Name: 인간의 맨 틀 세포 림프 종의이 종이 식 마우스 모델에서 종양 Engraftment (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 학습하세요 인간 맨틀세포림프종(MCL) 제노그래프트 마우스 모델 수립 방법을 통해 환자 유래 세포를 이용한 치료 효과를 연구하고 다양한 림프종 치료 전략 개발에 활용하는 기술을 익히세요.

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이 작품은 리그 Genevoise 죄수 르 암에 의해 지원 되었다 Fondation 박사 뒤부아 Ferriere Dinu Lipatti, Oncosuisse KPS OCS, OCS-02260-08-2008, 2914-02-2012, 스위스 국립 과학 재단 그랜트 31003A_156760 및 310030 153456.

인간의 혈액 샘플은 로컬 윤리 제네바 대학 병원의 인간 실험 위원회에 의해 승인 절차에 따라 사용 되었다.
동물 절차는 기관 윤리 위원회의 동물 관리 제네바, 스위스 및 Cantonal 수의 사무실에 따라 수행 했다 (승인 번호: GE/26/15).
1. 밀도 그라데이션 분리 하 여 기본 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)의 준비
참고: 말 초 혈액의 3-5 mL MCL leukemic 단계에서 제시 하는 환자에서 얻은 했다. 진단 그리고 염색체 전 좌 t(11;14)의 존재와  D1의 overexpression에 의해 확인 이후에 cytometry (CD5 +, CD23−, CD200 +, 단일 클로 널 B 세포 인구)에 대 한 표준 진단 기준에 따라 설립 되었다. 모든 경우에 단일 클론 B 세포를 구성 > 총 B 세포 인구의 90%. 나머지는 monocytes 그리고 몇몇 T 세포 주로 했다.
<ol><li>로스웰 파크 기념 연구소 매체 1640 (RPMI) (그림 1A)의 5 mL로 MCL 혈액 샘플의 (1:1) 5 mL를 희석.</li>
	<li>철저 하 게 혼합 되도록 사용 하기 전에 여러 번 밀도 그라데이션 미디어 (자료 테이블) 반전.</li>
	<li>피 펫 흡 인기를 사용 하 여 15 mL 원심 분리기 튜브에 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 밀도 그라데이션 미디어는 흡 인기 (혈액 밀도 그라데이션 미디어 비율을 2:1, 예를 들어, 밀도 그라데이션 미디어의 5 ml는 혈액 10 mL 이어야 한다)를 사용 하 여 15 mL 원심 분리기 튜브를 통해 희석된 혈액 샘플 레이어. 한다 주의 하지 믹스 (그림 1B, C) 두 개의 레이어.</li>
	<li>원심 브레이크 해제와 함께 실 온에서 40 분에 대 한 400 x g에서 샘플을 원심.</li>
	<li>중간 계층 (약간 흰, 얇은 반지 화살표 (그림 1D, E)으로 표시)을 발음 부드럽게 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 단 세포를 포함 하 고 깨끗 한 관으로 그들을 전송.</li>
	<li>단 셀의 세척<ol>
<li>전송 된 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 예측 하 고 그것에 추가 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 살 균 1의 3 볼륨.</li>
		<li>여러 번 왔다 갔다 pipetting으로 현 탁 액을 혼합.</li>
		<li>실 온에서 10-15 분 400-500 x g에서 정지 원심</li>
		<li>셀 공 세척 단계를 다시 반복 하는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 원하는 볼륨, 예를 들어, 1 또는 2 mL PBS의 셀 resuspend.</li>
		<li>자동된 셀 카운터 또는 수동으로 hemocytometer (Neubauer 챔버)을 사용 하 여 셀의 개수를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. B 세포 부정적인 선택에 의해 B 세포의 농축
<ol><li>50 x 106 셀/mL의 최종 농도에 셀 PBS에 희석.</li>
	<li>하단 폴리스 티 렌 튜브 라운드 5 mL에 셀을 전송. 세포 현 탁 액 2 mL를 B 세포 농축 키트에서 항 체 칵테일의 100 µ L을 추가 하 고 (그림 2-1) 위아래로 pipetting으로 부드럽게 혼합.</li>
	<li>10 분 동안 실내 온도에 세포를 품 어.</li>
	<li>짧게 소용돌이 자석 입자 키트에 제공 된는 B 세포 농축 30 s (그림 2-2). 샘플의 2 mL에 자석 입자의 150 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 또 다른 5 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>1 x PBS 2% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)와 2.5 mL를 샘플 볼륨을 가져와. 자석에 튜브를 놓고 또 다른 3-5 분 (그림 2-3)에 대 한 튜브를 품 어.</li>
	<li>장소, 그리고 하나의 연속 모션 튜브와 자석까지, 풍부한 세포 현 탁 액을 신선한 튜브 (그림 2-4) 수집할 튜브를 가만히 따르다. 자동된 셀 카운터 또는 B 세포의 총 수익률을 얻을 수 있는 hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 셀을 계산 합니다. 참고: 일반적으로 수익률은 ~ 105 B 셀/mL 정상 B 세포와 106 셀/MCL l x 5-50.</li>
	<li>B 세포 농축의 순도 확인<ol>
<li>받아 ~ 50000 셀 안티-CD19/CD20 항 체와 세포를 품 어 고 (1시 20분 희석)와 안티 CD45 항 체 결합 다른 형광 (1시 10분 희석) 15-30 분 동안 실내 온도에.</li>
		<li>PBS + 1% BSA x 1의 1 mL로 세척 하 고 400-500 x g 5 분 동안에 세포를 원심 resuspend ~ 200 µ L의 PBS에 셀.</li>
		<li>Cytometry에 의해 셀 샘플을 확보 하 고 B 세포의 순도 대 한 분석. 순도 대부분 > 90%가이 방법 (그림 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다.이 종이 식 마우스 모델의 개발
<ol><li>1 x PBS (마우스 당 주사 하는 데 필요한 볼륨)의 150-200 µ L에 106 셀 x 40-60을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 150 µ L를 정 맥 주사 (i.v.) (그림 4A) 성별에 관계 없이 오래 된 6-7 주 immunodeficient 끄 덕 scid 감마 (NSG) 쥐의 꼬리 정 맥 각에.</li>
	<li>쥐 인간 림프 종 ~ 10 주에 대 한 개발을 허용 합니다. 참고: 기본 인간 림프 종 세포 인간 림프 종 세포 라인 (3 주)에 비해 종양 개발에 훨씬 더 오래 걸릴.</li>
	<li>동물 체중 감소 같은 치명적인 질병의 증상을 보여 시작, 뻗 치고 머리, 감소 활동, 뒷 다리 마비, 등, 희생 쥐 CO2 질 피를 심장 심장 찔린 다음에 의해.</li>
	<li>수집 다른 쥐를 해 부하 여 골 수, 비장, 그리고 간 같은 기관과 종양 engraftment 분석에 대 한 희생의 때에는 심장에서 혈액을 그리기에 의해 말 초 혈액을 수집 (그림 4B -F).</li>
</ol>4. chimerism 분석 Engrafted 다른 장기에 종양 세포의
<ol><li>다른 장기를 수집한 후 기계적 장애 적혈구 (RBC) 세포 혈액 및 골 수, 비장, 대 500 µ L 간 2 mL에 대 한 염화 염화 칼륨 버퍼 x 1의 200 µ L를 사용 하 여 다음 단일 셀 정지를 생성 하 여 처리 .</li>
	<li>계산 하 고 인간 B 세포 특정 항 체, 즉, 안티-CD19, 안티-CD20, 및 안티-CD45를 사용 하 여 셀을 얼룩. 참고: NSG 마우스 부족 B 세포 그리고 그러므로 분석에 대 한 셀은 스테인드 인간의 특정 B 세포 마커.</li>
	<li>Cytometry에 의해 게이팅 (CD19 + CD20 +, CD45 +) B 세포에 의해 각 기관에서 파생 된 세포를 분석 합니다.</li>
	<li>4.3 (그림 4G) 단계에서 표시 된 대로 문이 셀에 따라 MCL 주입 마우스에서 파생 하는 다른 장기에 engrafted 종양 세포를 계량. 주: 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chemokines%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human chemokines: an update.</a> Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).</li>
<li>Baggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+leukocyte+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines and leukocyte traffic.</a> Nature. 392, 565-568 (1998).</li>
<li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+CA+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th edition, (2001).</li>
<li>De Silva, N. S., Klein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+B+cells+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of B cells in germinal centres.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).</li>
<li>Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+peripheral+blood+involvement+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma.</a> Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).</li>
<li>Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma%3A+diagnostic+criteria%2C+clinical+aspects+and+therapeutic+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems.</a> Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).</li>
<li>Herrmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+overall+survival+in+advanced+stage+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+treatment+strategies+may+not+provide+superior+outcomes+in+mantle+cell+lymphoma%3A+overall+survival+exceeding+7+years+with+standard+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies.</a> Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).</li>
<li>Iyengar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+primary+mantle+cell+lymphoma+engraftment+in+NSG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice.</a> Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).</li>
<li>Klco, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+genetically+defined+subclones+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans%3A+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).</li>
<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).</li>
<li>Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+drug+response+in+patients+and+in+the+clonogenic+assay+with+solid+human+tumour+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts.</a> Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).</li>
<li>Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27256571">Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma.</a> J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

임상 약물 개발의 고급 단계에 있지만 약물 발견에 사용할 수 없습니다 수 있습니다. 인간 세포 xenotransplantation 동물 받는 초기 단계 약물을 테스트 하기 위해 개발 하는 노력 추구 오래 있다. 여기 우리가 제시 하는 동물 모델을 인간의 이식 거부를 방지 하 고 인간의 질병, MCL 같은 모델을 설정할 수 있습니다. 현재 인간의 종양 engraftment 및 종양의 성장 메커니즘 연구의 종이 식 모델입니다. 여기 우리는 NSG 마우스 림프 종 engraftment의 더 중대 한 성공을 달성 하기 위하여 날짜를 가장 면역 결핍 마우스 모델 중 하나를 사용 합니다. NSG 마우스 부족 성숙한 T 세포, B 세포, NK 세포. 그들은 또한 cytokine 신호 장애 있다 하 고 타고 난 면역 반응에 있는 결함.
밀도 기울기에 의해 기본 MCL 샘플에서 림프 구 준비는 적혈구 및 혈소판 같은 다른 셀 형식을 제거 하는 중요 한 단계 이다. 전통적으로, 조밀도 기온 변화도...

자연으로 세포는 면역 감시에 중요 역할 그리고 림프 구 매매 항 원 특정 면역1,2설치에서 중요 한 단계. 이 프로세스는 naïve T 세포 혈 류를 thymus에서 그리고 동족 항 원을 만나는 2 차 림프 기관, 림프절, Peyer의 패치, 또는 비장를 포함 하 여 거기에서의 마이그레이션 포함 됩니다. B 세포 골 수에서 분화 하 고 2 차 림프 기관3의 낭으로 순진한 셀으로 마이그레이션할. 이 B 세포 중 일부는 그들의 수용 체와 항 원 바인딩 하 고 특정 T 세포에 의해 활성화 됩니다. 확산 및 B 세포의 뿌리의 맨 틀 영역으로 비-활성화, 순진한 B 셀을 푸시합니다. 활성화 된 세포 차별화할 수 있습니다 다음 메모리 B 세포, 몸, 순찰 또는 골4마이그레이션하는 플라스마 세포를 은닉 하는 면역 글로불린으로 성숙.
MCL 맨 틀 영역에서 순진한 B 림프 톨 종양으로 변환 될 때 발생 합니다. 이 림프 종 세포 림프 기관의 microenvironment에 있으며 특정 T 림프 구 제어 독립적으로 격 증. 그러나, 밀도의 특정 단계에서 그들은이 틈새에서 탈출 하 고 다른 장기에 틈새에 대 한 검색에서 혈 류에서 recirculate. 접착 분자의 복잡성과 발산 및 그들의 수용 체의 성행위, 고려이 셀룰러 밀매 vivo에서 의 메커니즘은 제대로 이해 하 고 따라서 치료를 저해. 림프 종 B 세포 새로운 microenvironments에 도달 하지 않도록 하려면이 마이그레이션 프로세스를 효과적으로 차단 하 새로운 방법 필요 합니다.
MCL B 세포 악성 종양을 치료 하는 가장 어려운 중 하나입니다. MCL의 종양 약 형의 개발 다단계 폭포, 독특한 생물 학적 속성의 취득에 의해 특징의 결과 이다. 진단의 시간, 대부분의 환자 (70%) 이미 현재 전파 질병, 비장, 골 수, 또는 위장5,6extranodal 참여 전시 하는 경우의 대다수와. 치료 환자에서 몇 년 이내에 저항 하는 종양에 의해 재발 하더라도 기존의 화학요법 유도 단기7,8에서 높은 면제 율 일반적입니다. 여기에 우리가 현재 MCL 보급의 기본 생물학을 이해 하는 것을 도울 수 있는 새로운 질병 모델: 우리는 환자의 기본 종양 세포에서 유래 하는 인간의 MCL이 종이 식 마우스 모델을 설립. 우리는이 모델 MCL 보급에 대 한 치료 전략을 개발 하 고 가능 하 게 최적의 진단 및 재발 환자의 치료에 대 한 새로운 임상 원근법을 제공 도움이 될 것입니다 바랍니다.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-paque 매체</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>단핵 세포 분리를 위한</td></tr><tr><td>RPMI 매체 1640</td><td>Gibco-Life technologies</td><td>61870-010</td><td>혈액 샘플 희석용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>세포 세척</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>분리 중 세포 세척에 사용되는 1% BSA로 PBS 제조용</td></tr><tr><td>CD19-APC700</td><td>벡크만쿨터</td><td>B49212</td><td>human pan-B cell marker</td></tr><tr><td>CD20-APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21693</td><td>human pan-B cell marker</td></tr><tr><td>CD20-ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3607</td><td>human pan-B cell marker</td></tr><tr><td>CD5-PC 5.5</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN A70203</td><td>human T cell marker</td></tr><tr><td>CD23-PE</td><td>Pharmingen</td><td>555711</td><td>MCL에 일반적으로 없는 세포 표면 단백질</td></tr>, <tr><td>CD45 KO</td>, <td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td>, <td>Pan-leucocyte marker</td></tr>, <tr><td>CD200-PE</td>, <td>Pharmingen</td><td>552475</td> MCL, NOD scid gamma (NSG) 마우스<td>에 일반적으로 없는 세포 표면 단백질</td></tr><tr><td></td><td>, 이 연구</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에서 MCL 이종이식편을 개발하는 데 사용된 Charles River Laboratories 5557Easy sep Human B cell enrichment kit</td><td>줄기 세포 기술</td><td>19054</td>는 <td>B 세포를 농축하여 마우스에 주입하기 위한 순수 세포를 얻는 데 사용됨</td></tr><tr><td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>Navios</td>는 <td>MCL 샘플을 특성화하고 MCL 생착을 위한 기관을 연구하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>1X 염화암모늄 칼륨 완충액</td> 적혈 용해 <td></td><td></td><td>완충액(NH4Cl 8,024 mg/l; KHCO3 1,001 mg/l; 에디타. Na2&중간 점; 2H2O 3.722 마그네슘/L )</td></tr></tbody></table>

인간의 맨 틀 세포 림프 종의이 종이 식 마우스 모델에서 종양 engraftment

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B 세포는 주로 집에 면역 세포 순환에 그들은 핵심 선수 하 고 림프 기관에. 반면 정상 B 세포는 T 세포에 의해 자극 될 때만 증식, 종양 B 세포 생존과 정의 되지 않은 장기 틈새에서 자율적으로 확장. 맨 틀 세포 림프 종 (MCL)은 하나의 같은 B 세포 장애, 환자의 평균 생존 율은 4-5 년. 이는 유도 및 이러한 셀의 engraftment는 생존을 증가 하기 위하여 차단 하는 효과적인 메커니즘의 필요와 환자 들의 장 수에 대 한 호출 합니다. 따라서, 유도 장치에는 vivo에서 차단 하 여 MCL 치료제의 효능을 연구 하는 종이 식 마우스 모델을 개발 하기 위해 노력 최대 중요성 이다. 관련 전 임상 마우스 모델은 화면 새로운 치료제에 중요 한, 개발 초기 단계 약물 테스트를 인간 세포 xenotransplantation 받는 동물의 긴 추구 되어 있다. 이 동물 모델 인간의 이식 거부를 방지 하 고 인간의 질병에 대 한 모델 설정 개발 되 고 그것은 다른 림프 종 종류의 질병의 진행을 공부 하 고 전 임상 후보 약물에 대 한 테스트를 수행 하는 매우 유용한 도구 될 수 있습니다. 혈액 악성 종양, MCL 같은. 우리는 종이 식 마우스 모델을 연구 하 고 MCL에 대 한 새로운 치료 접근을 개발 하는 우수한 자원으로 될 것입니다 설립.

원고는 engraftment MCL 셀의이 종이 식 마우스 모델의 성공적인 개발을 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. (이 경우 MCL 셀에), 순수한 셀 인구의 준비는 매우 성공적인 MCL xenografts 개발에 중요 한 이다. 그림 1 밀도 그라데이션 분리에 의해 MCL 환자 혈액에서 단 세포 격리에 대 한 대리점 단계를 나타냅니다. 단 세포 쥐에이 종이 식 주입에 대 한 순수한 세포 인구를 부정적인 B 세포 농축 키트를 사용 하 여 순수 B 세포를 더 처리 됩니다. 위해서는 성공적인 MCL engraftment 최대 순도를 주의 한다. 이 메서드를 사용 하 여 얻은 순도 보통 > 90%. 나머지는 주로 monocytes 그리고 몇몇 T 세포 (데이터 표시 되지 않음) 했다.
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맨 틀 세포 림프 종 (MCL) B 세포 장애 치료 하기 어려운 이며, 그것은 동등 하 게 연구 하 고 치료제를 개발 기본 MCL의이 종이 식 마우스 모델을 설정 하기가 어렵습니다. 여기, 우리 생물학의 기본을 이해할 수 있도록 마우스에 MCL xenografts의 성공적인 설립을 설명 합니다.

인간의 맨 틀 세포 림프 종의이 종이 식 마우스 모델에서 종양 Engraftment

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

이 방법의 전반적인 목표는 외투세포 림프종의 제노그라프트 마우스 모델을 구축하여, 해당 질환에 대한 치료 전략을 개발하는 것입니다. 이 방법은 다양한 치료 전략의 치료 결과와 같이 혈액종양학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내(in vivo)에서 인간 림프종 세포에 대한 약물의 효과를 연구할 수 있다는 점입니다.이 기술의 시사점은 외투세포 림프종 치료로 확장될 수 있는데, 이 모델을 사용하면 환자 유래 세포에 대한 치료 효과를 연구하는 것이 가능할 뿐만 아니라 편리하기 때문입니다. 이 방법은 외투세포 림프종의 치료적 측면에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 유형의 림프종 연구에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 환자 유래 이종이식물을 확보하는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.우리가 처음 이 방법의 아이디어를 얻었을 때는, 생체 내 B 세포 이동과 일부 치료법이 이 과정에 미치는 영향을 연구하고 싶었을 때였습니다. mantle cell lymphoma 혈액 샘플 12 milliliters를 동일한 부피의 RPMI 1640 Medium으로 희석하십시오. 그다음, 밀도 구배 배지를 사용하기 전에 여러 번 뒤집어 섞어주십시오.50 mL 원심분리 튜브에 밀도 구배 매질 15 mL를 흡입하여 넣습니다. 아스피레이터를 사용하여, 두 층이 섞이지 않도록 밀도 구배 매질 위에 희석된 혈액 샘플을 조심스럽고 부드럽게 추가합니다. 그런 다음, 브레이크를 끄고 상온에서 400g로 40분 동안 혈액 샘플을 원심분리합니다.멸균된 파스퇴르 피펫을 사용하여 중간층의 단핵 혈구 세포를 흡입하고 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 단핵 세포를 세척하려면, 추정 세포 현탁액 부피의 3배량에 해당하는 1% fetal bovine serum이 포함된 멸균 단일 농도 Phosphate Buffered Saline을 첨가합니다. 적절한 혼합을 위해 세포 현탁액을 여러 번 피펫팅합니다.그런 다음, 샘플을 상온에서 400-500g로 10-15분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하고, 1% bovine serum albumin이 포함된 1배 농도 Phosphate Buffered Saline으로 세포 펠렛을 세척합니다. 샘플을 다시 원심분리합니다.그 다음, 상층액을 제거하고 Phosphate Buffered Saline 1~2 mL로 세포를 재현탁합니다. 이후 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포를 Phosphate Buffered Saline으로 희석한 다음, 5 mL 폴리스티렌 튜브에 세포를 분주하고 세포 현탁액에 항체 칵테일 100 µL를 추가합니다.적절한 혼합을 위해 세포 현탁액을 피펫으로 조심스럽게 여러 번 섞어줍니다. 그런 다음 라미나 플로우 후드 내의 실온에서 세포를 10분 동안 배양합니다. 그동안 B cell enrichment kit에 포함된 자성 입자를 30초 동안 볼텍싱합니다.그 다음, 2 mL의 세포 현탁액에 150 µL의 자성 입자를 추가합니다. 세포와 자성 입자 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 샘플 부피를 2.5 mL로 조절한 후, 튜브를 자석에 놓고 3~5분 동안 더 배양합니다.배양 후, 자석에 부착된 튜브에서 새로운 튜브로 세포 현탁액을 한 번의 연속적인 동작으로 디캔트합니다. 그런 다음, 자동 세포 계수기를 사용하여 현탁액 내 B 세포의 총 수득량을 측정합니다. 농축된 B 세포의 순도를 확인하기 위해, 서로 다른 형광색소가 결합된 anti-CD19, CD20 및 anti-CD45 항체와 함께 약 50,000개의 세포를 실온에서 15-30분 동안 배양합니다.그런 다음, 1x Phosphate Buffered Saline과 1% bovine serum albumin 1 mL로 세포를 세척합니다. 상온에서 400-500g로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 펠릿을 200 µL의 Phosphate Buffered Saline에 재현탁합니다.유세포 분석법을 이용하여 B 세포의 순도를 분석하며, 이 방법을 사용할 경우 일반적으로 90% 이상의 순도를 나타냅니다. 세포를 150 µL의 1배 농도 인산염 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline)에 현탁하십시오. 그 후, 성별에 관계없이 6~7주 된 마우스의 꼬리 정맥에 세포 현탁액을 정맥 주사하십시오.성공적인 생착을 보장하기 위해 환자 유래 혈액에서 분리한 림프종 세포를 마우스의 꼬리 정맥에 정맥 주사하는 과정 또한 매우 중요합니다. 이산화탄소 챔버에서 마우스를 희생시킨 후, 다양한 장기를 적출합니다. 그다음, 주사기 피스톤 뒷면을 이용하여 70 micron 필터 위에서 장기를 기계적으로 파쇄하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.혈액을 제외한 모든 샘플을 400에서 500g로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 혈액, 골수, 비장 및 간 세포를 용해하기 위해 1배 농도의 Ammonium-Chloride-Potassium 버퍼를 사용합니다. 유세포 분석기로 옮기기 전, 마우스에서 분리한 장기 유래 세포를 여과하여 단일 세포 현탁액을 만드는 것은 장비의 막힘을 방지하기 위해 중요합니다.anti-CD19, CD20 및 CD45와 같은 B 세포 특이적 항체를 사용하여 세포를 염색합니다. 유세포 분석을 통해 각 장기에서 유래한 B 세포가 CD19 양성, CD20 양성 및 CD45 양성 항체를 나타냄을 확인하였습니다. 게이팅된 세포를 바탕으로, 외투세포 림프종이 주입된 마우스에서 얻은 장기 특이적 세포 및 이식된 종양 세포의 양을 정량화합니다.본 연구에서는 외투세포 림프종의 농축 전후 B 세포 순도를 조사하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. 단핵 외투세포 림프종의 특성을 규명하기 위해 CD45, CD19, CD5, CD200, CD20 Kappa 및 Lambda와 같은 B 세포 특이적 마커가 사용됩니다. 유세포 분석 결과, CD45, CD19, CD20 및 CD5에 대해 양성으로 염색된 세포들이 관찰됩니다.그리고 이들은 특성 분석을 위해 선택됩니다. CD23 및 CD200에 염색되지 않은 세포들 또한 선택됩니다. 장기 특이적 생착 정도는 장기를 유세포 분석법으로 추가 처리한 후 B 세포를 분석하여 조사합니다.여기에 비장, 골수 및 간과 같은 장기를 사용하여 두 환자로부터 얻은 생착 패턴의 비교 표현이 제시되어 있습니다. 이 기술을 숙달하면 3주 이내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 이종 이식에 사용되는 PBMC를 농축하고, 털 거칠어짐, 굽은 등, 뒷다리 마비 및 체중 감소와 같은 질병의 주요 징후가 있는지 마우스를 정기적으로 확인하는 것이 중요합니다.이 절차를 따르면, 맞춤 의료 수행 등을 위해 다른 유형의 림프종에도 이종이식을 적용할 수 있습니다. 본 기술의 개발 이후, 혈액종양학 분야의 다른 연구자들이 면역결핍 nod scid 마우스에 환자 유래 외투세포 림프종을 확립하는 방법을 탐구하는 길이 열릴 수 있을 것입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 환자 유래 PBMC를 정제하고 이를 면역결핍 마우스에 이종이식하여 치료 전략을 이해하는 방법에 대해 충분히 파악하게 될 것입니다.인체 혈액 primary 샘플을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이러한 절차를 수행할 때는 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

안정 immunodeficient 생쥐의 좌골 신경에 루시페라제 - 태그 인간의 악성 말초 신경 칼집 종양 세포를 접목하는 방법이 설명되어 있습니다. 스터디 그룹에 동물 임의의 분리를위한 종양 이식과 기준의 적절한 설립을 증명하기 위해 bioluminescence 이미징의 사용도 설명합니다.

대한 인간 루시페라제 태그가 추가된 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포 Orthotopic Xenografting 생체내에</em후보 치료 대리점> 테스트

이 비디오는 인간화된 이종 이식 마우스 모델을 생성하기 위한 분석을 보여줍니다. 면역이 저하된 마우스에게 시클로포스파마이드를 주사하여 면역 세포를 고갈시킵니다. 하이드로겔에서 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 혼합된 환자 유래 종양 세포를 마우스에 피하 주입하여 T 세포가 침투하는 종양을 형성합니다.

인간 PBMC가 이식된 인간화 이종이식 마우스 모델을 생성하는 기술

면역 결핍 쥐에서 인간 종양 이종 이식은 암 생물학을 연구하는 중요한 도구입니다. 인간의 간세포 암 세포 또는 종양 파편에서 피하 및 간내 이종 이식을 생성하는 특정 프로토콜이 설명되어 있습니다. 받는 사람 생쥐의 부분 간 절제술에 의해 유도 된 간 재생은 간내 생착을 촉진하기위한 전략으로 제시된다.

면역 결핍 마우스의 피하 및 간내 인간의 간세포 암 이종 이식의 생성

여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 세포 immunotherapies intrabrain 전달의 antitumor 효능에 대 한-의 증거-개념을 제공합니다.

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

여기 우리가 사용 발광, x 선, 그리고 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 이미징 공부 어떻게 억제 mTOR 활동 영향이 종이 식 모델에서 골 engrafted 발성 종양. 이로써 순수 관련, 비-침략 적, 및 복합 요법 골 engrafted 발성 종양에서 vivo에서대상의 안티 발성 효과의 분석.

다 발성 골 수 Xenografts 노 그 쥐에서의 복합 발광 및 양자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 영상

여기서, 우리는 xenogeneic 이식편 대 숙주 질환(xenoGVHD) 모델에서 질병을 유도하고 점수를 매기는 프로토콜을 제시한다. xenoGVHD는 인간 T 세포의 면역 억제를 연구하는 생체 내 모델을 제공한다. 추가적으로, 우리는 면역 억제를 정량화하는 공구로 디지털 PCR를 가진 조직에서 인간 적인 T 세포를 검출하는 방법을 기술합니다.

디지털 PCR을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포의 Xegeneic Murine 모델 및 정량화에서 이식편 대 숙주 질환의 유도 및 채점

우리는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 기술합니다 - 번역형 면역 종양학 연구를 위한 기지를 둔 인간화한 이종이식 마우스 모형. 이 프로토콜은 I-O 치료 평가를 위한 유사한 모형을 설치하고 특성화하기 위한 일반적인 지침으로 봉사할 수 있었습니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 번역 면역 종양학에 대한 인간화 제종이식 모델 (I-O) 연구

현재 프로토콜은 외과 위암 견본에서 환자 파생된 이종이식 (PDX) 모형 및 1 차적인 암 세포주를 설치하는 방법을 기술합니다. 이 방법은 약물 개발 및 암 생물학 연구에 유용한 도구를 제공합니다.

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

정형외과 성 인간 간 전이성 포도막 흑색종 이종이식 마우스 모델은 배양된 인간 포도정 흑색종 세포주를 가진 환자 유래 종양 덩어리 및 바늘 주입 기술을 이용한 외과 정형외과 이식 기술을 사용하여 만들어졌습니다.

면역결핍 마우스에서 간 직교 인간 편도 흑색종 Xenograft 플랫폼의 생성

여기에서, 마우스 종양 모델에서 종양 내재 및 주변부 유래 종양 침윤된 림프구의 특성화를 위한 종양 이식 프로토콜을 제시한다. 유세포 분석기를 사용한 수용자 유래 면역 세포의 유입에 대한 특이적 추적은 항종양 면역 반응 동안 이들 세포의 표현형 및 기능적 변화의 역학을 드러낸다.

마우스에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

본 프로토콜은 비비만 당뇨병(NOD)-scid 인터루킨-2 감마사슬 수용체(NSG) 마우스에 인간 피부를 이식하는 방법을 설명합니다. 이식을 위한 인간 피부의 준비, 이식을 위한 마우스의 준비, 분할 두께의 인간 피부의 이식 및 이식 후 회복 절차에 대한 자세한 설명이 보고서에 포함되어 있습니다.

생체 내에서 인간 면역 반응을 조작하기 위한 이종이식 피부 모델

학습하세요 인간 맨틀세포림프종(MCL) 제노그래프트 마우스 모델 수립 방법을 통해 환자 유래 세포를 이용한 치료 효과를 연구하고 다양한 림프종 치료 전략 개발에 활용하는 기술을 익히세요.

인간의 맨 틀 세포 림프 종의이 종이 식 마우스 모델에서 종양 Engraftment

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