Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

이 실험 절차의 전반적인 목표는 염색질 면역침전 연구에 사용할 수 있는 가교 결합된 골격근에서 고품질 핵을 준비할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 일주기 또는 기타 시간에 민감한 상황에서 근육 조직과 세포를 사용하는 게놈 연구와 같은 근육 및 일주기 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플의 즉각적인 가교가 가능하고 여과 기반 절차를 안정적으로 수행하여 근섬유릴 오염을 최소화하면서 고품질 핵을 분리할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 골격근에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 심장 및 평활근과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 앞서 설명한 바와 같이 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수에서 약 20주 된 C57 검은색 6마리의 수컷 마우스에서 분리한 뒷다리 골격근의 무게를 측정하고 다집니다. 다진 골격근 조직을 얼음 위에 10ml의 PBS가 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 300배 g으로 샘플을 5분 동안 원심분리합니다. 흡인에 의해 PBS 상등액을 조심스럽게 제거합니다. 1, 2, 3, 4ml의 물이 담긴 기준 튜브를 사용하여 각 50ml 튜브의 펠릿 부피를 추정합니다.

얼음처럼 차가운 1%포름알데히드 및 PBS를 7가지 부피로 추가하고 프로브 조직 균질기를 사용하여 얼음 위의 샘플을 균질화합니다. 다음으로, 샘플을 실온에서 10분 동안 배양하여 가교합니다. 최종 농도 0.125 몰에 1몰 글리신을 첨가하여 가교 반응을 담금질한 후 실온에서 5분 동안 배양합니다.

3, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 시간 g에 표본을 원심 분리한 후에, 포부를 통해 상등액을 제거하십시오. 펠릿을 갓 첨가된 프로테아제 억제제가 포함된 10ml의 얼음처럼 차가운 염기 완충액에 다시 현탁시켜 헹굽니다. 샘플을 다시 원심분리하고 흡인으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 새로 첨가된 프로테아제 억제제가 포함된 6ml의 용해 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. 샘플을 미리 냉각된 15ml Dounce 균질기로 옮기고 얼음에서 10분 동안 배양합니다. 느슨한 절굿공이를 사용하여 15번의 느린 스트로크로 얼음 위에서 각 샘플을 균질화한 다음 단단한 절굿공이로 15번의 스트로크를 하여 핵을 방출합니다.

다음 여과 단계는 고품질 핵을 분리하는 데 핵심입니다. 세포 스트레이너를 통해 균질액을 여과하고 4ml의 용해 완충액으로 헹굽니다. 다음 1, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 시간 g에 표본을 분리기하십시오.

펠릿을 5ml의 얼음처럼 차가운 염기 완충액에 재현탁시키고 단단한 절굿공이로 10회 두드려 핵을 방출합니다. 그런 다음 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 여과하고 2ml의 염기 완충액으로 튜브를 헹구고 다시 여과합니다. 점차적으로 감소하는 기공 크기의 세포 스트레이너로 여과를 반복합니다.

마지막으로, 1, 000 번 g에서 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리기. 상층액을 제거하고 펠릿을 500마이크로리터의 염기 완충액에 재현탁시킨 후 다시 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

500마이크로리터의 SDS 용해 완충액에서 샘플을 해동하고 부드러운 피펫팅으로 재현탁합니다. nuclei DNA 현탁액을 얼음 위의 유리 바이알로 옮깁니다. 올바른 초음파 처리 플랫폼과 조건을 선택하는 것은 분리된 핵에서 염색질 준비에 매우 중요합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 설정을 사용하여 디스크 모양의 변환기에서 초음파 음향 에너지의 집중된 버스트로 초음파 처리를 실행합니다. 초음파 처리 된 염색질을 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 다음 12, 15 분 동안 000 시간 g에 분리기를 설치하고 새로운 관으로 상등액을 옮깁니다.

다음으로, 초음파 처리 된 샘플의 50 마이크로 리터를 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨 섭씨 65도에서 밤새 역 가교를 수행합니다. DNA 샘플의 수확은 다음 섹션에 설명되어 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명 된대로 초음파 처리 및 정량화를 평가 한 후, 해동 된 염색질을 튜브 당 약 100-120 마이크로 그램으로 분취합니다.

그런 다음 면역침전 완충액으로 염색질을 1에서 10으로 희석합니다. 다음으로, BSA 사전 차단된 단백질 HE 아가로스 또는 IgY 비드 50% 슬러리 40마이크로리터를 추가하고 섭씨 4도에서 3시간 동안 회전체에서 배양합니다. 1, 10 분 동안 000 번 g에서 샘플을 원심 분리한 후 상등액을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

그런 다음 염색질 DNA 25-100마이크로그램당 1마이크로그램의 항체에 항체를 추가합니다. 섭씨 4도, 약 15rpm에서 밤새 부드럽게 회전합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 BSA, 사전 차단된 단백질, HE 아가로스 또는 IgY 비드를 넣고 혼합합니다.

차가운 방에서 비드 서스펜션을 2시간 동안 회전시킵니다. 다음으로, RIPA 완충액으로 비드를 세척한 다음 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 고염 완충액, 리튬 염화물 완충액 및 Tris EDTA로 세척합니다. 세척 후 먼저 1, 000 회 g에서 1 분 동안 원심 분리하고 상층액을 조심스럽게 제거하여 비드에서 DNA를 용리합니다.

50마이크로리터의 용리 완충액으로 비드를 재현탁합니다. 그런 다음 섭씨 65도에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 12, 000 회 g에서 5 분 동안 원심 분리기.

상층액을 제거하고 용출 완충액 50마이크로리터를 더 첨가한 후 12, 000회 g에서 5분 동안 다시 한 번 원심분리합니다. 최종 용리 부피는 100마이크로리터입니다. 역교차결합(reverse cross-link)을 하고 DNA 용리를 수행하려면 먼저 용출된 염색질을 섭씨 65도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하기 전에 1마이크로리터의 RNase A를 추가합니다. 그 후, 섭씨 55도에서 30분 동안 밀리리터당 10밀리그램의 프로테아제 K 8마이크로리터로 배양합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 용리 부피가 50마이크로리터인 PCR 세척 키트를 사용하여 DNA를 수확합니다.

마지막으로 앞서 설명한 대로 실시간 QPCR로 프로파일을 분석합니다. 순차적 여과는 조직 파편을 효과적으로 제거했습니다. 초기 여과 후와 연속 여과 후의 샘플의 대표 이미지가 비교를 위해 여기에 표시됩니다.

10 사이클의 초음파 처리를 통한 점진적 염색질 파쇄는 아가로 로즈 겔 실행을 통해 밝혀집니다. 소화 된 염색질로 10 사이클의 초음파 처리는 약 500 염기쌍의 DNA를 생성했습니다. 여기에서는 ZT6 및 ZT18에서 수집된 마우스 골격근 샘플이 있는 B 수컷 1chIP에 대한 대표적인 QPCR 결과를 보여줍니다.

Dbp 유전자의 Dbp 위치 요소를 분석한 결과, 이전 결과와 일치하는 결합이 약 ZT6에서 최고조에 달하는 것으로 나타났습니다. 일단 숙달되면, 핵 준비는 적절하게 수행된다면 5-6시간 내에 완료될 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 여과 기반 방법을 사용하여 가교 근육 조직에서 고품질 핵 및 염색질 DNA를 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 샘플을 얼음이나 냉장실에 보관하고 여과 단계 전후에 현미경 검사를 위해 샘플 부분 표본을 보관해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 근육 및 유전체학 분야의 연구자들이 다양한 근육 조직에서 염색질-단백질 상호 작용의 일주기 또는 시간에 민감한 역학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 절차에 따라 근육 조직에서 전사 인자 결합 패턴을 찾는 것과 같은 추가 질문에 답하기 위해 chIP 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.