 이동할 때는 페트리 접시를 알루미늄 호일로 덮어줍니다.뚜껑을 연 페트리 접시를 즉시 UV 가교 장치에 넣습니다. 접시와 UV 램프 사이의 거리가 8 cm가 되도록 확인한 후, 샘플을 1분 동안 조사합니다. 그 후, 페트리 접시의 프로토플라스트 현탁액을 두 개의 새로운 50 mL 원형 바닥 튜브에 빠르게 분주합니다.디시 바닥을 얼음처럼 차가운 MMG 용액 5 mL로 추가로 세척하여 남은 원형질체를 수집합니다. 현탁액을 두 개의 튜브에 나누어 담습니다. 그 다음, non-CL 및 두 개의 CL 시료 튜브를 4 °C에서 100 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거한 후, non-CL 펠릿이 담긴 튜브를 다시 얼음에 둡니다. 각 CL 샘플 튜브에 얼음처럼 차가운 MMG 용액 10 milliliters를 넣고 튜브를 부드럽게 흔들어 펠릿을 재부유시킵니다. 두 샘플을 하나의 50 milliliter 라운드 바텀 튜브에 합친 후, 4 °C에서 100 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거한 후, 펠렛을 얼음 위에 둡니다. 그다음 각 샘플의 세포 펠렛에 9 mL의 차가운 용해 결합 완충액을 첨가합니다. 용액이 균일한 연녹색이 될 때까지 피펫으로 약 20회 정도 위아래로 섞어 원형질체를 용해합니다.균질화를 위해, 프로토플라스트 용해물을 좁은 바늘이 달린 50 milliliter 유리 주사기에 두 번 통과시킨 후, 용해물을 얼음 위에서 10분 동안 배양하십시오. 샘플을 액체 질소로 급속 냉동하고 minus 80 degrees celsius에서 최대 3주 동안 보관하십시오. 냉동된 프로토플라스트 용해물이 든 튜브를 실온에서 해동한 후, 튜브를 얼음 위에 유지하십시오.얼음에 둔 6개의 새로운 2 mL 라운드 바텀 마이크로 원심 분리 튜브에 oligo-d(T) 자기 비드를 1.8 mL씩 분취합니다. 각 튜브의 비드 현탁액을 600 µL의 lysis binding buffer로 세척하기 위해 피펫팅을 짧게 반복하고, 로테이터에서 비드를 2분 동안 부드럽게 회전시킵니다. 비드를 얼음에 보관하십시오.다음으로, 비드를 포함한 6개의 튜브 모두를 자석 랙에 최소 3분 동안 두어 완전한 자성 포집이 이루어질 수 있도록 충분한 시간을 줍니다. 비드가 완전히 포집되면 현탁액이 투명해집니다. 그 후, 6개 튜브 모두에서 상층액을 제거하고 즉시 프로토플라스트 용해물 9 mL를 각각 분주합니다.현탁액이 갈색으로 보이고 균질해질 때까지 피펫팅하여 비드와 용해물을 혼합합니다. 튜브를 4 °C에서 1시간 동안 부드럽게 회전시키며 배양합니다. 배양 후, 튜브를 다시 자성 랙에 3분 동안 둡니다.모든 비드가 튜브 측면에 포집되면, 원형질체 용해물이 포함된 상층액을 6개의 새로운 2 mL 라운드 바텀 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다. 다음으로, 비드가 들어 있는 각 튜브에 얼음처럼 차가운 wash buffer one 1.5 mL를 첨가하고, 피펫팅을 통해 비드를 재현탁합니다. 1분 동안 천천히 회전시킨 후, 튜브를 다시 마그네틱 랙에 3분 동안 둡니다.상층액을 제거하고 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 1.5 milliliters의 얼음처럼 차가운 세척 완충액 2를 사용하여 동일한 세척 절차를 두 번 반복합니다. mRNP가 원형질체 용해물로부터 효율적으로 분리되었다면, CL 샘플의 비드 펠릿 주변으로 후광(halo)이 보일 것입니다.마지막으로, 1.5 milliliters의 차가운 저염 버퍼로 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 세척 후, 각 튜브에 500 microliters의 용출 버퍼를 넣고 파이펫팅을 통해 비즈를 부드럽게 재현탁합니다. poly-A 꼬리가 달린 RNA를 용출시키기 위해 50 degrees celsius에서 3분 동안 배양합니다.피펫팅을 한 번 하여 비드를 부드럽게 재현탁시킨 후, 튜브를 4 °C의 자성 랙에 5분 동안 둡니다. 6개 튜브 전체의 용출액을 옮겨 얼음 위에 놓인 15 mL 원추형 바닥 튜브에 합칩니다. 이렇게 하면 약 3 mm의 용출액이 얻어집니다.분광광도계를 사용하여 RNA의 품질과 양을 즉시 결정할 수 있습니다. 재사용할 oligo-d(T) 비즈를 1 mL의 얼음처럼 차가운 용출 버퍼로 두 번 세척하여 준비하십시오. 그 후, 1 mL의 얼음처럼 차가운 용해 결합 버퍼로 세척하여 염 농도를 500 mM로 다시 조정하십시오.세척된 oligo-d(T) 비즈를 사용하여 결합, 세척 및 용리 과정을 추가로 2회 더 반복하십시오. 이렇게 하면 원형질체 용해물에서 poly-A 꼬리가 달린 RNA를 고갈시킬 수 있으며, 각 샘플당 총 9 mL의 용리액을 얻게 됩니다. 비즈는 보관 후 최대 3회까지 다른 실험에 재사용할 수 있습니다.RNA의 품질을 테스트하려면 텍스트 프로토콜에 따라 UV-가교결합된 단백질을 proteinase K 용액으로 분해하십시오. 그런 다음, RNA 정제 키트를 사용하여 RNA를 정제함으로써 잔류 오염 물질을 제거하십시오. 정제가 완료되면 샘플은 qRT-PCR을 이용한 RNA 품질 테스트를 위한 준비가 된 것입니다.먼저 각 샘플 8 mL를 RNAse A와 RNAse T1이 포함된 RNAse 칵테일 100 units로 처리합니다. 짧게 볼텍싱한 후, 샘플을 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. mRNA 결합 단백질(mRBP)을 농축하기 위해 원심분리 필터 유닛을 사용하여 샘플을 여과합니다. 각 샘플에서는 2 µg의 단백질이 포함된 75 µL의 결과물을 얻게 됩니다.장기 보관을 위해 샘플을 -80 °C에서 냉동하십시오. SDS-PAGE 겔을 전기영동하려면, 각 농축 샘플 25 µL를 2X 로딩 다이 15 µL와 혼합하고 샘플을 95 °C에서 5분 동안 가열하십시오. 5% 스태킹 겔과 12% 분리 겔이 포함된 SDS-PAGE 겔에 단백질 마커와 함께 샘플을 로딩하십시오.다음으로, 젤을 초순수로 5분씩 두 번 세척합니다. 시판되는 실버 염색 키트를 사용하여 젤을 염색합니다. 충분한 수의 초기 원형질체가 사용되었다면, 5분 이내에 단백질 밴드가 나타날 것입니다.mRBP를 추가로 테스트하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 두 번째 1D 페이지 젤에서 펩타이드를 정제하십시오. 이렇게 정제된 펩타이드는 나노 역상 액체 크로마토그래피, 질량 분석법, 그리고 정성 및 정량 프로테오믹스를 통해 분석할 수 있습니다. oligo-d(T) 비드 캡처 후, qRT-PCR을 통해 18S rRNA 대비 poly ubiquitin 10 참조 mRNA의 수준이 유의하게 더 높음이 입증되었습니다.oligo-d(T) 비즈는 poly-A 꼬리가 있는 RNA에만 결합하므로, 이는 용출액에 mRNA가 농축되어 있음을 시사합니다. oligo-d(T) 비즈에 의한 mRBP의 캡처 여부를 은 염색 SDS-page 겔을 통해 추가로 평가합니다. 겔 결과, UV-교차결합된 CL 샘플이 교차결합되지 않은 non-CL 샘플에 비해 단백질 양이 현저히 더 높음을 보여줍니다.UV 조사 시간은 가교 효율에 영향을 줄 수 있습니다. 이 silver-stained SDS-page 겔은 UV 조사를 1분 또는 3분 동안 수행했을 때 밴드 강도가 가장 강하게 나타나 최적의 조건임을 확인해 줍니다. 정량 프로테오믹스 분석을 통해 총 325개의 단백질이 식별되었습니다.이들 단백질 중 225개는 각 단백질에 존재하는 펩타이드의 양이 적고 펩타이드 강도의 변동성이 커서 유의 수준 미만으로 나타났습니다. 하지만 이들 모두 정성적으로 CL 샘플에서만 검출되었으므로 모두 양성 결과로 간주되었습니다. 이 325개의 단백질은 리보솜 단백질, 주요 RBP, 후보 RBP의 세 가지 범주로 추가 분류되었습니다.후보 RBP들은 일반적인 RNA 결합 도메인이 부족하며 대부분의 역할이 검증되지 않았는데, 이는 RNA 조절에서 새로운 기능을 수행할 가능성이 있음을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 식물의 분자 조절 경로 분야 연구자들이 쌍자엽 식물과 단자엽 식물의 세포 및 조직에서 게놈 전체의 messenger RNA 결합 프로테옴을 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다.

mrna-interactome-capture-from-plant-protoplasts

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

시험 단백질 - 단백질 상호 작용이 단백질 기능의 해부를 위해 불가결이다. 여기서는...

단백질 막 중첩 분석 : 가용성식이 및 불용성 단백질 간의 상호 작용을 테스트하는 프로토콜 체외에서</em

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 장기와 조직의 최소한의 처리로 개발 프로그램을 해부할 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표적화된 세포로부터 고품질의 RNA를 산출합니다. qRT-PCR 또는 RNA-seq와 같은 다운스트림 분석 도구는 조직 및 세포 유형별 발현 프로파일을 밝힙습니다.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

고처리량 scRNA-seq 분석법의 실현 가능성과 효과는 식물 연구에서 단일 세포 시대를 예고합니다. 여기에 제시된 것은 특정 Arabidopsis thaliana 뿌리 세포 유형을 분리하고 후속 전사체 라이브러리 구성 및 분석을 위한 강력하고 완전한 절차입니다.

식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

배우세요 Arabidopsis thaliana 잎 원형질에서 mRNA 결합 단백질을 분리하고 동정하는 최적화된 프로토콜입니다. 생리학적 환경에서 직접 mRNA 결합 프로테옴을 분석하여 식물 전사 후 유전자 조절 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

더 많은 동영상 탐색