남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여
September 7th, 2017
C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.
이 절차의 전반적인 목표는 페로몬에 노출될 때 수컷 C.Elegans 머리 뉴런에서 이미지 칼슘 과도도를 효율적으로 포착하는 것입니다. 이 방법은 성별 특정 신경 회로 조절에 대한 이해와 같은 신경 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수컷 C.Elegans를 이제 미세 유체 트랩 장치에서 효율적으로 이미지화할 수 있다는 것입니다.
일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개체는 동물을 싣는 것이 처음에는 어려울 수 있고 바이오제닉 페로몬이 모든 동물에서 칼슘 일시성을 유발하지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 저장소 조립을 시작하려면 한쪽 끝에 바늘을 삽입하고 다른 쪽 끝에 금속 튜브를 삽입하여 세 세트의 튜브를 준비합니다. 그런 다음 각 저장소에 대해 3방향 루어 밸브를 사용하여 플런저가 제거된 30ml 주사기, 3ml 주사기 및 튜브를 부착합니다.
각 저장소를 플루오레신을 함유한 자극 S 기저 또는 S 기저의 적절한 완충액으로 채웁니다. 그런 다음 주사기를 튕기고 펌핑하여 저장소와 튜브 모두에서 기포를 제거합니다. 이제 새로운 3 밀리리터 주사기와 튜브에 S 기저부를 채우고 마이크로 유체 장치의 출구 포트에 삽입합니다.
버퍼가 입구 구멍 표면에 나타날 때까지 주사기에 약간의 압력을 가합니다. 다음으로, 흐름 제어, 버퍼 및 자극 저장 튜브를 적절한 입구 구멍에 연결하여 로딩 포트 구멍과 부착할 튜브 모두에 액체 방울이 있는지 확인합니다. 이제 웜 로딩 포트 입구에 물방울이 나타날 때까지 주사기에 약간 더 압력을 가한 다음 해당 포트에 단단한 차단 핀을 삽입합니다.
그런 다음 출구 포트에서 주사기를 제거하고 진공 집에 연결된 출구 라인을 연결합니다. 이제 현미경의 비디오 피드에 있는 플로트 채널에 기포가 있는지 장치를 검사합니다. 라이브를 클릭하여 라이브 이미지를 관찰하고 계속 진행하기 전에 거품이 자연스럽게 사라질 때까지 기다립니다.
그런 다음 형광등을 켜고 GFP 필터를 사용하여 적절한 흐름 역학을 확인합니다. 3 파 벨브를 움직이고 벨브가 열릴 때, 형광성 통제 시내를 영상 급식에서 나타나는 관찰하십시오. 시작하려면 씨를 뿌리지 않은 NGM 한천 플레이트에 벌레 한 마리를 선택하고 벌레가 기어 가도록 합니다.
그런 다음 S 기저부로 플레이트를 띄웁니다. 주사기에 벌레가 포함된 용액을 끌어냅니다. 이제 장치에서 진공 장치를 끄고 출구 루어 밸브를 사용하여 흐름을 중지하십시오.
그런 다음 웜 로딩 포트를 막고 있는 단단한 핀을 제거합니다. 웜이 들어 있는 튜브를 로딩 포트에 삽입합니다. 출구 루어 밸브를 열고 라이브 비디오 피드를 관찰합니다.
이제 벌레가 나타날 때까지 주사기에 부드러운 압력을 가합니다. 벌레가 꼬리에 먼저 들어가면 자극에 노출되기 위해 먼저 머리로 들어가야 합니다. 사용자는 꼬리가 채널에 완전히 들어가기 전에 웜을 뒤로 당겨야 하며, 그렇지 않으면 채널에서 웜을 제거하는 것이 매우 어렵고 일반적으로 채널을 통해 웜을 완전히 플러시하고 새 웜을 로드해야 합니다.
이제 주사기의 압력을 사용하여 웜을 채널을 통해 전진시키고 웜의 머리를 배치하여 버퍼 흐름에 노출되지만 채널 내부로 너무 멀리 노출되지 않도록 자유롭게 이동할 수 있도록 합니다. 마비되지 않은 동물에서는 소량의 축 방향 또는 회전 운동이 예상됩니다. 버퍼에 마비제를 추가하면 이 효과가 거의 제거됩니다.
시험 중 이동 가능성을 줄이려면 더 효율적으로 갇히는 나이가 많은 수컷을 사용하거나, 지렁이 장전 포트의 너비 또는 두께를 줄이거나, 마비 환자에서 보내는 시간을 늘리십시오. 소프트웨어를 사용하여 청색광 여기를 사용하여 녹음하십시오. 노출을 100밀리초로 설정하고, 이미지 획득 창을 열고, 간격을 0으로 설정하여 시점을 300으로 설정한 다음, 이미지 획득을 시작합니다.
5초 후 버퍼를 제어하는 3방향 밸브를 변경하여 자극을 가합니다. 10초 정도의 자극이 좋은 시작점이며, 자극의 길이는 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 자극 후 버튼을 다시 눌러 흐름을 다시 전환하고 30초 비디오가 완료될 때까지 녹화를 계속합니다.
이를 통해 g camp 형광이 기준선으로 돌아갈 수 있습니다. 이제 다음 시도 전에 준비를 30초 동안 쉬게 하십시오. 무 민감성 뉴런 (no susceptive neuron, ASH)에서 g camp three를 발현하는 지렁이는 ASH 뉴런 내에서 형광의 눈에 띄는 변화와 함께 하나의 어금니 글리세롤에 반응하여 신경 활동을 나타냅니다.
뉴런은 전체 비디오에 대한 분석 영역에 남아 있어야 하며, 그렇지 않으면 움직임 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 이 경우 해당 시점에 대한 분석 영역을 이동하고 강도 값을 병합하여 단일 추적을 만듭니다. 노출 중 매력적인 바이오제닉 페로몬 아스카로사이드 3로 자극을 받은 남성, 칼슘 일시성을 4개의 CEM 뉴런에서 측정하였다.
동물에서 동물로, 뉴런에서 뉴런으로, 그 흔적은 모양, 기호, 크기가 다양했다. 따라서 페로몬 반응을 연구할 때 많은 동물을 분석하는 것이 매우 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 수컷 예쁜꼬마선충을 미세 유체 장치에 로드하고 머리 뉴런의 칼슘 일시성을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
자웅동체와 동일한 프로세스를 사용하여 신경 반응의 초 특정 차이를 식별할 수 있습니다. 이 기술을 완전히 익히면 첫 번째 동물을 촬영할 때 30분 안에 완료할 수 있습니다. 첫 번째 기록 후 약 10분 안에 새로운 동물을 이미지에 로드할 수 있습니다.
이 절차에 따라 신경 회로가 어떻게 조절되는지 더 잘 이해하기 위해 광유전학과 같은 다른 방법을 이 프로토콜과 결합할 수 있습니다.
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개요
이 기사는 글리세롤 및 페로몬에 대한 반응에 대한 효율적인 칼슘 이미징을 위해 설계된 적응된 "후각 칩"을 설명합니다. 이 방법은 신경 생물학에서 성별에 따른 신경 회로 조절의 이해를 향상시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경 생물학
- 칼슘 이미징
- 행동 분석
배경
- C. elegans는 뉴런 기능 연구를 위한 중요한 모델 유기체로 사용됩니다.
- 칼슘 이미징은 실시간으로 신경 회로를 관찰할 수 있게 해줍니다.
- 자극에 대한 성별 특이적 반응은 신경 회로 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 효율적인 트래핑 기술은 생체 준비물의 이미징 능력을 향상시킵니다.
연구 목적
- 수컷 C. elegans 머리 뉴런에서 칼슘 일시적 변화를 이미징하는 기술을 개발합니다.
- 수컷이 생체 페로몬 및 기타 자극에 어떻게 반응하는지 탐구합니다.
- 성별에 따른 신경 회로 조절에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
사용된 방법
- 미세 유체 장치가 C. elegans를 트래핑하고 이미징하는 데 사용되었습니다.
- 신경 반응을 평가하기 위한 생물학적 모델로 수컷 C. elegans에 중점을 두었습니다.
- 형광 단백질을 사용하여 뉴런 활동을 시각화하는 칼슘 이미징이 수행되었습니다.
- 중요한 단계에는 벌레를 조심스럽게 로딩하고 이미징 중 유체 흐름을 제어하는 것이 포함되었습니다.
- 이 과정을 통해 약 10분 안에 새로운 동물의 이미징이 가능합니다.
주요 결과
- 페로몬 노출 시 ASH 뉴런과 네 개의 CEM 뉴런에서 칼슘 일시적 변화가 관찰되었습니다.
- 반응의 형태와 크기가 다양하여 신경 반응의 개체차를 나타냅니다.
- 이 방법은 페로몬에 대한 신경 회로 반응을 이해하는 잠재력을 보여주었습니다.
- 최소한의 움직임 인공물로 신경 활동을 이미징하는 것의 타당성을 입증했습니다.
결론
- 이 연구는 수컷 C. elegans의 뉴런 활동을 실시간으로 이미징하는 방법을 확립합니다.
- 이 기술은 성별에 따른 신경 메커니즘을 조사하는 데 적용할 수 있습니다.
- 이 접근 방식은 화학적 자극에 대한 뉴런 반응 및 신경 회로 조절에 대한 그 의미에 대한 이해를 향상시킵니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This microfluidic olfactory chip enables efficient calcium imaging in male C. elegans, addressing a key gap in sex-specific neurobiology research. By allowing real-time imaging of neuronal responses to pheromones, the method supports mechanistic de-risking in target validation for neuroactive compounds. The approach provides predictive value in early discovery by clarifying sex-dimorphic neural circuit regulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of sex-specific neural circuits in response to pheromonal stimuli.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for trapping and imaging male C. elegans head neurons.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of sex-dimorphic mechanisms in neuroactive compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated neuronal systems for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables standardized, quantitative calcium transient measurements in defined neuronal populations.
- Assay Readiness: Supports scalable imaging workflows with minimal movement artifacts after initial training.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase neural imaging to preclinical continuity via sex-specific biomarker alignment.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in sex-specific neural responses to chemical stimuli.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by revealing variable response patterns across individuals.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for neuroactive compounds requiring sex-specific efficacy profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of sex-specific neural circuit regulation through controlled pheromone exposure.
- Screening: Delivers assay-ready neuronal preparations with reproducible stimulus delivery and calcium readouts.
- Analytics: Enables quantitative analysis of calcium transients in ASH and CEM neurons using ImageJ for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by providing sex-stratified neural response data relevant to biomarker development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic platform for rapid turnover of male C. elegans imaging, reducing per-animal preparation time after initial training.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving sex-specific neural signaling mechanisms.
- Operational Value: Standardizes worm loading and imaging procedures, improving throughput and reducing variability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing sex-dimorphic neural responses that may predict differential compound efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroactive compounds based on sex-specific neural activity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device assembly, worm handling, and calcium imaging techniques.
- Depends on access to fluorescence microscopy, syringe pumps, and vacuum control systems for fluid regulation.
- Necessitates standardization across teams for consistent worm loading orientation and stimulus timing.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to hermaphrodites or other neuronal strains.
- Includes practical limitations such as variable pheromone response rates and initial learning curve for worm loading efficiency.
