식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

이 최적화된 mRNA 인터랙톰 캡처의 전반적인 목표는 식물 세포에서 mRNA 결합 단백질체를 분리하고 식별하는 것입니다. 이 방법은 다양한 세포 분석에서 다용도 도구로 사용되는 세포 유형인 arabidopsis thaliana leaf mesophil protoplasts에 적용됩니다. 이 방법은 식물 메신저 RNA 결합 단백질의 역할을 발견하고 이해하는 것과 같은 전사 후 유전자 조절 임플란트 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 생리학적 환경으로부터 직접 결합된 단백질체에 있는 식물 메신저를 분리하고 식별할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 방법은 aribidopsis 잎 mesophil protoplasts의 메신저 RNA 결합 단백질에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 다른 식물의 원형질체나 조직과 같은 다른 시스템에 적용할 수 있습니다.

우리는 이 방법이 효모와 포유류 세포주에 성공적으로 적용되었다는 것을 알게 되었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. Isolate arabidopsis leaf mesophil protoplasts는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 두 가지 다른 샘플에 대해 사용됩니다. UV 가교되지 않는 대조군 샘플 또는 비 CL 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.

가교할 protoplast 현탁액 또는 CL 샘플을 큰 페트리 접시로 옮깁니다. 접시에 얼음처럼 차가운 MMG 용액 30ml를 넣어 표면을 덮고 부드러운 피펫팅으로 세포를 펴 바릅니다. UV 가교 장치로 운반할 때 페트리 접시를 알루미늄 호일로 덮으십시오.

개봉한 페트리 접시를 즉시 UV 가교 장치에 넣으십시오. 접시와 UV 램프 사이의 거리가 8cm인지 확인한 다음 1분 동안 샘플을 조사합니다. 그런 다음 페트리 접시의 원형질(protoplast) 현탁액을 두 개의 새로운 50ml 둥근 바닥 튜브로 빠르게 분취합니다.

접시 바닥을 얼음처럼 차가운 MMG 용액 5ml로 추가로 씻어 나머지 원형질체를 수집합니다. 두 튜브 사이에 서스펜션을 나눕니다. 다음으로, non-CL 및 2개의 CL 샘플 튜브를 섭씨 4도에서 100배 g으로 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 버린 후 CL 펠릿이 아닌 튜브를 얼음 위에 다시 놓습니다. 각 CL 샘플 튜브에 10ml의 얼음처럼 차가운 MMG 용액을 넣고 튜브를 부드럽게 흔들어 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 두 개의 시료를 하나의 50ml 둥근 바닥 튜브에 결합한 후 섭씨 4도에서 100배 g으로 5분 동안 원심분리합니다.

상등액을 버린 후 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 9ml의 얼음처럼 차가운 용해 결합 완충액을 각 샘플의 세포 펠릿에 추가합니다. 용액이 균질한 연한 녹색이 될 때까지 약 20회 위아래로 피펫팅하여 프로톱플라

균질화를 위해 좁은 바늘로 50ml 유리 주사기에 원형체 용해물을 두 번 통과시킨 다음 얼음에서 10분 동안 용해물을 배양합니다. 샘플을 액체 질소로 동결하고 최대 3주 동안 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 실온에서 동결된 프로토플라스트 용해물로 튜브를 해동한 후 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

1.8ml의 oligo-d(T)magnetic beads를 얼음 위에 놓인 6개의 새로운 2ml 둥근 바닥 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 600마이크로리터의 용해 결합 완충액으로 각 튜브의 비드 현탁액을 위아래로 짧게 피펫팅하여 세척하고 로테이터에서 비드를 2분 동안 부드럽게 회전시킵니다. 구슬을 얼음 위에 보관하십시오.

다음으로, 비드가 들어 있는 6개의 튜브를 모두 최소 3분 동안 마그네틱 랙에 넣어 완전한 자기 캡처를 위한 충분한 시간을 허용합니다. 구슬이 완전히 포착되면 서스펜션이 깨끗해집니다. 그런 다음 6 개의 튜브 모두에서 상등액을 버리고 즉시 9 ml의 원형질 용해물을 분주합니다.

현탁액이 갈색이고 균질하게 나타날 때까지 피펫팅을 통해 비드를 용해물과 혼합합니다. 섭씨 4도에서 튜브를 부드럽게 회전시키며 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 다시 마그네틱 랙에 3분 동안 놓습니다.

모든 비드가 튜브 측면에 포집되면 원형아세포 용해물을 포함하는 상등액을 6개의 새로운 2밀리리터 둥근 바닥 마이크로 원심분리기 튜브에 수집합니다. 다음으로, 비드가 들어있는 각 튜브에 1.5 밀리리터의 얼음 냉수 세척 버퍼를 하나씩 추가하고 피펫팅으로 비드를 다시 현탁시킵니다. 1분 동안 부드럽게 돌린 후 튜브를 다시 마그네틱 랙에 3분 동안 놓습니다.

상층액을 버리고 이 세척 단계를 한 번 반복합니다. 1.5ml의 얼음처럼 차가운 세척 버퍼 2를 사용하여 동일한 세척 절차를 두 번 반복합니다. mRNP가 protoplast lysate에서 효율적으로 분리된 경우 CL 샘플의 비드 펠릿 주변에 halo가 표시되어야 합니다.

마지막으로 1.5ml의 얼음처럼 차가운 저염 완충액으로 세척 절차를 한 번 반복합니다. 세척 후 각 튜브에 500마이크로리터의 용리 완충액을 추가하고 피펫팅으로 비드를 부드럽게 다시 매달립니다. 섭씨 50도에서 3분 동안 배양하여 poly-A 꼬리 RNA를 방출합니다.

한 번 피펫팅하여 비드를 부드럽게 다시 매달고 튜브를 섭씨 4도의 마그네틱 랙에 5분 동안 다시 놓습니다. 6개 튜브 모두의 용리액을 얼음 위에 놓인 15ml 원뿔형 바닥 튜브로 옮기고 결합합니다. 이렇게 하면 약 3mm의 용리액이 생성됩니다.

RNA의 질과 양은 분광 광도계를 사용하여 즉시 결정할 수 있습니다. oligo-d(T)beads를 1ml의 얼음처럼 차가운 용리 완충액으로 두 번 세척하여 재사용할 준비를 합니다. 그런 다음 1ml의 얼음처럼 차가운 용해 결합 완충액으로 세척하여 염 농도를 다시 500밀리몰로 조정합니다.

이 세척된 oligo-d(T)beads를 사용하여 결합, 세척 및 용출 절차를 두 번 더 반복합니다. 이렇게 하면 원형질체 용해물에서 poly-A tailed RNA가 고갈되고 각 샘플에 대해 총 9mm의 용리액이 생성됩니다. 구슬은 최대 3회 동안 보관하고 다른 실험에 사용할 수 있습니다.

RNA의 품질을 테스트하려면 텍스트 프로토콜에 따라 proteinase K 용액으로 UV 가교 단백질을 분해합니다. 그런 다음 RNA 정제 키트를 사용하여 RNA를 정제하여 잔류 오염 물질을 제거합니다. 정제 후 샘플은 qRT-PCR을 사용하여 RNA 품질 테스트를 수행할 준비가 됩니다.

먼저 각 시료 8ml를 RNAse A 및 RNAse T1을 포함하는 RNAse 칵테일 100 단위로 처리합니다. 짧은 와류 후 섭씨 37도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. mRNA 결합 단백질 또는 mRBP를 농축하려면 원심 필터 장치를 사용하여 샘플을 필터링합니다. 각 샘플은 2마이크로그램의 단백질이 포함된 75마이크로리터를 생성합니다.

장기 보관을 위해 샘플을 섭씨 영하 80도에서 동결하십시오. SDS 페이지 젤을 실행하려면 각 농축 시료 25마이크로리터와 2X 로딩 염료 15마이크로리터를 혼합하고 시료를 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다. SDS 페이지 젤의 단백질 마커에 5% 스태킹 겔과 12% 분해 겔로 샘플을 로드합니다.

다음으로, 젤을 초순수로 두 번 씻을 때마다 5분 동안 씻습니다. 시판되는 은 염색 키트를 사용하여 젤을 염색하십시오. 충분한 수의 시작 프로토플라스트를 사용하면 단백질 띠가 5분 이내에 나타납니다.

mRBP를 추가로 테스트하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 두 번째 1D 페이지 겔에서 펩타이드를 정제합니다. 이러한 정제된 펩타이드는 이제 나노 역상 액체 크로마토그래피, 질량 분석법, 정성 및 정량 단백질체학으로 분석할 수 있습니다. oligo-d(T)bead capture 후 qRT-PCR은 18S rRNA에 비해 폴리 유비퀴틴 10 reference mRNA가 유의하게 높은 수준을 보여주었습니다.

oligo-d(T)beads는 poly-A tailed RNA에만 결합하기 때문에 이는 mRNA가 용리액에서 풍부하다는 것을 시사합니다. oligo-d(T)beads에 의한 mRBP 포획은 은 염색 SDS 페이지 겔에 의해 추가로 평가됩니다. 겔은 비가교결합 non-CL 샘플에 비해 UV 가교 CL 샘플에서 훨씬 더 높은 단백질 양을 보여줍니다.

UV 조사 기간은 가교 효율에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 은색 염색 SDS 페이지 젤은 1분 또는 3분의 자외선 조사가 가장 강한 밴드 강도와 함께 최적의 조건임을 확인합니다. 총 325개의 단백질이 정량적 단백질체학 분석을 통해 확인되었습니다.

이 단백질 중 225개는 각 단백질에 대해 존재하는 풍부한 펩타이드가 적고 펩타이드 강도의 변동성이 높기 때문에 유의수준 미만이었습니다. 그러나 이들 모두 CL 샘플에서만 정성적으로 검출되었기 때문에 모두 양성 결과로 간주되었습니다. 이 325개의 단백질은 리보솜 단백질(Ribosomal protein), 주요 RBP(main RBP) 및 후보 RBP의 3가지 범주로 더 분류되었습니다.

후보 RBP는 기존 RNA 결합 도메인이 부족하고 대부분의 역할이 검증되지 않았으므로 RNA 조절에서 새로운 기능이 있을 수 있음을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행하면 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 식물의 분자 조절 경로 분야의 연구자들이 쌍떡잎식물과 외떡잎식물, 세포 및 조직에서 게놈 전체 메신저 RNA 결합 단백질체를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.