Name: 쥐와 분류 된 그들의 Postsynaptic 밀도 단백질에 변화 발작 유발 검사 Electroconvulsive 발작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 학습하세요 쥐에서 전기경련 발작을 유도하고 해마 조직을 분획하여 시냅스 후 밀도 단백질의 변화를 분석하는 방법을. 이 기법은 신경가소성 메커니즘 연구와 우울증 치료 관련 경로 탐색에 활용됩니다.

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저자 분류 및 박사 그레이엄 H. Diering 그의 원심 분리기를 사용 하 여 소규모 프로토콜 PSD 분별에 대 한 제공에 대 한 존스 홉킨스 대학에서 박사 리처드 L. Huganir의 실험실에서 수 박사 에릭 C. 볼 턴 감사 합니다.

동물 주제를 포함 하 여 모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 어바나-샴페인 일리노이의 대학에 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1. 쥐 식민지를 유지 하
<ol><li>Sprague Dawley 쥐 ( 재료의 표참조)를 번 식 하 고 12-h 빛 어두운 주기와 음식과 물에 대 한 ad libitum 액세스 표준 조건에서 그들을 유지 하는 것.</li>
	<li>출생 후 하루 (P) 28에 쥐 새끼를 유아와 2-4 남성 또는 여성 littermates의 그룹에서 그들을 집.</li>
	<li>확인을 위해 비 독성 영구 블랙 마커 남성 쥐의 꼬리를 표시 합니다.</li>
	<li>주 당 3 번 남성 쥐 무게와 그들의 bodyweights를 기록.</li>
</ol>2입니다. ECS 시스템의 준비
<ol><li>오전 7 시 30 분, 동물 준비 실에서 벤치를 소독 하 고 벤치에는 ECS 컴퓨터 (펄스 발생기)를 배치 합니다.</li>
	<li>장소는 개별 남성 쥐 새 장에 깨끗 하 고 빈 뚜껑 200-250 g를 무게. 이 모든 남성 쥐 ECS 유도 치료를 반복 합니다. 30 분 동안 길 들 쥐를 보자.</li>
	<li>쥐가 그들의 감 금 소에서 habituating는, ECS 유도 대 한 펄스 발생기 100 펄스/s, 0.5 ms의 펄스 폭, 0.5의 충격 기간의 주파수로 설정 s, 및 55의 전류 (그림 1A).</li>
	<li>"리셋" 버튼을 누르면 하 고 "준비" 버튼이 켜져 확인 하 여 펄스 발생기를 준비 합니다. 귀 클립 펄스 발생기에 연결 되지 않습니다 다음 몇 초 동안 "충격" 버튼을 누릅니다 있는지 확인 합니다. 참고:이 시점에서, 펄스 발생기는 ECS 유도 대 한 준비.</li>
	<li>펄스 발생기에 귀 클립을 연결 합니다.</li>
</ol>3입니다. 급성 ECS의 유도
: 참고 그림 1B, 상단 패널.
<ol><li>멸 균 식 염 수와 귀 클립 젖은 고 그들은 포화 상태를 확인 합니다.</li>
	<li>식 염 수에 젖은 거 즈에서 그들을 포장 하 여 멸 균 식 염 수와 쥐의 귀를 젖은. 일단 그들이 젖은 거 즈를 제거 합니다.</li>
	<li>귀, 주요 연골 밴드 넘어 위치 당 하나의 클립을 연결 합니다.</li>
	<li>그는 진정한 루프 설립; ECS 시스템에서 확인 그렇지 않으면, 오류 메시지 또는 "1"의 컴퓨터에 표시 됩니다.</li>
	<li>두께, 비-금속 장갑 착용. 부드럽게 gloved 손에서 쥐를 잡고, 몇 초 동안 "충격" 버튼을 누르고 천천히 발작을 관찰 하기 위해 쥐에 그립을 풀어. "발작" 가짜 (NS) 제어, 쥐를 동일 하 게 처리 하지만 현재 제공 하지 않습니다.</li>
	<li>Clonus 시작으로 귀 클립을 분리 하 고 (1 단계), "머리를 끄 덕" (2 단계), "forelimb clonus" "입과 얼굴의 움직임"를 포함 하는 개정된 라신의 규모22 에 따라 발작 동작 기록 (3 단계), "양육 forelimb clonus와" (4 단계), 그리고 "양육과 forelimb clonus 떨어지고" (5 단계). 나포 약 10 마지막으로 해야 s; 타이머를 사용 하 여 발작 기간을 기록 합니다.</li>
	<li>나포 종료, 다음 홈 그것의 감 금에 쥐를 반환 합니다. 쥐의 발작에서 회복 되도록 또 다른 5 분 동안 쥐를 모니터링 합니다. 장에 홀로 지 내게 그것을 유지 하 고 회복 실에 감 금 소를 반환.</li>
	<li>다음 쥐에 ECS 유도 반복 합니다.</li>
	<li>나머지 하루 아침에 한 번 이상 있고 그들은 실험에 대 한 안락사는 때까지 다음 날 오후에 한번 걸쳐 쥐를 모니터링 합니다. 참고: ECS 유도 메서드는 부수적 부작용으로, 주의 요하는 임상 증상을 발생할 수 있습니다. 예를 들어, ECS 유도 프로토콜 수 쥐를 15 s 및 원인 불필요 한 고통 보다 더 오래 지속 되는 발작을 유도 하 고 있다. 이 경우에, 다이아 제 팜 (10 mg/kg, i.p.) 또는 pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.)를 사용 하 여 발작을 종료 합니다. 쥐 호흡 곤란 이나 심한 행동 이상 발작 정지 다음 개발, 경우 잘린 뒤 이산화탄소 흡입에 의해 그들을 안락사.</li>
</ol>4입니다. 만성 ECS의 유도
주: 그림 1B, 하단 패널을 참조 하십시오.
<ol><li>7 일 연속, 위의 1-3 단계에 설명 된 대로 아침에 같은 시간에 하루 한 ECS를 유도.</li>
	<li>모니터는 쥐 두 번 하루에 그들은 그들의 가정에 반환 된 후 연습장.</li>
</ol>5. 균질 및 쥐 된의 분류
참고: 그림 2를 참조 하십시오.
<ol><li>자당 320 m m, 5mm 나트륨 파이 인산, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, 포함 하는 신선한 균질 버퍼 (솔루션) 준비 200 nM okadaic 산 및 효소 억제제. 필터-필터를 사용 하 여 진공 여과 0.22 μ m 기 공 크기와 버퍼를 소독 하 고 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>주어진된 시간에 가리킨 다음 ECS 급성 또는 만성 ECS (그림 1), 5-10 분, 잘린은 단두대를 사용 하 여 다음 공동2 흡입에 의해 쥐를 안락사.</li>
	<li>두뇌를 제거 하 고 앞에서 설명한23,24얼음에 배치 하는 금속 격판덮개에 된 해 부.</li>
	<li>30 m m 조직 문화에 한 쥐에서 장소 2 된 접시 하 고가 위를 사용 하 여 작은 조각으로 그들을 말하다.</li>
	<li>1 mL 피 펫을 사용 하 여 수동 유리 균질 화기를 다진된 된 전송 하 고 차가운 균질 버퍼 (솔루션, 단계 5.1)의 1 mL를 추가 합니다. 유리 균질 화기에 둥근 유 봉을 삽입 합니다. 얼음에 유리 균질 화기를 실행 하는 동안 부드럽게 그리고 꾸준히 뇌졸중 위아래로 10-15 시간 1 분, 대 한 유 봉에 hippocampal 조직의 작은 조각을 사라질 때까지.</li>
	<li>1 mL 피 펫을 사용 하 여 1.7 mL microcentrifuge 튜브에는 homogenate를 전송 하 고 불용 성 조직 및 핵 (P1 분수)를 포함 하는 펠 릿에서 homogenate postnuclear 상쾌한 (S1 분수)를 구분을 4 ° C에서 10 분 동안 800 x g에서 원심. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 두 개의 별도, 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브를 50 µ L 및 S1 분수의 950 µ L를 전송 및 얼음이 튜브를 저장. 얼음에 P1 분수 펠 릿을 저장 합니다.</li>
	<li>S1 분수 (950 µ L) 13, 800 x g와 상쾌한 (S2 분수), 수용 성 cytosolic 단백질 농축 분리 하 4 ° C에서 10 분 원심 하 고 펠 릿 (P2 분수), 막 바인딩 단백질, synaptosomal 단백질을 포함 한 농축. S2 분수 1 mL 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge에 전송 하 고 얼음에 저장 합니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 물 1 mL 피 펫을 사용 하 여 정화의 498 µ L에서 펠 릿 (P2 분수)를 resuspend. 추가 1 M HEPES (pH 7.4)의 2 µ L 4 mM HEPES (pH 7.4)의 최종 농도 달성 하기 위해 20 µ L 피 펫을 사용 하 여. Resuspended P2 분수 얼음에 30 분이 게에 대 한 동요와 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>BCA 분석 결과 사용 하 여 S1, S2, P2 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 1 mg/mL 농도 달성-80 ° C까지 사용, 저장을 각 분수를 50 mM HEPES (pH 7.4)를 추가 하거나 PSD를 분리 하는 P2 분수를 처리 합니다.</li>
</ol>6. 원유 막 단백질 (P2) 분수에서 PSD의 격리
<ol><li>Lysed 상쾌한 (LS2 분수)와 lysed 펠 릿 (LP1 분수)를 분리 하는 P2 분수 (500 µ L) 25000 x g와 4 ° C에서 20 분을 원심. LS2 분수 1 mL 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 전송 하 고 얼음에 저장 합니다.</li>
	<li>250 µ L 1 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS 버퍼 x 1에 1% 세제의 혼합 50 mM HEPES (pH 7.4)의 250 µ L에서 LP1 펠 릿을 resuspend. 15 분에 대 한 부드러운 교 반으로 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>25000 x g와 펠 릿 (PSD 분수)에서 상쾌한 (비 PSD 분수)를 분리 하 4 ° C에서 3 h resuspended LP1 펠 렛 원심 상쾌한 1.7 mL microcentrifuge 튜브를 제거 하 고 50 mm HEPES (pH 7.4) 100 µ L에서 PSD 펠 릿 resuspend 200 µ L 피 펫을 사용 하 여.</li>
	<li>LS2, 비-PSD를, 그리고 BCA 분석 결과 사용 하 여 PSD 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 1 mg/mL 농도 달성-80 ° C에서 사용까지 저장을 각 분수를 50 mM HEPES (pH 7.4)를 추가 합니다. 참고: 모든 솔루션 (즉, 해결책, HEPES 버퍼, 그리고 PBS 버퍼) 5-6 단계에서 사용 되는 정화 물 이온 및 유기 오염 물질과 입자의 무료 여야 한다.</li>
</ol>7. 서 부 럽
<ol><li>각 단백질 분수 얼음에 녹여 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브 (S2, P2, 그리고 1 mg/mL의 PSD) 각 분수의 12 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>5 x SDS 샘플 버퍼의 3 µ L을 추가 하 고 물 욕조에 30 분 동안 75 ° C에 품 어. 차가운 실내 온도 (RT) 아래로 샘플.</li>
	<li>4-20% 그라데이션 15 잘 빗 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 젤 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 각 우물에 단백질 샘플의 10 µ L를 로드 합니다. SDS 페이지 장치에 버퍼를 실행에 80-100 V에서 젤을 실행 (25mm Tris, 190 m m 글리신, 및 0.1 %SDS; pH 8.3). 참고: 각 젤 NS 쥐와 급성 또는 만성 ECS 다음 다른 시간 지점에서 ECS 쥐에서 단백질 견본을 포함 해야 합니다.</li>
	<li>전송 SDS 페이지에서 단백질 젤 25-30 V에서 전송 장치에 비닐 difluoride (PVDF) 막 (60 mA) 전송 버퍼에 9-12 h (25mm Tris, 190 m m 글리신, 및 20% 메탄올; pH 8.3).</li>
	<li>전송 장치에서 PVDF 멤브레인을 제거 하 고 Tris 버퍼 염 분 (TBS)에서 실시간 다중 목적 회전에 5 분에서 그것을 씻어합니다</li>
	<li>5% 우유에 막 차단 및 0.1% 트윈-20 1 헤에 대 한 TBS에서 품 어 그것 세척 버퍼에 1 차 항 체 (표 1)에서 (1% 우유와 0.1 %TBS 트윈-20) 4 ° C에서 다중 목적 회전에 하룻밤 (희석에 대 한 재료의 표 참조).</li>
	<li>워시 버퍼에서 4 시간 10 분 대 한 멤브레인을 세척 하 고 다음 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 그것을 품 어-실시간에 다중 목적 회전에 1 시간에 대 한 버퍼를 세척에 2 차 항 체를 활용</li>
	<li>5 분 4 시간 10 분 대 한 막 워시 버퍼 그리고 TBS로 세척.</li>
	<li>1 분에 대 한 향상 된 chemifluorescence 기판으로 막 품 어 하 고 x 선 필름에 노출. 필름 프로세서와 함께 노출된 영화를 개발할 수 있습니다.</li>
</ol>8입니다. 서 부도 말의 정량화
<ol><li>검색 양과 TIFF 파일로 오 컴퓨터에이 파일을 저장 합니다.</li>
	<li>"파일," "이미지 열기," 오른쪽 화살표 "그레이 스케일" 회색조 이미지로 ImageJ 프로그램에서 서쪽 오 점 파일을 엽니다</li>
	<li>ImageJ 도구 모음에서 사각형 선택 도구를 선택 하 고 관심사의 단백질의 하나의 서양 오 점 밴드를 포함 하는 사각형을 그립니다.</li>
	<li>"분석" 아래 "측정을" 지역 및 선택한 밴드의 평균 밀도를 했다.</li>
	<li>그것의 크기와 모양을 변경 하지 않고 배경 영역에 사각형을 이동 합니다. 및 배경의 밀도 8.4 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>관심사의 단백질의 배경 빼고 밴드 밀도 주는 서쪽 오 점 밴드의 배경 밴드의 밀도 값을 뺍니다.</li>
	<li>관심의 모든 서쪽 오 점 밴드 8.2 8.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>Α-Tubulin;와 같은 내부 관리 유전자 제품의 배경 빼고 밴드 밀도 의해 관심사의 단백질의 배경 빼고 밴드 밀도를 나눕니다 이 단계는 관심사의 단백질의 정규화 된 값을 생성합니다.</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기, ECS 유도 하는 방법을 쥐에 그들의 된 신경 활동의 글로벌 자극 elicits 설명 합니다. ECS는 electroconvulsive 치료, 임상 인간1,2,3약물 내 화 우울증 질환을 치료 하는 데 사용 되는 동물 모델입니다. 심한 우울증 치료 electroconvulsive 치료의 사용에도 불구 하 고 정확한 기본 메커니즘 불분명 남아 있습니다. ECS 경우 새로운 조사를 광범위 하 게 사용 되었습니다 때문에 ECS 설치류에 안티 depressant 같은 행동을 유도 하 고 자극 hippocampal 성체4,32, 성인 선천적인 신경이 뇌의 해 마에 안티-depressant 동작5,<s...

Electroconvulsive 치료 심한 약물 내성 우울증, 양극성 우울증, 파 킨 슨 병의 질병, 그리고 정신 분열 증1,2를 포함 하 여 주요 우울증 장애 환자 치료에 사용 되었습니다. 이 치료에서 발작 epicranial 전극1,2,3를 통해 마 취 환자의 머리에 전달 하는 전기 자극에 의해 생성 됩니다. ECS의 반복적인 관리 임상 약물 내성 우울증 장애1,2,3에 도움이 되었습니다. 그러나, 인 간에 있는 항우울제 효과의 장기 효 험 기본 정확한 메커니즘은 애매 남아 있다. ECS는 electroconvulsive 치료의 동물 모델 이며 치료 메커니즘을 조사에 널리 사용 됩니다. 설치류, 급성 ECS와 ECS 치료 만성는 된 성체를 촉진 하 고 신경 네트워크4,5, 재구성 인지 유연성에서 향상에 기여할 것입니다. 또한, ECS에 의해 두뇌 활동의 글로벌 상승 같은 두뇌 파생 neurotropic 요소6, 그리고 여러 단백질, N-메 틸-D-aspartate metabotropic 글루타민 산 염 수용 체 17 등 성적 증명서의 풍부 변경 (NMDA) 형식 글루타민 산 염 수용 체 소 단위7. 이러한 변화는 시 냅 스 번호, 구조, 및 해 마7,,89에서 힘의 장기 수정 중재에서 포함 된다.
ECS 모델에 전기 자극 일반화 된 토 닉 clonic 발작10,11연상 stereotaxically 이식된 전극, 막 전극, 또는 귀 전극을 통해 설치류에 전달 됩니다. 전극의 stereotaxic 주입 뇌 수술을 포함 하 고 상해를 최소화 하기 위해 실험의 수술 능력을 개선 하기 위해 상당한 시간이 필요 합니다. 적은 침략 적인 각 막 전극 각 막 찰과상과 건조를 일으킬 수 있고 마 취 필요. 귀 클립 전극의 사용 때문에 수술이 나 마 취 없이 설치류에 사용 될 수 있는 최소한의 부상의 입을 이러한 제한을 무시 합니다. 사실, 우리 귀 클립 전극을 통해 현재 깨어 배달된 쥐 안정적으로 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 유도 및 변경 된10그들의 시 냅 스 단백질 발견.
ECS 유도 풍요의 설치류의 특정 두뇌 지구에서 시 냅 스 단백질을 검사, 그것은 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 가장 적합 한 실험 방법을 선택 하는 것이 중요. 두뇌의 subcellular 분별 녹는 cytosolic 단백질;의 원유 격리에 대 한 허용 막 단백질; 세포 기관이 경계 단백질; 그리고 PSD12,,1314같은 특별 한 subcellular 구조에 단백질. PSD는 신경에 시 냅 스 단백질은 매우 집중에서 그리고 postsynaptic 막12,,1315근처에 있는 조밀 하 고 잘 조직 된 subcellular 도메인. PSD의 풍요로 움과 postsynaptic 글루타민 산 염 수용 체, 비 계 단백질, 및 PSD12 신호 변환 단백질의 기능에 동적 변경 이후는 PSD에 농축 하는 시 냅 스 단백질의 연구에 대 한 유용 , 15 , 16 , 17 시 냅 스가 소성 및 여러 가지 신경 장애17,18에서 관찰 하는 synaptopathy와 상관 있다. PSD를 정화 하는 데 사용 하는 이전 subcellular 분류 방법 자당 기온 변화도14, 의 차등 원심 분리에 의해 두뇌의 원유 막 분수에서 세제 불용 성 분수의 참여 19. 많은 양의 설치류 두뇌14,19요구 한다이 전통적인 방법으로 주요 도전 이다. 격리 치료 당 PSD 분수를 10-20 설치류의 준비 광범위 한 비용 및 시간 투자를 요구 하 고 많은 치료 하는 경우에 실제적으로 가능 하지 않습니다.
이 문제를 극복 하기 위해 우리가 직접 PSD 분수 없이 자당 기온 변화도 원심 분리20,21, 격리 하 고 단일 쥐의 된에서 PSD 격리를 적용할 수 있도록 개정 하는 간단한 방법 적응 두뇌입니다. 우리의 소규모 PSD 분류 방법에 대 한 수익률 2 된, immunoprecipitation 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 포함 하 여 생 화 확 적인 분석 실험에서 사용 하기 위해 충분 한에서 PSD 단백질의 30-50 µ g. 부 럽 (PSD-95) postsynaptic 밀도 단백질 95의 농축 및 연 접 마커 synaptophysin 및 녹는 세포질 단백질 α-tubulin 배제를 공개 하 여 PSD를 고립 시키기를 위한 우리의 방법의 성공을 보여 줍니다. 우리의 ECS 유도 및 소규모 PSD 분류 방법 다른 설치류 뇌 영역에 쉽게 적응할 수 있으며 PSD 단백질의 표현에 ECS의 효과 평가 하는 비교적 간단 하 고 안정적인 방법을 제공.

<table><tbody><tr><td>Spargue-Dawley 쥐</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>ECS 공급</td></tr><tr><td>펄스 발생기</td><td>Ugo Bsile, Comerio, Italy</td><td>57800</td><td>ECS 공급</td></tr><tr><td>MilliQ 정수 시스템</td><td>EMD Millipore</td><td>Z00Q0VWW</td><td>세포 내 분별 공급</td></tr><tr><td>공급 Sucrose</td><td>Em science</td><td>SX 1075-3</td><td>세포 내 분별 공급 장치</td></tr><tr><td>Na4O7P2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>221368</td>세포 <td>내 분획 공급</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E9884</td><td>세포 내 분획 공급</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H0527</td><td>세포 내 분획 공급</td></tr><tr><td>오카다ic 산</td><td>TOCRIS</td><td>1136</td><td>세포 내 분별 공급 장치</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>NaVO3</</td><td>sub>SIGMA-ALDRICH</td><td>72060</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS05RE</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>WPI (World Precision 기기)</td><td>500216-G</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>30 mm tissue culture dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Glass homogenizer and a Teflon pestle</td><td>VWR</td><td>89026-384</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>C2170 (1001002)</td><td>서브셀룰라 분획 공급</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT/XF 원심분리기&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004521</td><td>세포 내 분획 용품</td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 시약 A, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#23228</td><td>웨스턴 블롯 용품</td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 시약 B, 25 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#1859078</td><td>웨스턴 블롯 용품</td></tr><tr><td>SDS-폴리아크릴아미드 겔 (SDS-PAGE)</td><td>BIO-RAD</td><td>#4561086S</td><td>웨스턴 블롯 용품</td></tr><tr><td>실행 실험실</td><td></td><td>에서 만든</td><td>버퍼 웨스턴 블롯 용품.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 수직 전기영동 셀, MiniPrecast Gels, 4-gel</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>웨스턴 블롯 공급</td></tr><tr><td>폴리비닐 디플루오라이드 (PVDF) 멤브레인&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>웨스턴 블롯 용품</td></tr><tr><td>트랜스퍼 버퍼</td><td>실험실</td><td></td>에서 제작 <td>웨스턴 블롯 용품.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>웨스턴 블롯 공급</td></tr><tr><td></td><td>Glycine Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td>웨스턴 블롯 공급</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>436143</td><td>웨스턴 블롯 공급</td></tr><tr><td>메탄올&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>웨스턴 블롯</td></tr>은 <tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>세제를 공급합니다. PSD 절연용</td></tr><tr><td>미니 트랜스 블롯 모듈&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703935</td><td>웨스턴 블로트 용품</td></tr><tr><td>무지방 인스턴트 건조 우유</td><td>훌륭한 가치</td><td></td><td>웨스턴 블로트 용품</td></tr><tr><td>다목적 로테이터&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>모델-2314</td><td>웨스턴 블롯 공급</td></tr><tr><td>Hyblot CL Autoradiography Film</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>E3018 (1001365)</td><td>웨스턴 블롯 공급</td></tr><tr><td>향상된 화학형광 기질&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>은 Konica SRX-101A 필름 프로세서를 공급합니다.</td><td>KONICA MINOLTA</td><td>SRX-101A</td><td>웨스턴 블롯</td>은</tr> <tr><td>Name of Antibody</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Cell Signaling</td><td>#2507</td><td>항체 희석 = 1:500 - 1,000, 시간 = 9 - 12 h, 반응 온도 = 4 &deg; C, 숙주 종 = 토끼</td></tr><tr><td>시냅토피신</td><td>세포 신호</td><td>#4329</td><td>항체 희석 = 1:500 - 1,000, 시간 = 9 - 12시간, 반응 온도 = 4 &deg; C, 숙주 종 = 토끼</td></tr><tr><td>알파 - 튜불린</td><td>산타 크루즈</td><td>SC-5286</td><td>항체 희석 = 1 : 500 - 1,000, 시간 = 9 - 12 시간, 반응 온도 = 4 &deg; C, 숙주 종 = 마우스</td></tr><tr><td>GluN2B</td><td>Neuromab</td><td>75-097</td><td>항체 희석 = 1:500 - 1,000, 시간 = 9 - 12 h, 반응 온도 = 4 &deg; C, 숙주 종 = 마우스</td></tr><tr><td>GluA2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Sab 4501295</td><td>항체 희석 = 1:500 - 1,000, 시간 = 9 - 12시간, 반응 온도 = 4 &deg; C, 숙주 종 = 토끼</td></tr><tr><td>STEP</td><td>Santacruz</td><td>SC-23892</td><td>항체 희석 = 1:200 - 500, 시간 = 9 - 12 h, 반응 온도 = 4 &deg; C, 숙주 종 = Mouse</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>715-035-150</td><td>항체 희석 = 1:2,000-5,000, 시간 = 1 h, 반응 온도 = RT, 숙주 종 = 당나귀</td></tr><tr><td>peroxidas AffiniPure 당나귀 항토끼 IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>711-035-152</td><td>항체 희석 = 1:2,000-5,000, 시간 = 1 h, 반응 온도 = RT, 숙주 종 = 당나귀</td></tr></tbody></table>

쥐와 분류 된 그들의 postsynaptic 밀도 단백질에 변화 발작 유발 검사 electroconvulsive 발작

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Electroconvulsive 발작 (ECS)는 electroconvulsive 치료, 심한 우울증에 대 한 가장 효과적인 치료의 실험 동물 모델. ECS 낮은 사망률과 신경 죽음으로 일반화 된 토 닉 clonic 발작을 유도 하 고 화면 항 간 질 약에 널리 사용 되는 모델 이다. 여기, 우리는 ECS 유도 방법을 설명 간단한 55-mA 전류 0.5에 대 한 전달 되는에서 남성 s 쥐 귀 클립 전극을 통해 무게에 200-250 g. 이러한 양자 자극 생산 단계 4-5 clonic 발작 지속 약 10 s. 급성 또는 만성 ECS의 정지 후 대부분 쥐 행동 구별 되도록 복구 "발작" 쥐 사기. ECS는 세계적으로 두뇌 활동을 끌어올리고, 때문에 그것 또한 활동 종속 변경 시 냅 스 단백질 및 여러 방법을 사용 하 여 시 냅 스 강도에 미치는 영향의 검토에 사용 되었습니다. 특히, 서 부 럽 함께에서 postsynaptic 밀도 (PSD)의 subcellular 분류 전문된이 시 냅 스 구조에서 시 냅 스 단백질의 풍부의 양적 결정 수 있습니다. 설치류 두뇌의 큰 금액을 필요로 하는 이전 분류 방법, 달리 여기 자당 기온 변화도 원심 분리 하지 않고 하나의 쥐의 된에서 PSD를 분리 하는 소규모 분류 방법을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 고립 된 PSD 분수 postsynaptic 막 단백질, PSD95, GluA2, GluN2B, 등을 포함 보여줍니다. 연 접 마커 synaptophysin 및 녹는 세포질 단백질 α-tubulin는 성공적인 PSD 격리를 보여주는 PSD 분수에서 제외 했다. 또한, 만성 ECS GluN2B 식 우리의 소규모 PSD 분류 방법, 약리, 유전 또는 기계적 치료 후 단일 쥐에서 hippocampal PSD 단백질에 변화를 감지에 적용할 수 있습니다 나타내는 PSD에 감소 .

상세한 절차를 사용 하 여 여기에 제시 된, 전기 충격 (55 mA, 0.5에 대 한 100 펄스/s s) 쥐 (그림 1A-B)에서 4-5 토 닉 clonic 발작 귀 클립 전극 유도 반복 되지 않는 단계를 통해 전달. 쥐의 총 8 급성 ECS 유도 받은 고 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 표시. 발작 지속 약 10 s, 그리고 모든 쥐 발작 정지의 1-2 분 이내 복구. 가짜 "아니 발작" 쥐 전기 충격을 받지 않았다 고 따라서 발작을 표시 하지 않았다. 4 가짜 쥐의 총 사용 되었다. 만성 ECS 유도, 쥐 7 일 연속 하루 전기 충격을 받은 고 각 전기 충격 (그림 1A-B)를 따라 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 표시. 쥐의 총 8 받은 만성 ECS 유도 그리고 4 가짜 쥐의 총 "발...

Electroconvulsive 발작 (ECS)는 심한 우울증을 위한 electroconvulsive 치료의 실험 동물 모델. 세계적으로 ECS synaptogenesis 및 시 냅 스가 소성 하는 해 마에서 활동을 자극 한다. 여기, 우리가 쥐에 ECS 유도 및 시 냅 스 단백질에 변화 발작 유발 검사 된 그들의 subcellular 분류 방법을 설명 합니다.

쥐와 분류 된 그들의 Postsynaptic 밀도 단백질에 변화 발작 유발 검사 Electroconvulsive 발작

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

전기경련성 발작 유도 및 이후의 해마 소규모 분획화의 전반적인 목적은 쥐의 뇌에 전신 발작 활동을 유도하고, 발작 활동으로 인해 유도된 해마 시냅스 후 밀도(postsynaptic density) 내 단백질의 변화를 조사하는 것입니다. 이 방법은 발작 시 특정 뇌 영역에서 어떤 시냅스 단백질이 조절되는지, 그리고 이러한 조절이 신경 가소성에 기여할 수 있는지와 같은 신경 프로세스의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 전기경련성 발작 유도 프로토콜의 주요 장점은 신경세포 사멸 없이 쥐의 뇌 활동을 전신적으로 활성화하여 생생하게 유도할 수 있다는 점입니다.본 절차의 시연은 저와 정한길 연구원이 Dr.Hee Jung Chung 교수님 연구실에서 진행하겠습니다. 먼저, 뚜껑이 있는 깨끗하고 빈 케이지에 수컷 쥐를 넣습니다. 쥐가 30분 동안 적응하도록 둔 다음, ECS 유도를 위해 펄스 발생기를 설정합니다.리셋 버튼을 눌러 펄스 발생기를 준비하고, 준비(ready) 버튼에 불이 들어왔는지 확인하십시오. 이어클립이 펄스 발생기에 연결되어 있지 않은지 확인하십시오. 그다음, 쇼크 버튼을 몇 초 동안 누른 후, 이어클립을 펄스 발생기에 연결하십시오.이 단계에서는 멸균 식염수로 이어클립을 적셔 충분히 포화되었는지 확인합니다. 다음으로, 식염수에 적신 거즈로 쥐의 귀를 감싸 멸균 식염수로 적셔줍니다. 귀가 충분히 젖으면 거즈를 제거합니다.각 귀에 하나씩 클립을 부착하고, 주요 연골 밴드 너머에 위치시킵니다. 충격 버튼을 몇 초간 누르고 발작을 관찰합니다. 발작 제어가 이루어지지 않는 가짜(sham) 실험군의 경우, 쥐를 동일하게 처치하되 전류를 흘려보내지 않습니다.클로누스(clonus)가 시작되면 이어 클립을 분리하고, 1에서 5까지로 수정된 Racine 척도에 따라 발작 행동을 기록합니다. 여기에는 4단계의 네 다리 클로누스를 동반한 직립 자세, 그리고 5단계의 네 다리 클로누스를 동반한 직립 및 전도가 포함됩니다. 발작은 약 10초 동안 지속되어야 합니다.타이머를 사용하여 발작 지속 시간을 기록하십시오. 발작이 종료되면 쥐를 원래의 케이지로 되돌려 보냅니다. 쥐가 발작으로부터 완전히 회복되었는지 확인하기 위해 5분 동안 더 관찰하십시오.케이지에 단독으로 수용하고, 케이지를 회복실로 옮깁니다. 이 절차에서는 쥐 한 마리에서 얻은 해마 2개를 30 mm 조직 배양 접시에 놓고 가위로 작게 다집니다. 그 후, 다진 해마를 수동 유리 균질기에 옮기고 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼 1 mL를 추가합니다.다음으로, 유리 호모게나이저에 둥근 페스틀을 삽입합니다. 유리 호모게나이저를 얼음 위에 둔 상태에서, 해마 조직의 작은 조각들이 사라질 때까지 1분 동안 페스틀을 위아래로 10~15회 천천히 일정하게 움직여 으깹니다. 그 후, 1 mL 피펫을 사용하여 균질액을 1.7 mL 미세원심분리 튜브로 옮기고, 4 °C에서 800 ×g로 10분 동안 원심분리하여 불용성 조직과 핵이 포함된 펠렛으로부터 핵 상층액을 분리합니다.그 후, S1 분획의 50 µL와 950 µL를 각각 별도의 새로운 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브 두 개에 옮겨 얼음 위에 보관하십시오. 또한, P1 분획 펠렛도 얼음 위에 보관하십시오. 이어서, 950 µL의 S1 분획을 13,800 ×g, 4 °C에서 10분간 원심분리하여 세포질 가용성 단백질이 풍부한 상층액과 시냅토좀 단백질을 포함한 막 결합 단백질이 풍부한 펠렛을 분리하십시오.S2 분획을 새로운 1.7 milliliter 마이크로원심분리관으로 옮겨 얼음 위에 보관하십시오. 그 다음, P2 분획 펠릿을 498 microliters의 차가운 정제수에 재현탁하십시오. 1 molar heeps 2 microliters를 첨가하여 최종 농도가 4 millimolar heeps가 되도록 하십시오.현탁액을 4°C에서 30분 동안 교반하며 배양합니다. 30분 후, 재현탁된 P2 분획을 얼음 위에 보관합니다. 이 단계에서는 P2 분획을 25,000 ×g, 4°C에서 20분 동안 원심분리하여 용해된 상층액과 용해된 펠릿을 분리합니다.LS2 분획을 새로운 1.7 milliliter 마이크로원심분리 튜브로 옮겨 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음, LP1 펠릿을 50 millimolar heeps 250 microliters, 1% 세제 250 microliters 및 1 X PBS 혼합액으로 재부유시키십시오. 이 현탁액을 4 °C에서 부드럽게 흔들어주며 15분 동안 배양하십시오.그 후, 재부유시킨 LP1 펠렛을 25,000 ×g, 4 °C에서 3시간 동안 원심분리하여 non PSD 분획 상층액과 PSD 분획 펠렛을 분리합니다. 상층액을 1.7 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, PSD 펠렛을 100 µL의 50 mM HEPES에 재부유시킵니다. 이 그림에서, 대표적인 웨스턴 블롯은 sham 군, 발작이 없는 쥐, 그리고 급성 ECS를 처리한 쥐의 해마에서 얻은 S2, P2 및 PSD 분획 내 NMDA 수용체 서브유닛 GluN2B, AMPA 수용체 GluA2 및 STEP 61의 단백질 발현을 보여줍니다.세포질 가용성 단백질인 alpha-Tubulin은 S2 분획에 농축되어 있습니다. Synaptophysin은 시냅스 전 소포 단백질로, 조분쇄 막 P2 분획에는 농축되어 있으나 PSD 분획에는 농축되지 않는 반면, PSD-95는 P2와 PSD 분획 모두에서 농축되어 있습니다. 여기에는 급성 ECS 후 3시간 및 24시간 시점의 P2 및 PSD 분획 내 GluN2B와 GluA2의 정량 결과가 제시되어 있습니다.P2 분획에서의 GluN2B 및 GluA2 발현량은 S2 분획의 alpha-Tubulin을 기준으로 표준화하였습니다. PSD 분획에서의 GluN2B 및 GluA2 발현량은 PSD 분획의 PSD 95를 기준으로 표준화하였습니다. 숙달된 경우, 적절하게 수행한다면 이 기술은 5~6시간 내에 완료할 수 있습니다.이 절차에 이어, 단백질 혼합물을 기반으로 한 질량 분석법과 같은 분석을 수행하여 ECS에 의해 변형되는 다른 시냅스 단백질이 무엇인지와 같은 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 신경 질환 분야의 연구자들은 신경 질환의 형질 전환 모델을 통해 시냅스 기능 장애의 근본적인 메커니즘을 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 마우스에서 ECS를 유도하는 방법, 해마에서 균질화 및 PSD 분획물을 분리하는 방법, 그리고 ECS 이후의 시냅스 단백질 변화를 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 간질에 의한 쥐의 간질 발작에 대한 뇌파 (EEG) 기록을 보여줍니다. 복부 해마에 전극을 이식한 쥐를 EEG 기록 시스템에 연결하고 플렉시글라스 챔버에 넣습니다. 쥐는 발작 발생을 모니터링하기 위해 뇌 활동이 기록되는 동안 자유롭게 움직일 수 있습니다.

간질에 의한 쥐의 간질 발작에 대한 뇌파 기록

출처: Soukupová, M., et al. 자유롭게 움직이는 쥐에서 EEG 기록 중 흥분성 아미노산의 미세 투석. J. Vis. Exp. (2018)이 비디오는 만성 간질 유도가 있는 쥐의 세포외 흥분성 신경전달물질 수치 평가를 보여줍니다. 미세 투석 프로브를 뇌에 이식하고 뇌파검사(EEG)를 사용하여 발작이 없음을 확인한 후, 간질성 쥐의 상승된 신경전달물질 수치를 평가하기 위해 세포외액을 수집합니다. 그런 다음 고칼륨 용액을 주입하여 신경 흥분성을 유지하고 신경 전달 물질의 방출을 증가시키고, 흥분성 신경 전달 물질에서 칼륨 유도 피크를 평가하기 위해 샘플을 수집합니다.

Assessment of Excitatory Neurotransmitter Levels in Chronic Epilepsy-Induced Rats

출처: Jang, S., et al, 쥐의 전기 경련 발작 및 시냅스 후 밀도 단백질의 발작 유발 변화를 조사하기 위한 해마의 분할. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 발작 유발 신경가소성을 연구하기 위해 쥐 모델에서 급성 전기 경련 발작(ECS)의 유도를 보여줍니다. 연구원들은 이어 클립 전극을 통해 전기 자극을 가하여 신경 과흥분성과 간대를 유발합니다. 이 모델은 시냅스 가소성, 발작 메커니즘 및 전기 경련 요법(ECT) 관련 치료 효과를 조사하는 데 도움이 됩니다.

쥐 모델에서 급성 전기경련 발작 유도

이 비디오는 비침습적 조건에서 국소 간질의 특정 전임상 모델을 사용하여 진정된 쥐에서 고해상도 EEG의 준비, 기록 및 소스 분석 절차를 소개합니다.

고해상도 뇌파 기록을 사용하여 초점 간질의 전임상 쥐 모델에서 뇌 원본 영상

이 상세한 프로토콜 transcranial 전기 자극 자유롭게 이동 하는 쥐에서의 단기 및 장기 효과 조사 하기 위하여 측 뼈에 transcranial 자극 전극 배치를 설명 합니다.

만성 Transcranial 전기 자극 및 쥐 Intracortical 녹음

우리는 microelectrode 배열을 사용 하는 설치류 뇌 조각에 4 aminopyridine 이용한 epileptiform 활동의 기록 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 사용자 지정 녹음 실 조직 생존 연장된 실험 세션에 걸쳐 유지합니다. 전극 매핑 라이브 고 자극 쌍의 선택 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스에 의해 수행 됩니다.

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

급성 발작 모델은 epileptiform 이벤트를 기본 메커니즘을 공부 하 고 중요 합니다. 또한, epileptiform 이벤트에 수요를 생성 하는 기능에는 그들의 개시를 기본 이벤트의 정확한 순서를 공부 하 매우 효율적인 방법을 제공 한다. 여기, 우리가 마우스 및 인간의 조직에 급성 4-aminopyridine 대뇌 피 질의 발작 모델을 설명 합니다.

설치류와 인간의 조직에 급성 Ictal 활동의 생성 및 요청 시 개시

여기, vivo에서 microdialysis 뇌 파 기록 함께에서 간 질 및 간 질 비 쥐의 복 부 해 마에 aspartate 및 조미료 자료를 분석 하는 방법을 설명 합니다. Extracellular 농도 aspartate 및 조미료의 질병의 다른 단계와 상관 될 수 있습니다.

자유롭게 이동 하는 쥐에서 뇌 파 기록 하는 동안 흥분 성의 아미노산의 Microdialysis

간 질 연구의 도전은 고전적인 치료가 부적당 한 환자를 위한 새로운 치료를 개발 하는 것입니다. 새로운 프로토콜을 사용 하 여-이식 가능한 약물 전달 시스템의 도움으로-우리는 간 질 초점에 GABA의 전기 영동 전달에 의해 마 취 된 쥐에서 발작을 제어할 수 있습니다.

간 질 초점으로 γ-아미노 버터 산 (GABA)의 전기 영동 전달은 생쥐의 발작을 방지 합니다.

제시된 프로토콜은 잠재적인 항질 물질에 대한 전임상 평가 도구로 중요한 두뇌 조각을 사용하는 궁극적인 목표를 가진 절제된 인간 해마 조직의 수송 그리고 준비를 기술합니다.

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

이 보고서는 형질전환 VGAT-Cre 마우스의 전기적 점화를 기반으로 측두엽 간질 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 점화된 VGAT-Cre 마우스는 간질의 원인을 파악하고 새로운 치료법을 스크리닝하는 데 유용할 수 있습니다.

측두엽 간질에 대한 모델을 생성하기 위해 전기적으로 점화되는 VGAT-Cre 마우스를 위한 전극의 준비 및 이식

학습하세요 쥐에서 전기경련 발작을 유도하고 해마 조직을 분획하여 시냅스 후 밀도 단백질의 변화를 분석하는 방법을. 이 기법은 신경가소성 메커니즘 연구와 우울증 치료 관련 경로 탐색에 활용됩니다.

쥐와 분류 된 그들의 Postsynaptic 밀도 단백질에 변화 발작 유발 검사 Electroconvulsive 발작

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