인간의 맨 틀 세포 림프 종의이 종이 식 마우스 모델에서 종양 Engraftment

이 방법의 전반적인 목표는 맨틀 세포 림프종에 대한 이종 이식 마우스 모델을 확립하여 이 질병에 대한 치료 전략을 개발하는 것입니다. 이 방법은 다양한 치료 전략의 치료 결과와 같은 혈액 종양학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내에서 인간 림프종 세포에 대한 약물의 효과를 연구할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 맨틀 세포 림프종 치료로 확장되는데, 이 모델을 사용하면 환자 유래 세포에 대한 치료 효과를 연구하는 것이 가능할 뿐만 아니라 편리하기 때문입니다. 이 방법은 맨틀 세포 림프종의 치료적 측면에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다양한 유형의 림프종을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 환자 유래 이종이식편을 얻기 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었을 때, 생체 내 B 세포 이동과 이 과정에 대한 일부 치료법의 효과를 연구하고 싶었을 때. 맨틀 세포 림프종 혈액 샘플 12ml를 동일한 부피의 RPMI 1640 Medium으로 희석합니다. 그런 다음 사용하기 전에 밀도 구배 매체를 여러 번 반전시킵니다.

50ml 원심분리기 튜브에서 15ml의 밀도 구배 매체를 흡입합니다. 흡인기의 도움으로 두 층을 혼합하지 않고 밀도 구배 매체 위에 희석된 혈액 샘플을 신중하고 부드럽게 추가합니다. 그런 다음 브레이크를 끄고 혈액 샘플을 400g으로 실온에서 40분 동안 원심분리합니다.

멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 중간층에서 단핵 혈액 세포를 흡인하고 깨끗한 튜브로 이동합니다. 단핵 세포를 세척하기 위해 1% 소 태아 혈청이 포함된 3가지 부피의 멸균 단일 강도 인산염 완충 식염수를 예상 세포 현탁액에 추가합니다. 적절한 혼합을 위해 세포 현탁액을 여러 번 피펫팅합니다.

그런 다음 실온에서 10-15분 동안 400-500g에서 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 상등액을 버리고 세포 펠릿을 1% 소 혈청 알부민과 함께 단일 강도 인산염 완충 식염수로 세척합니다. 샘플을 원심분리합니다.

그런 다음 상등액을 버리고 1 또는 2 밀리리터의 인산염 완충 식염수에 세포를 재현탁시킵니다. 그런 다음 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산합니다. Phosphate Buffered Saline에서 세포를 희석한 다음 세포를 5ml 폴리스티렌 튜브에 피펫팅하고 세포 현탁액에 100마이크로리터의 항체 칵테일을 추가합니다.

적절한 혼합을 위해 세포 현탁액을 여러 번 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 층류 후드에서 실온에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 그 동안 B 세포 농축 키트의 자기 입자를 30초 동안 소용돌

그런 다음 150마이크로리터의 자성 입자를 2밀리리터의 세포 현탁액에 추가합니다. 세포 자분 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 샘플 부피를 2.5 밀리리터로 조정 한 다음 튜브를 자석에 넣고 3-5 분 동안 더 배양합니다.

배양 후, 한 번의 연속 동작으로 새 튜브의 자석에 부착된 튜브에서 세포 현탁액을 디캔팅합니다. 그런 다음 자동화된 세포 계수기를 사용하여 현탁액에 있는 B 세포의 총 수율을 계산합니다. 풍성하게 한 B 세포의 순수성을 확인하기 위하여는, 15-30 분 동안 실내 온도에 다른 fluorochromes와 결합된 반대로 CD19, CD20 및 반대로 CD45 항체로 대략 50의, 000의 세포를 배양하십시오.

그런 다음 1ml의 단일 강도 인산염 완충 식염수와 1% 소 혈청 알부민으로 세포를 세척합니다. 실온에서 5분 동안 400-500g으로 셀을 원심분리합니다. 원심분리 후, 상등액을 버리고 펠릿을 200마이크로리터의 Phosphate Buffered Saline에 재현탁합니다.

이 방법을 사용하여 일반적으로 90% 이상인 유세포 분석을 사용하여 B 세포의 순도를 분석합니다. 150 microlit의 단일 강도 Phosphate Buffered Saline에 세포를 현탁시킵니다. 그런 다음 성별에 관계없이 6-7주 된 쥐의 꼬리 정맥에 세포 현탁액을 정맥 주사합니다.

환자에서 추출한 혈액에서 분리한 림프종 세포를 마우스의 꼬리 정맥에 정맥 주사하는 것도 성공적인 생착을 보장하는 데 중요합니다. 이산화탄소 챔버에서 생쥐를 희생 한 후 다른 장기를 수집하십시오. 그런 다음 주사기 피스톤 뒷면이 있는 70미크론 필터에서 장기를 기계적으로 파괴하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.

400g에서 500g 사이의 혈액을 제외한 모든 샘플을 5분 동안 원심분리하고 상등액을 버립니다. 단일 강도 Ammonium-Chloride-Potassium 완충액을 사용하여 혈액, 골수, 비장 및 간 세포를 용해시킵니다. 유세포 분석기로 이동하기 전에 마우스에서 분리된 장기에서 유래한 세포를 필터링하여 단일 세포 현탁액을 얻는 것은 막힘을 방지하는 데 중요합니다.

항-CD19, CD20 및 CD45와 같은 B 세포 특이적 항체를 사용하여 세포를 염색합니다. 유세포 분석을 사용하여 각 기관에서 유래한 B 세포에 CD19 양성, CD20 양성 및 CD45 양성 항체를 제공했습니다. 게이트 세포를 기반으로 맨틀 세포 림프종을 주입한 마우스에서 얻은 장기 특이적 및 이식된 종양 세포를 정량화합니다.

본 연구에서는 맨틀 세포 림프종에서 농축 전후의 B 세포의 순도를 연구하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. 단핵 맨틀 세포 림프종을 특성화하기 위해 CD45, CD19, CD5, CD200, CD20 Kappa 및 Lambda와 같은 B 세포 특이적 마커가 사용됩니다. 유세포 분석은 CD45, CD19, CD20 및 CD5에 대해 양성으로 염색된 세포를 보여줍니다.

그리고 이들은 특성화를 위해 선택됩니다. CD23 및 CD200에 대해 염색되지 않은 세포도 선택됩니다. 장기 특이적 생착 정도는 유세포 분석을 통해 장기를 추가로 처리한 다음 B 세포를 분석하여 조사합니다.

여기에 보여진 것은 비장, 골수 및 간과 같은 기관을 사용하여 두 환자로부터 얻은 생착 패턴의 비교 표현입니다. 이 기법을 숙달하면 3주 이내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 이종 이식에 사용되는 PBMC를 풍부하게 하고 주름진 머리, 구부정한 등, 뒷다리 마비 및 체중 감소와 같은 질병의 활력 징후가 있는지 마우스에 대한 정기적인 검사를 유지하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라, 이종 이식편은 예를 들어 개인 맞춤형 의학을 수행하는 경향이 있는 다른 유형의 림프종에 적용될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 혈액 종양학 분야의 다른 연구자들이 면역 결핍 결핵 쥐의 환자에서 유래한 맨틀 세포 림프종을 확립하는 방법을 탐구할 수 있는 길을 열 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 치료 전략을 이해하기 위해 환자 유래 PBMC를 정제하고 이를 사용하여 면역 결핍 마우스를 이종 이식하는 방법을 잘 알게 될 것입니다.

1차 인간 혈액 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이러한 절차를 수행할 때 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.