Name: 끄 덕 임에서 부분 Hepatectomy 후 Hepatocytes의 intrasplenic 이식 SCID 마우스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 배우세요 NOD.SCID 마우스에서 부분 간절제술 후 비장 내 간세포 이식 기법을 통해 급성 간부전 치료를 위한 세포 기반 요법을 연구하는 방법입니다. 이 프로토콜은 세포 이식 및 증식 메커니즘을 탐구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 학과 생명 공학, 면역학, 뉴델리의 국립 연구소에 인도 정부에서에서 받은 코어 그랜트에 의해 지원 되었다. 박사 Bhattacharjee의 현재 주소는 사단의 위장, 간장 학과 및 영양, 아동 병원 로스 앤젤레스.

이 프로토콜에서 제시 하는 절차는 면역학, 뉴델리의 국립 연구소의 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 승인의 직렬 참조 번호는 IAEC #319/13.
참고: 일반 외과 절차20 및 설치류 수술21에 대 한 특정 프로토콜에 우수한 자원 있습니다. 그는 처음으로 동물 수술을 하 고,이 좋습니다 광범위 하 게 연습을 인형에 수술 동물에 작동 하기 전에.
1입니다. 준비
<ol><li>실험, 계속 하기 전에 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 또는 염 분 준비.</li>
	<li>가 위, 톱니 모양의 집게, 집게를 조직, 면, 면봉, 나일론 스레드, 그리고 다른 마이크로 바늘 홀더 수술 키트를 조립 한다. 압력솥 수술 키트입니다. 특별 한 주의 경우는 면역 손상 끄 덕 취해야 한다. SCID 마우스 프로토콜에 포함 됩니다.</li>
	<li>수술의 끝에 준비에서 완전 한 실험 절차를 수행, 생물 안전에서 캐비닛 클래스 I.</li>
	<li>무게는 끄 덕 임. 수술 하기 전에 오래 된 6-8 주간의 SCID 마우스. 14-18 g 사이 무게 쥐가이 연구에 사용 됩니다.</li>
	<li>헤어 트리머 마우스의 상단 중앙과 증 복 부 영역을 면도. 머리 잘린된 머리카락을 완전히 제거 하려면 주걱으로 크림 지역에 걸쳐 균등 하 게 제거를 적용 합니다. 2-5 분 후 젖은 메 마른 목화의 조각의 도움으로 부드럽게 머리카락을 제거 합니다.</li>
	<li>Isoflurane 챔버에 마우스를 놓고 산소 실린더의 밸브를 잠금 해제 합니다. 4 L/min의 속도로 산소 흐름 및 마 취 유도를 4%에서 isoflurane 증발을 유지 합니다.<ol>
<li>마우스는 부드러운 발가락 곤란 하 여 제대로 anesthetized 되었습니다 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>장소는 biosafety 내부 수술 보드 장. 마우스의 복 부 부분 직면 하 고 마우스의 앞쪽 부분 isoflurane 및 산소 공급 장치에 연결 하는 코 콘 내부 배치는 그런 동물 수술 보드에 놓습니다.</li>
	<li>2%, isoflurane 증발을 감소 하 고 수술을 통해 그것을 유지.</li>
	<li>마우스의 피부를 소독 하 고 절 어 70% 에탄올 소독 면으로 닦아 하 여 소독.</li>
</ol>2. 수술
<ol><li>
부분 Hepatectomy
	<ol>
<li>칼 과정을 바로 운영가 위의 도움으로는 흉 곽에 평행한 수직, 흉 골 바로 아래 피부에 약 1 ㎝의 가로 절 개를 확인 합니다.</li>
		<li>부드럽게 집게 또는 피부와 복 부 근육 층 사이 구별을 무 균 moistened 면 팁 베인된 지역 주변 복 부 근육 층으로 연결 된 피부를 구분 합니다. 건조를 피하기 위해 메 마른 면 팁을 사용 하 여 PBS를 가진 피부 영역을 만끽해 보세요.</li>
		<li>바로 아래에 칼 복 층 가로 절 개를 하 여 원활 하 게 왼쪽된 엽의 영역을 노출. 폭로 하 고 들어 간 좌 엽 두 moistened 면 팁을 사용 합니다.</li>
		<li>컷의 복 부 측에 면화 팁 중 하나를 배치 하 고 격 막에 다른 면 팁을 배치. 부드럽게 팁, 횡 경 막 쪽으로 배치를 누르고 들어 간 좌 엽에 다른 팁으로 슬라이딩 밀어 줄.</li>
		<li>슬립 해제 왼쪽된 엽 통해 루프와 나일론 스레드를 마이크로 포 셉 또는 면 팁의 도움으로 고 hilum 가까이 왼쪽된 엽의 기지를 향해 루프. 부드럽게 왼쪽된 엽의 기지에 나일론 스레드 루프 아래로 밀어.</li>
		<li>미세 바늘 홀더 및 마이크로 집게를 사용 하 여 왼쪽된 엽 위에 나일론 스레드의 두 끝을 묶어. 다른 쪽에 두 개의 추가 노트를 확인 합니다.</li>
		<li>가 위의 도움으로 묶인된 엽 개 해 부. 스레드 가까이 매우 잘라 하지 마십시오. 경우에 절차는 5 분 이상 지속, 계속 복 막 구멍 및 장기 액체 손실로 인해 건조를 피하기 위해 무 균 PBS와 촉촉한.</li>
		<li>연속 봉합을 사용 하 여 4-0 다 봉합 복을 바느질. 그 후, 최대한 빨리 불연속 봉합 하 여 피부를 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 이식 참고: GFP 표현 hepatocytes 유전자 변형 GFP 마우스에서 고립 되었다 (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J),이 외에 의해 설명 된 절차에 따라. 22 와 쉔 외. 23 hepatocyte 같은 셀 (NeoHep) 인간의 기원 monocytes24 에서 분화의 이식도 사용 되었다. 그러나, 다른 소스에서 파생 된 세포 프로토콜에도 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>약 50 µ L의 Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM), 0.2 백만 가능한 셀을 일시 중단 하 고 1 mL 인슐린 주사기 30 G 바늘 출장에서 발음. 얼음에 그것을 배치 하 여 주사기 차가운 유지.</li>
		<li>왼쪽된 측면 부분에 수술을 수행 하는 사람을 향해 직면 하는 방식으로 마우스를 놓습니다. 비장 영역을 식별 하 고 transversely 노출 비장을 복 층을 통해 짧은 절 개 뒤 증 지역 근처 피부를 해 부.</li>
		<li>부드럽게 비장 들어올린 두 PBS의 도움으로 구멍 밖에 서 면 팁을 습 하 게 잡고.</li>
		<li>한 손에 두 면 팁으로 신중 하 게 비장을 누른 주사기의 바늘을 비장에 정확 하 게 수직 배치 합니다. 부드럽게 비장을 관통 하 고 바늘을 밀어 안으로 매우 느리게; 바늘 2 m m 보다 더 받아야 하지.</li>
		<li>비장 세포를 주입 하 천천히 주사기의 피스톤을 아래로 밀어. 이식 후 주사기의 바늘을 안정적으로 유지 하 고 천천히 출혈 방지 하려면 비장 또는 셀의 손실에서 그것을 제거 합니다.</li>
		<li>면 팁으로 복 막 구멍으로 비장을 배치 후 연속 4-0 다 봉합으로 봉합 하 여 복 층을 닫습니다. 바느질 같은 봉합으로 불연속으로 피부. 닫는 피부;에 대 한 상처 클립을 사용 하지 마십시오 대신, 4-0 봉합 하 여 그것을 닫습니다. 상처 클립 마우스의 자연 스러운 움직임을 제한 하 고 종종 클립 느슨하게 되 고 신속 하 게 밖으로 나와.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 수술 치료
<ol><li>피부를 닫은 후 주변을 요오드 솔루션 (betadine) 살 균 면 팁을 사용 하 여 두 봉합 사이트 닦아냅니다.</li>
	<li>600 mg/kg 몸 무게 (일반적으로 염 분/마우스의 100 µ L에서 12 mg cefotaxime) intraperitoneally cefotaxime 항생제의 복용량을 주사 1 mL 주사기를 사용 하 여.</li>
	<li>진통 Meloxicam의 매일 복용량으로 줄 1 mg/kg 몸 무게 (일반적으로 12 µ g Meloxicam의 식 염 수/마우스 100 µ L에서) 동물에 intraperitoneally, 수술 후 최대 3 일 동안.</li>
	<li>수술의 완료 후 isoflurane 가스의 흐름을 중지 하 고 개별적으로 통풍이 장에 다시 마우스를 놓습니다.</li>
</ol>4. euthanization 및 Characterizations
<ol><li>실험적인 종점 (1 일 및 10 일 후 수술) 후 기관 동물 윤리 지침에 따라 마우스를 안락사.</li>
	<li>말기 출혈 눈 터미널 총 puncturing 동물에 의해 혈액을 수집 합니다.</li>
	<li>혈액에서 혈 청을 분리.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

부분 hepatectomy 조사 간 재생에 대 한 설립된 기술 이며 과도 한 hepatectomy AHF 모델을 모방 하기 위해 보고. AHF의 동물 모델 중 특히 쥐, 설치류는 가장 연구 모델입니다. 최대 70 %hepatectomy 쥐에서 간 상해 모델을 얻기 위해 좋은 생존 율25,26보고 되었습니다. 그러나 누드 및 다른 immunodeficient 마우스, 70 %hepatectomy 치명적으로 알려졌다 고 동물2724 시간 안에 죽 었 다.
미첼과 Willenbring28 2/3 부분 hepatectomy 쥐에 대 한 재현 하 고 잘 용납 방법 설명 했다. 에 끄 덕 임. SCID 쥐는 우리는 hepatectomy 총 간 질량의 30%는 왼쪽된 간 엽 절제술까지 제한 되었다 때 1...

현재, hepatocyte 이식 데 심한 간 장애 환자 치료에 대 한 전체 장기 이식의 대 안으로 제시 된다. 그것은 전체 장기 이식1환자 다리 수 믿 었 다. Allogenic hepatocytes2뿐만 아니라 xenogenic hepatocytes3 및 줄기 세포4 에서 파생 된 hepatocytes는 또한 되 고 조사 동물 모델에서. 이 컨텍스트, 추적 및 engraftment 받는 사람에서 이식된 세포의 잠재력 급성 간장 장애 (AHF)에 따라 셀 치료에 대 한 중요 한 기준입니다.
조사 hepatocytes 또는 hepatocyte 같은 셀5의 이식, AHF 수술6 또는 약리학7 절차, 뒤에 세포 이식 동물 모델에서 만들어집니다. 약리학 적인 시 약, 많은 hepatotoxins d galactosamine8, 아 세트 아미노 펜9, 사염화 탄소10, thioacetamide11, Concanavalin A12, lipopolysaccharide13 AHF 동물 모델을 , 등., 사용 되었습니다. 이 목록에서 모든 시 약 AHF, 독특한 기능 집합이 생성 하지만 불행히도 아무 단일 시 약 인간의 AHF 모방. 또한, hepatotoxins에 의해 유도 된 AHF는 시간이 오래 걸립니다, 만성 스트레스는 동물을 박 았, 그리고 재현성 결과 얻기 어렵다.
다른 한편으로, 부분 hepatectomy (PHx)의 수술은 기술 종속, 고 재현성 결과 필요한 능력 개발 후 얻을 쉽습니다. 혼자 외 과적으로 AHF을 유도, 간 70% 이상의 절제가 필요; 그러나, 70 %hepatectomy 여전히 engraftment의 확산을 공부 하 고 이용 될 수 있다 보다는 더 적은 셀 간 손상14동안 그들의 치료 용량을 분석 하기 위한 간 이식. Hepatocytes의 이식 복15, 꼬리 정 맥16,17간 정 맥 또는 비장18통해 수행된 게시물 hepatectomy 되었습니다. 현재, 간 정 맥 주입 및 hepatocytes의 intrasplenic 이식으로 재현 하기 쉬운 기본 절차입니다.
이 문서에 우리는 30% 부분 hepatectomy 끄 덕에 대 한 절차를 설명 했습니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 마우스의 왼쪽된 엽 excised입니다. 그것은 이식의 0.2 백만 GFP 표현 마우스 (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) hepatocytes 인간의 기원 NeoHep19 비장에 옵니다. 이 절차에에서 이식된 세포의 engraftment 이끌어 낸다. 이 절차는 최소한 침략 적 및 최소한 고통 스러운 기술.

<table><tbody><tr><td>가스 마취 시스템</td><td>Ugo Basile; 이탈리아</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>계량 기계</td><td>Goldtech; 인도</td><td></td><td>현지 조달</td></tr><tr><td>생물 안전 캐비닛 (클래스 I)</td> <td>카르토스 국제; &nbsp; 인도</td><td></td><td>현지 조달</td></tr><tr><td>헤어 트리머</td><td>파나소닉; &nbsp; 일본&nbsp;</td><td>ER-GY10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>날카롭고 날카로운 칼날이 있는 직선 작동 가위</td>, <td>주요 외과; 인도</td><td></td><td>현지 조달</td></tr><tr><td>집게, 톱니 모양,</td><td>주요 외과 용품; 인도</td><td></td><td>현지 조달</td></tr><tr><td>마이크로 니들 홀더&nbsp; 스트레이트 & 커브&nbsp;</td><td>메르시안 ; &nbsp; 영국&nbsp;</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 인슐린 주사기와 30G *5/16 바늘&nbsp;</td><td>디스포 밴; 인도</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기 26 G * 1/2 바늘</td><td>BD; 미국&nbsp;</td><td>REF 303060</td><td></td></tr><tr><td>나일론 실&nbsp; &nbsp;</td><td>힘센; 인도</td><td></td><td>(1-0) 현지 조달</td></tr><tr><td>MERSUTURES 4-0 멸균 외과 바늘 봉합</td>사 <td>Ethicon, Johnson & Johnson, India</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>TRUGUT 76cm 4-0 흡수성 외과 봉합</td>사 <td>봉합사 India Pvt. Ltd; 인도</td><td>SN 5048</td><td>멸균 외과 바늘 봉합사 Catgut 크롬</td></tr><tr><td>면봉</td><td>순수 면봉 Pvt Ltd; &nbsp; 인도</td><td></td><td>현지 조달</td></tr><tr><td>수술 테이프</td><td>3M 인도 ; 인도</td><td>1530-1</td><td>Micropore 수술 테이프</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Histo-line Laboratories, 이탈리아</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation ; 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Carl Zeiss ; 독일&nbsp;</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>명시야 현미경</td><td>올림푸스, 일본</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>자동 분석기</td><td>튤립, 알토 산트라크루즈, 인도</td><td>Screen Maaster 3000</td><td>간 기능 테스트 용 생</td></tr><tr><td>화학 분석기 유세포 분석기</td><td>BD ; 미국&nbsp;</td><td>BD FACSverse</td><td>이식 후 세포의 존재 평가</td></tr><tr><td>Veet 제모 크림&nbsp;</td><td>Reckitt Benckiser , 인도</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FORANE</td><td>Abbott ; 미국</td><td></td><td>이소플루란 USP 99.9%&nbsp;</td></tr><tr><td>탁심</td><td>알켐 ; 인도</td><td></td><td>세포탁심 나트륨 주입</td></tr><tr><td>포비돈-요오드 용액&nbsp;</td><td>윈 메디 케어; &nbsp; 인도</td><td></td><td>베타딘</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>히메디아; 인도</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Iscove의 IMDM(Modified Dulbecco's Medium)</td><td>Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US</td><td>12200-036</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 ; US</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>티슈 텍</td><td>사쿠라; 미국</td><td>25608-930</td><td>O.C.T 화합물</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Himedia; 인도</td><td>MB 097</td><td></td></tr><tr><td>항알부민 염소 Polyclonal</td><td>Thermo Scientific,Pierce, US</td><td>PA126081</td><td></td></tr><tr><td>anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal</td><td>abcam, 영국</td><td>ab64609-500</td><td></td></tr><tr><td>항GFP 토끼 다클론&nbsp;</td><td>산타 크루즈 생명 공학; US</td><td>SC 8334</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 당나귀 안티-염소</td><td>&nbsp; 분자 프로브, Thermo Fisher Scientific ; &nbsp; US</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티-양</td><td>&nbsp; 분자 프로브, Thermo Fisher Scientific ; &nbsp; US</td><td>A11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 치킨 안티 토끼</td><td>&nbsp; 분자 프로브, Thermo Fisher Scientific ; &nbsp; US</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG HRP</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; 미국&nbsp;</td><td>65-6120</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ki67 항체</td><td>abcam, 영국</td><td>ab15580</td><td></td></tr><tr><td>항원 마스킹 해제 용액, 구연산 염기</td><td>벡터 실험실, US</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>ProLong 다이아몬드 퇴색 방지 마운트런</td>트 <td>Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US</td><td>P36966</td><td></td></tr><tr><td>SGOT(ASAT) KIT</td><td>산호 임상 시스템, 인도</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGPT (ALAT)</td><td>KIT 산호 임상 시스템, 인도</td><td></td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 인산분해효소 키트(DEA)</td> <td>산호 임상 시스템, 인도</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin Solution, Mayer's</td><td>Sigma ; US</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y 용액, 알코올 시</td><td>그마 ; 미국</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>DPX 마운트앤트&nbsp;</td><td>시그마; US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Melonex(진통제)</td><td>Intas Pharmaceuticals Ltd; 인도</td><td></td><td>Meloxicam 주사&nbsp;</td></tr><tr><td>DAB 강화 액체 기판 시스템 테트라 하이드로 클로라이드</td><td>시그마; 미국</td><td>D3939</td><td></td></tr></tbody></table>

끄 덕 임에서 부분 hepatectomy 후 hepatocytes의 intrasplenic 이식 scid 마우스

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

부분 hepatectomy 간 재생 및 다양 한 병 적인 조건에서 세포 기반 치료제의 효과 공부 하는 다양 하 고 재현할 수 방법입니다. 또한 부분 hepatectomy에 간 쪽으로 가속 neovascularization 및 셀에 의해 증가 engraftment와 이식된 세포의 증식 촉진 한다. 여기, 우리 immunodeficient 끄 덕을 결합 하 여 비만 아닌 당뇨병/심한의 비장에 30 %hepatectomy 이식 세포의 수행에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 마우스.
이 절차에서는 두 개의 작은 절 개 만들어집니다. 첫 번째 절 개 노출 하 고, 간 좌 엽을 resect 하는 것입니다 그리고 또 다른 작은 절 개 비장 세포의 intrasplenic 이식에 대 한 폭로 이루어집니다. 이 절차는 어떤 전문된 외과 기술이 필요 하지 않습니다 그리고 그것은 5-7 분 더 적은 스트레스와 고통, 빠른 복구, 및 더 나은 생존에에서 완료 될 수 있다. 우리 마우스 (유전자 변형 C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), 뿐만 아니라 부분적으로 hepatectomized 끄 덕에에서 인간의 기원 (NeoHep)의 세포 처럼 hepatocyte 표현 녹색 형광 단백질 (GFP)에서 절연 hepatocytes의 이식 설명 했다. SCID 쥐입니다.

30% 부분 hepatectomy 후 hepatocyte 확산: 간 30 %hepatectomy 후 남은 hepatocytes의 확산 immunohistochemical (IHC) 세포 확산 표식 기-67에 대 한 얼룩에 의해 시험 되었다. 하루 게시물 hepatectomy 쥐 했다 안락사, 나머지 간 엽 excised 했다, 및 파라핀 섹션 가져온. 섹션은 뒤에 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 활용 된 이차 항 체와 라벨 기-67 항 체와 스테인드 했다. 디 아미노 Benzidine (한 덩어리)으로 사용 되었다 기판 HRP에 대 한 갈색 색상의 개발에 대 한 스테인드 셀을 식별 하기 위해. 핵 카운터 되며 물과 20 X 객관적인 현미경 아래에서 본 했다. 그림 1 간 섹션의 대표적인 IHC 이미지를 보여준다. 약 13% 셀 (13.66 ± 0.317, N = 3)의 기-67 했다 30 %hepatectomy 마우스 간에서 hepatocyt...

우리는 끄 덕의 부분 hepatectomy (PHx) 및 비장을 통해 세포 이식 수행을 위한 프로토콜을 설명 했습니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 쥐. 이 프로토콜에서 절 개 노출 하 고 셀의 intrasplenic 이식에 대 한 또 다른 절 개에 의해 따라 간 좌 엽 resect 이루어집니다.

끄 덕 임에서 부분 Hepatectomy 후 Hepatocytes의 intrasplenic 이식 SCID 마우스

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

급성 간부전 환자를 치료하기 위해 간세포 이식은 전체 장기 이식의 대안으로 사용됩니다. AHF를 유도하기 위한 기술로 부분 간절제술이 사용됩니다. 또한, 이는 세포 기반 치료 과정 중의 세포 생착 및 증식을 조사하는 데에도 활용됩니다.마우스는 이러한 목적의 간 절제술을 수행하기 위해 가장 많이 연구된 모델 중 하나입니다. 본 영상에서는 부분 간 절제술을 시행한 후 NOD. SCID 마우스의 비장에 간세포를 이식하는 과정을 보여드리겠습니다.실험을 시작하기 전, 해당 실험 수행을 위해 적절한 동물 윤리 위원회로부터 필요한 승인을 받았는지 확인하십시오. 본 절차에서는 두 군데의 작은 절개를 시행합니다. 첫 번째 절개는 부분 간 절제술을 위한 것으로, 간을 노출시키기 위해 검상돌기 바로 아래에 약 1cm 길이로 절개합니다.세포를 이식하기 위해 동물의 비장을 노출시키도록 왼쪽 외측 부분에 더 작은 절개를 가합니다. 이 방법의 장점은 동물에게 가해지는 외상과 통증이 적고 회복이 빠르며 생존율이 거의 100%에 달한다는 것입니다. 또한, 이 절차는 특별한 외과적 기술을 필요로 하지 않으며 5~7분 이내에 빠르게 완료할 수 있습니다.본 영상에서는 NeoHep이라 불리는 간세포 유사 세포와 형질전환 GFP 마우스에서 분리한 간세포를 부분 간절제술을 시행한 NOD. SCID 마우스에 이식하는 과정을 시연하겠습니다. 이 절차는 이식할 세포의 종류에 제한을 두지 않습니다.모든 수술 도구와 PBS는 수술 전 적절히 멸균하여 준비하였다. 마우스의 무게를 측정한다. 본 절차에는 무게가 14~18g 사이인 6~8주령의 NOD.SCID 마우스가 사용된다.마우스 복부의 중앙, 상단 및 왼쪽 부분을 면도합니다. 다듬어진 털을 제거하기 위해, 면도한 부위에 제모 크림을 바릅니다. 4~5분 동안 기다린 후 털을 부드럽게 제거합니다.산소 실린더 밸브를 엽니다. 마우스를 Isoflurane 챔버에 넣습니다. 산소 유량을 4 L/min으로 조절합니다.마취 유도를 위해 이소플루란 기화를 4%로 조절합니다. 발가락을 부드럽게 집어 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인합니다. 생물안전작업대 내부에 수술판을 배치합니다.마우스의 복부가 위를 향하고 머리 앞부분이 Isoflurane 및 산소 공급 장치와 연결된 노즈 콘(nose cone) 내부에 위치하도록 수술판 위에 놓습니다. 마취 유지를 위해 Isoflurane 기화 농도를 2%로 낮춥니다. 70% 에탄올에 적신 멸균 면봉으로 피부를 닦아 소독합니다.흉골 바로 아래, 검상돌기에는 수직이고 늑골에는 평행하게 피부에 약 1cm의 횡절개를 가합니다. 절개 부위 근처의 피부와 복막을 조심스럽게 분리합니다. 간의 좌엽을 노출시키기 위해 검상돌기 바로 아래의 복막층을 따라 횡절개를 가합니다.물에 적신 면봉 두 개를 사용합니다. 면봉 하나를 절개 부위의 복부 쪽에 두고, 다른 면봉 하나를 횡격막 쪽에 둡니다. 이제 횡격막 쪽으로 둔 면봉 끝을 부드럽게 누르면서, 다른 면봉으로 밀어내듯 밀어서 간의 좌엽을 들어 올립니다.미세 해부용 핀셋을 사용하여 간문 근처의 좌측 외엽 기저부에 실크사의 루프를 겁니다. 매듭을 살짝 조인 후, 실크사를 간엽 기저부 쪽으로 최대한 밀어 넣습니다. 매듭을 단단히 조이고 반대편에 두 개의 매듭을 추가로 묶습니다.미세수술용 가위로 묶은 엽을 절단합니다. 이 이미지는 절제 후 남은 왼쪽 엽의 부분을 보여줍니다. 4-0 Catgut 흡수성 봉합사로 연속 봉합하여 복막을 꿰맵니다.동일한 4-0 Catgut 흡수성 봉합사를 사용하여 불연속 또는 단속 봉합법으로 피부를 폐쇄합니다. 봉합 부위 주변에 Betadine을 도포합니다. 29G 바늘이 장착된 1 mL 인슐린 주사기에 50 µL의 IMDM에 부유시킨 간세포 또는 NeoHep을 준비하여 유지합니다.마우스의 왼쪽 측면이 위를 향하도록 놓습니다. 비장 부위를 확인하고 피부를 가로 방향으로 절개합니다. 복막층을 2~3mm 절개하여 비장을 노출시킵니다.젖은 면봉 두 개 사이에 비장을 놓고 조심스럽게 들어 올립니다. 비장 피질에 바늘을 부드럽게 찔러 세포 현탁액을 비장 내로 주입합니다. 4-0 봉합사를 사용하여 연속 봉합으로 복막을 닫고, 단속 봉합으로 피부를 봉합합니다.봉합 부위에 Betadine을 도포합니다. 12 mg의 항생제 Cefotaxime이 포함된 saline 100 µL를 복강 내로 주입합니다. 12 µg의 진통제 Meloxicam이 포함된 saline 100 µL를 복강 내로 주입합니다.수술 후 3일 동안 매일 투여합니다. 이소플루란 기화기를 닫고 마우스를 케이지에 넣습니다. 동물은 수 초 내에 의식을 회복합니다.30% 간 절제술 후 24시간이 지난 시점의 간세포 증식을 세포 증식 마커인 Ki-67을 이용한 간 조직 절편의 면역조직화학 염색으로 분석하였습니다. 해당 절편을 염색한 후, 검출을 위해 anti-Ki-67 horseradish peroxidase 접합 2차 항체를 사용하였으며, 갈색으로 발색시키기 위해 기질로 Di-Amino Benzadine을 사용하였습니다. 핵은 hematoxylin으로 대조 염색하였습니다.이 이미지에서 갈색으로 염색된 세포들은 Ki-67 양성인 증식 중인 간세포입니다. 이식 10일 후 마우스를 안락사시키고 간을 검사하였습니다. 여기에 대표 이미지를 나타내었습니다.재생된 간에서 우측 외측엽, 우측 내측엽 및 좌측 내측엽을 절제하고 5 µm 두께의 절편을 얻었습니다. 이 절편들을 1차 토끼 다클론성 anti-GFP 항체와 2차 anti-rabbit Alexa Fluor 594 항체로 염색하였습니다. 핵은 DAPI로 대조 염색하였습니다.이 이미지는 적색으로 보이는 녹색 형광 단백질을 발현하는 간세포의 호밍(homing)을 보여줍니다. NeoHep이라 불리는 인간 유래 간세포 유사 세포를 이식했을 때, 간 절제술을 받은 수혜 마우스의 간 조직 절편에서 인간 Albumin과 인간 Connexin 32의 발현이 관찰되었습니다. 수술 10일 후, 혈청 내 간 분비 효소의 생화학적 분석 결과 aspartate aminotransferase, alanine amintransferase, alkaline phosphatase 수치가 정상으로 회복되었음을 확인하였습니다.마찬가지로, haematoxylin and eosin 염색을 통한 간 절편의 조직학적 검사 결과, 수술 10일 후 아무런 이상이 나타나지 않아 간이 적절히 회복되었음을 보여주었습니다. 몇 가지 주의사항을 지키는 것이 중요합니다. 나일론 실의 매듭이 간 엽의 기저부에 위치하도록 하십시오.반대편에 두 개의 단단한 매듭을 추가로 묶는 것을 잊지 마십시오. 또한 실과 너무 가까운 곳을 자르려고 하지 마십시오. 비장으로 세포를 이식할 때는 바늘을 정확히 수직으로 찌르고, 깊이는 2 mm를 초과하지 않아야 합니다. 피부를 봉합할 때는 상처 클립(wound clips)의 사용을 피하십시오.대신 4-0 봉합사로 폐쇄하십시오. 상처 클립은 생쥐의 자연스러운 움직임을 제한하며, 종종 클립이 느슨해져 금방 빠져나오게 됩니다. 동물을 케이지에 다시 넣은 후, 케이지 안에 멸균 콘플레이크 몇 조각을 넣어주고 5% 포도당이 함유된 멸균수를 제공하십시오.동물 수술 경험이 없는 경우, 정상 면역 능력을 가진 마우스에서 부분 간 절제술과 이식을 각각 별도로 연습한 후, 단일 동물에서 두 절차를 모두 수행하십시오. 면역 능력을 가진 마우스에서 100% 생존율을 달성한 후에만 면역 결핍 NOD. SCID 마우스에서 해당 절차를 수행하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

설립 demyelination과 생쥐의 척수 코드에 마우스를 신경 줄기 세포 (NSCs)의 이식이 자세히 있습니다. NSCs의 준비는 흉부 척추 9 조 (T9) 및 NSCs의 이식의 laminectomy은 생쥐의 사전 및 사후 수술 치료와 함께 설명되어 있습니다.

Neurotropic 마우스 간염 바이러스에 감염된 마우스의 척수 코드에 마우스 신경 줄기 세포의 이식 외과

이 비디오는 인간 면역 체계와 간 세포를 가진 이중 인간화 마우스 모델을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이는 인간 간 세포와 조혈 줄기 및 전구 세포를 비장 내 주사를 통해 형질전환 면역 결핍 마우스에 이식하여 간 세포의 생착과 인간 면역 세포의 발달을 유도하는 것을 포함합니다.

인간 간 세포와 면역 세포를 이용한 인간화 마우스 모델 개발

면역 결핍 쥐에서 인간 종양 이종 이식은 암 생물학을 연구하는 중요한 도구입니다. 인간의 간세포 암 세포 또는 종양 파편에서 피하 및 간내 이종 이식을 생성하는 특정 프로토콜이 설명되어 있습니다. 받는 사람 생쥐의 부분 간 절제술에 의해 유도 된 간 재생은 간내 생착을 촉진하기위한 전략으로 제시된다.

면역 결핍 마우스의 피하 및 간내 인간의 간세포 암 이종 이식의 생성

여기에서는 미성숙 및 확장 가능한 인간 간 줄기 세포의 이식 후 Alb-toxin receptor mediated cell knockout(TRECK)/SCID 마우스에서 생성된 새로운 인간화 마우스 간 모델을 제시합니다.

인간 간 줄기 세포를 이용한 인간형 마우스 간 세대

여기, 우리 신생아 (0 일) 쥐에서 왼쪽된 간 엽의 부분 절제 하는 새로운 방법을 제시. 이 새로운 프로토콜은 급성 간 상해 및 신생아 속에서 상해 응답 공부 적합 합니다.

부분 Lobular Hepatectomy: Morphologic 간 재생에 대 한 수술 모델

여기, 우리 현재 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 hepatocytes를 사용 하 여 가족성 콜레스테롤 혈 증의 인간 간 공상 마우스 모델을 생성 하는 프로토콜. 콜레스테롤 혈 증에 대 한 새로운 치료법을 테스트 하기 위한 유용한 모델입니다.

가족성 콜레스테롤 혈 증 인간의 간 공상 마우스 모델을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 Hepatocytes

이 프로토콜은 인간 면역 계통 및 간 세포 둘 다로 인간화한 마우스를 설치하는 믿을 수 있는 방법을 제공합니다. 인간 간세포 및 CD34+ 조혈 줄기 세포의 경내 주사를 통해 달성된 이중 재구성 면역 결핍 마우스는 인간 면역 결핍 바이러스-1 감염에 취약하고 관찰된 바와 같이 간 손상을 재현합니다. HIV에 감염된 환자.

HIV 관련 간 병인을 위한 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델 구축

여기서, 간세포암(HCC)의 전형적인 면역 특징을 재기하는 간암의 임상적으로 관련 있는 뮤린 모델의 개발을 설명한다.

간 염증과 섬유증의 설정에서 발생하는 간세포암의 종양 성 간세포 유도 직교 마우스 모델

지질이 함유된 간세포는 간 재생에 내재되어 있지만 일반적으로 밀도 구배 원심분리 시 손실됩니다. 여기에서 우리는 지방성 간세포를 유지하는 최적화된 세포 분리 프로토콜을 제시하여 마우스에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 생성합니다.

생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리

이 프로토콜에서는 마우스에서 성공적인 orthotopic 간 이식(OLT) 모델의 구현에 대해 논의합니다. 또한 마우스에서 성공적인 OLT 후 동종이식 개통을 추가로 분석하기 위한 보조제, 특히 microcomputationd tomography(microCT) 스캔을 활용하는 보조제에 대해서도 논의합니다.

Microcomputed Tomography 혈관 조영술을 활용한 마우스의 성공적인 Orthotopic 간 이식

부분 2/3(66%) 간절제술의 마우스 모델은 문헌에 잘 설명되어 있지만, 간 이식 후 소형 증후군을 모방한 더 확장된 간절제술은 거의 사용되지 않았습니다. 우리는 건강한 마우스에서 약 50%의 수술 후 치사율을 초래하는 마우스 모델에서 확장된 78% 간 절제술 절차에 대해 설명합니다.

마우스 수술 모델에서 확장된 78% 간절제술

배우세요 NOD.SCID 마우스에서 부분 간절제술 후 비장 내 간세포 이식 기법을 통해 급성 간부전 치료를 위한 세포 기반 요법을 연구하는 방법입니다. 이 프로토콜은 세포 이식 및 증식 메커니즘을 탐구하는 데 활용됩니다.

끄 덕 임에서 부분 Hepatectomy 후 Hepatocytes의 intrasplenic 이식 SCID 마우스

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