Name: 남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 학습하세요 C. elegans 수컷 머리 신경의 칼슘 이미징을 위한 적응형 미세유체 칩 기법을 통해. 이 방법은 페로몬에 대한 성별 특이적 신경 회로 반응을 실시간으로 관찰하여 신경생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 마누엘 짐머 남성;와 사용을 위해 적응 시켰다 초기 디자인 파일 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 합성 및 ascr #3;의 공급에 대 한 프랭크 슈뢰더 로스 Lagoy 통찰력 및 영상 및 분석; 그리고 크리스토퍼 낙하산, 함께 마스터 제작 및,로 라 Aurilio이이 원고 검토에 기여. 이 작품에 대 한 자금 국립 보건원 그랜트 1R01DC016058-01 (제), 국립 과학 재단 부여 CBET 1605679 (D.R.A.), 및 버로우즈 Wellcome 경력 수상 과학 인터페이스 (D.R.A.)에서 제공 했다.

1. 장치 제조 참고: 참조 참조 1.
 참고: 실리콘 마스터 금형 실리콘 마스터 1 , 7 수 8 포토 레지스트 패터 닝에 대 한 표준 photolithographic 기법을 사용 하 여 날조 했다. 웨이퍼 패턴에 대 한 포토 25000 dpi에서 인쇄 되었다. 남성 적응 장치 기능 Chronis 후 각 칩 디자인 변화는 웜 포트 로드, M. 짐머 (개인 통신, 2016)에서 얻은 디자인을 적응에 19. 차례 동물의 회전을 제어 하는 포함 되어 있습니다. 포트 채널을 로드 하는 벌레의 폭은 50 μ m로 좁혀 졌다. 모든 채널은 32 μ m 높이 이다. 실리콘 마스터 몰드는 사용자에 게 제공 되 면 사용자는 후속 따를 수 프로토콜, 앞에서 설명한 1.
<ol><li>무게에 의해 10:1 비율로 믹스 PDMS 기본 및 경화 에이전트.</li>
	<li>전송 펫으로 철저 하 게 혼합.</li>
	<li>모든 보이는 거품 제거 될 때까지 1 시간에 대 한 진공 desiccator에 섞어 드.</li>
	<li>두께 5 mm (100 g) 때까지 150 m m 직경 접시에 실리콘 몰드 마스터에 혼합물을 부 어. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 모든 거품 또는 혼합물에 도입 된 먼지 제거.</li>
	<li>적어도 3 h, 또는 하룻밤 65 ° C에서 구워.</li>
	<li>메스를 사용 하 여 금형에서 PDMS를 잘라내어 별도 장치를 떨어져 면도날을 사용 하 여 잘라.</li>
	<li>1mm 피부 펀치와 인 레트와 출구 구멍을 펀치.</li>
	<li>플러시 dH 구멍 2 O, 에탄올, 그리고 다시 dH 2 O는 펀치에서 입자를 제거 하. 에 어 스트림 펄스에서 장치 건조.</li>
	<li>채널 측 및 어떤 먼지 또는 성공적인 접합 수 있도록 장치에 남아 있는 파편 제거 접착 테이프로 장치의 위쪽 청소.</li>
	<li>플라즈마-본드 장치, 제 1 덮개 유리, 채널 사이드.
	<ol><li>노출 커버 유리 및 장치 (채널-쪽) 공기 플라즈마 100 W 30 같은 적절 한 결합을 허용 하는 조건을 사용 하 여 s 또는 24 W 60에 대 한 s. 
		참고: 설정은 결합 효율을 향상 시키기 위해 조정할 수 있습니다. 플라즈마-결합 조건이 결합 효율을 개선 하려고 할 때 적절 한 청소 만큼 중요있지 않습니다. 이상적인 플라즈마 조건 에서도 충분 청소 장치 채권 하지 것입니다.</li>
		<li>5 손가락으로 아래로 장치 및 보도 채널 쪽으로 커버 유리를 반전 미</li>
	</ol></li></ol> 2. 준비를 버퍼 <ol><li>Dilute 1 살 균 10 배 재고에서 S 기초 (100 m m NaCl 및 0.05 M KPO 4, pH 6.0) x.</li>
	<li>모든 버퍼 솔루션에 대 한 1 M 1 m m S 기초 x 1에서의 최종 농도 tetramisole 재고 희석.</li>
	<li>Fluorescein 둘 다 추가 &#34; 흐름 제어 &#34;와 &#34; 버퍼 &#34; 저수지.
	<ol><li>S 기초 x 1에 100 mg/mL 재고 fluorescein 만들기.</li>
		<li>흐름 제어에 1 µ g/mL 및 버퍼에서 0.1 µ g/mL의 최종 농도에 재고 희석.</li>
	</ol></li> <li>자극을 만듭니다.
	<ol><li>1 M S 기초 X 1에서의 최종 농도에 희석 글리세롤.</li>
		<li>S 기초 X 1으로 1 µ M의 최종 농도를 희석 ascaroside #3 (ascr #3).</li>
	</ol></li></ol> 3. 장치 설치 참고: 1 참조.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig1.jpg" /> 그림 1. 미세 장치 설치. (A) 저수지 및 튜브 30 mL 주사기 플런저 역할 수 없이 &#34; 저수지. &#34;이 세 가지 흐름 옵션 Luer 밸브에 연결. 다른 미세 장치에 연결 하는 튜브에 삽입 된 바늘 (오렌지)에 연결 하는 동안 1 개의 출구 3 mL 주사기 플런저와 연결 된다. (B) 전체 이미징 실험 미세의 설정. 소자 대물 렌즈 위에 거꾸로 epifluorescence 현미경의 단계에 배치 됩니다. &#34; 흐름 제어 &#34; 버퍼 설정 위의 선반에 장치에 의해 제어 되는 3 방향 밸브를 통해 여행. 라인 버퍼를 포함 하는 다음 적절 한 장치 포트에 삽입 됩니다. (C) 미세 소자의 포트. &#34; 흐름 제어 &#34; 포트 측면 다른 입구 포트:는 &#34; 자극 &#34; 및 &#34; 버퍼 &#34; 포트. &#34; 콘센트 &#34;는 가장 오른쪽 포트. 웜 로드 경기장의 위치는 &#34; 웜 로드 &#34; 포트는 장치에서 중앙 대부분 포트입니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol><li>준비 3 3 mL 주사기 및 바늘 ( 그림 1A)에서 뿐만 아니라 루어 밸브에 연결 된 3 방향 Luer 밸브, 30 또는 60 mL 주사기를 연결 하 여 유체 저수지. 미세 장치 확장 튜브에 바늘을 연결 ( 그림 1A에서 -B).</li>
	<li>저수지와 배관에서 공기 방울을 제거.</li>
	<li>S 기초 x 1과 연결 된 튜빙 3 mL 주사기를 콘센트에 삽입 포트</li>
	<li>버퍼 입구 구멍의 상단에 표시 될 때까지 부드럽게 주사기에 압력을 적용.</li>
	<li>적절 한 입구 구멍에 흐름 제어, 버퍼 및 자극 튜브를 연결 ( 그림 1B에서 -C), 액체 방울 로드 포트에 있는 지를 확인 구멍과 첨부 버퍼 튜브.</li>
	<li>방울 벌레 로드 포트 입구에에서 나타날 때까지 출구 포트에 연결 된 주사기를 다시 부드럽게 압력을 적용.</li>
	<li>포트 로드 벌레에 단단한 차단 핀을 삽입</li>
	<li>출구 포트에서 주사기를 제거 하 고 집 진공 (-670 Torr)에 연결 하는 콘센트 라인 연결.</li>
	<li>검사 흐름에 어떤 거품에 대 한 장치 채널, 시각 및 카메라와 호환 하는 소프트웨어를 통해 비디오 확인을 통해 사용, 오픈-소스 소프트웨어 마이크로 유 등. 마이크로-Manager를 사용 하 여에 대 한 도움말 6 단계를 참조 하십시오.
	<ol><li>어떤 거품이 있으면 기다리는 그들을 꺼내 려 하는 PDMS에 흡수 될 어떤 동물을 로드 하기 전에 벽, 거품의 존재는 장치를 통해 체액의 적절 한 흐름을 방해 합니다.</li>
	</ol></li> <li>장치 내에서 적절 한 흐름 역학 확인 GFP 필터를 사용 하 여 웜 3-방향 밸브를 움직이는 버퍼의 관찰을 로드 하기 전에.
	<ol><li>결정 적절 한 흐름 역학: 흐름 제어 및 버퍼 솔루션에 fluorescein 관찰 ( 그림 2D -2E) 컨트롤을 눌러 흐름 제어 값이 변경 될 때 변경 3-방향 밸브 밸브 링크 ( 그림 1B)에 해당 하는 버튼.</li>
		<li>마이크로 관리자를 연 후에 클릭 &#34; 라이브 &#34; 소자의 라이브 이미지를 관찰 하는 것. 장치에서 버퍼의 흐름을 관찰 하는 형광 광원 설정 ( 그림 2D -2E).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig2.jpg" /> 그림 2: 한 남자 적응 미세 후 각 칩 했다. 장치는 벌레는 노출 될 경우의 (A) 흐름 패턴 버퍼를. 버퍼 (B)는 브라운에 나와 고 흐름 제어 (FC) 흰색에서 노란색, 자극 (S)에 표시 됩니다. 포트 로드 웜 웜 오리엔테이션의 더 나은 제어 곡선을 포함 적응 되었습니다. (B) 흐름 벌레 자극에 노출 되 면 소자의 패턴. 버퍼 (B)는 브라운에 나와 고 흐름 제어 (FC) 흰색에서 노란색, 자극 (S)에 표시 됩니다. (C) 조작으로 적응된 장치의 측량. 포트 로드 웜 남성 폭을 위한 50 µ m 채널 여 42 µ m에 끝납니다. 채널의 측정된 높이 디자인 25 µ m의 목표에도 불구 하 고 32 µ m입니다. (D-E) A 갇혀 남성 표현 p sra-6:: GCaMP3. Sra 6 발기인 재 관련, 그리고 비록 아무 칼슘 과도 ASI에 관찰 했다 일부 식 ASI 신경에서 관찰 될 수 있습니다. 반면 (E) 형광 이미지 (D) 밝은 분야 및 형광 조명의 조합입니다. 스케일 바는 강력한 신경 활동 42 µ m. (F)는 재 신경 응답을 1 M 글리세롤 자극을 나타냅니다. 파란색 영역 1 M 글리세롤 자극의 시간을 나타냅니다. 음영 처리 된 영역 나타냅니다 표준 오차, n = 7 벌레에서 20 펄스. 붉은 흔적이 depolarizing 응답을 나타냅니다. y 축의 δ/F 0을 표시합니다. 눈금 막대를 5 나타냅니다 s. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
 4. 동물 준비 참고: 참조 참조 23.
<ol><li>이미징 재 응답 1 M 글리세롤.
	P sra-6에 대 한 긍정적인 <li>장소 약 20 C. 선 충 <ol>남성:: 선 충 류 성장 매체 (NGM) 한 접시에 GCaMP3 배열 식 OP50 대장균의 잔디와 시드. 형광 GECI의 표현 및 공동 주입 마커를 사용 하 여 배열-긍정적인 동물의 식별에 대 한. 
		참고: 배열 긍정적인 동물 사용 GECI에 따르면 형광 것입니다 (즉, 동물을 표현 하는 GCaMP 것입니다 형광 블루 빛 자극, 아래 녹색 RCaMP 동물 그린 빛 자극 아래에 빨간색 형광 것입니다 하는 동안). 공동 주입 마커 phenotypic 마커, rol-6, 같은 다른 형광 단백질, GFP와 RFP, 등에서 배열할 수 있다 또는 pha-1 돌연변이 28 같은 지배적인 표현 형을 구출 하실 수 있습니다.
		<li>따기 직전 분석 결과, 젊은 성인 남성을 선택 하는 경우 <ol>. 만약 전날 분석 결과, L4 애벌레 남성 선택.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>이미징 CEM 응답 1 µ M ascr #3.
	<ol><li>선택 약 20 L4 C. 선 충 수 컷 (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1 (e2123ts); 그-5 (e1490); 라이트-1 (ce314)) 그는 dsRed 공동 주입 식 표식에 대 한 긍정적. 
		참고: 남자 이야기의 광선 신경 내 dsRed 식을 관찰 하 고 4 개의 CEM 뉴런 내에서 GCaMP 식 보다 확인 쉽습니다.</li>
		<li>이미징 실험을 수행 하기 전에 5-14 h OP50 대장균의 잔디와 시드 NGM agar 접시에 광고에 나온 것에서이 남성 분리. 
		참고: 남성 5 h의 최소 절연 하지 행동 ascr # 3에 응답 하지 않는 및 따라서 여기 관찰 보다는 ascaroside에도 적은 칼슘 과도 전시 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 5. 동물 로드 참고: refefence 1.
<ol><li>표준 웜 유지 관리 기술을 사용 하 여 한 unseeded NGM 천 배지 위에 한 웜 선택.
	<li>선택 <ol>벌레는 (병합 된 백 금 철사로 만든), 선택, 선택에 박테리아를 따기 불타는 여 고 &#34; dabbing &#34; 그것을 데리 러 벌레. 부드럽게 장소 자체에서 크롤링할 수 있도록 하는 새로운 접시에 웜.</li>
	</ol></li> <li>접시가 홍수 같은 unseeded 접시에 S 기초 x 1의 약 5 mL을 추가.</li>
	<li>S 기초 x 1 미리 채워진 된 로드 주사기 (즉, 연결 된 튜빙 3 mL 주사기)에 벌레를 그립니다.
	<ol><li>웜 튜브로 서만, 아니라 모든 방법으로 주사기를 빨 아 해야. 
		참고: 경우 벌레 주사기에 여행, 그것은 가까이 튜브에 그것을 다시 얻을 불가능.</li>
	</ol></li> <li>콘센트 Luer 밸브 선회 하 여 흐름을 중지 하려면 진공 해제.</li>
	<li>포트 로드 웜 차단 고체 핀 제거</li>
	<li>설정 Luer 밸브 배기는 출구 포트 ( 그림 1B)에 연결. 
	참고: 사용 하 여 라이브 비디오 피드는 벌레를 로드 하는 동안 위치와 동물 (단계 5.8-5.13)의 방향을 확인.</li>
	<li>삽입 튜브 웜 포트 로드에 로드 하는 웜</li>
	<li>웜 로드 채널에 나타날 때까지 부드럽게 주사기에 압력을 적용.</li>
	<li>벌레 꼬리 1 채널 입력을 시작, 경우 입력 채널에서 벌레를 방지 하기 위해 주사기 플런저 당겨.</li>
	<li>적용 하 고 머리 먼저 채널 입력 될 때까지 압력을 반전 전환.</li>
	<li>3 방향 Luer 밸브 선회 하 여 진공 분위기 대신 진공 하 여 출구 포트에 연결 하는 오픈.</li>
	<li>수동으로 머리 자유롭게 이동할 수 우울을 동양 벌레 머리 버퍼 흐름 채널, 하지만 지금까지 노출 되는 주사기 플런저에 의해 압력을 적용 ( 그림 2 D-2E).</li>
</ol> 6. 자극 및 수집 <ol><li>마이크로 매니저 등 10 프레임/s 블루 빛 여기를 사용 하 여 TIFF 스택으로 이미지를 캡처하여 기록 소프트웨어를 오픈-소스 현미경을 사용 하 여, (470 nm) 30 미</li>
	<li><ol><li>오픈 100 양 메인 메뉴에서 노출 설정 &#34; 멀티 D Acq. &#34; 소프트웨어의 메인 메뉴에서. 설정는 &#34; 번호 &#34;를 &#34; 300, &#34; 및 &#34; 간격 &#34;을 &#34; 0. &#34; 클릭 &#34; 취득! &#34; 비디오를 얻으려고.</li>
	</ol></li> <li>적용 수집을 시작한 후 자극 5 s의 10 s 펄스. 원하는 대로 응용 프로그램 자극의 기간 조정.
	<ol><li>5 인수 후 s 비디오의 변경 제어 흐름 제어 버퍼 테스트 중인 동물을 자극을 적용 하는 3 방향 밸브. 밸브 연결 ( 그림 1B)에 가장 왼쪽 단추를 클릭 하십시오.</li>
		<li>자극 노출 후 10 s (이 시간을 조정할 수 있습니다 사용자가 원하는대로), 다시 밸브 링크 맨 왼쪽 버튼을 누르면 버퍼의 흐름을 변경.</li>
	</ol></li> <li>버퍼 30의 창 GECI 형광 기준선으로 돌아갑니다 있도록 완료 될 때까지 아래 기록.</li>
	<li>원하는 대로 반복합니다. 수집의 끝과 다음 재판의 개시 사이 대기 30 s.</li>
</ol> 7. 분석 이미지 <ol><li>ImageJ 창에 파일을 드래그 하 여 TIFF 스택 ImageJ, 오픈 소스 소프트웨어와 함께 엽니다.</li>
	<li>커서를 사용 하 여 클릭 하 고 끌어 관심 (ROI)의 신경 주변 영역을 설정. ( 그림 3A)와 같이 관심의 신경의 soma를 포함 하도록 영역 설정.</li>
	<li>열기 클릭 하 여 투자 수익의 형광 강도의 z 스택 스택 전체 플롯-&#62; 이미지-&#62; 스택-&#62; z 축 프로필 플롯.</li>
	<li>클릭 &#34; 목록 &#34; 열리는 창에서. 편집-&#62; 값을 복사 하려면 복사. 값을 붙여 스프레드시트 프로그램으로.</li>
	<li>웜 GCaMP 식을 포함 하지 않는 영역에 투자 수익을 드래그 하 여 각 펄스에 대 한 배경 형광 분석.</li>
	<li>신경 형광 강도 값에서 배경 형광 값을 빼서 각 펄스에 대 한 배경 빼기 수행.</li>
	<li>계산 각 펄스의 각 프레임에 대 한 δ/F 0.
	<ol><li>첫 번째 1 대 한 투자 수익의 평균 휘도 값으로 계산 F 0 수집 (예: 프레임 1-10)의 s.</li>
		<li>계산된 F 0 값으로 관심의 프레임에 대 한 배경 뺀 값을 분할 하 여 δ/F 0를 계산.</li>
	</ol></li> <li>군데 모든 신경 및 모든 자극 펄스 반복.</li>
	<li>일관 된 응답 프로필, 화산재, 등 신경 각 뉴런에 대 한 모든 펄스를 평균 하 고 ( 그림 2F)에서 SEM을 계산.</li>
	<li>각 뉴런에 대 한 시간이 지남에 SEM와 평균 δ/F 0 플롯. 
	참고:이 경우에, 그것은 뿐만 아니라 각 재판의 개별 신경 응답의 heatmaps를 포함 하 일반적인 관행입니다. 그것은 개별 펄스 트레이스 (로 표시에 더 적용 수 반복된 stimulations 걸쳐 자극에 노출 되 면 칼슘 과도 일관 된 변화를 전시 하지 않는 신경 또는 다른 개인 23 그림 4)입니다. 결정 하는 데이터를 표시 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.</li>
</ol>

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<li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+structure-specific+and+promiscuous+G-protein-coupled+receptors+mediates+small-molecule+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

남성 적응 후 각 칩 좁은 로드 포트 방향 제어 및 남성 C. 선 충의 효율적인 트래핑 수 있는 회전을 채택 하고있다. Z-스태킹에 대 한 필요 없이 신경 양자 쌍의 왼쪽 및 오른쪽 회원의 시각화에 대 한 수 있습니다. 이 곡선 벌레에 시간의 수직 100% 떨어져 방향을 하나의 양자 쌍 재 (그림 2D-E)29,30같은 형광 표시와 함께 대상으로 리드. 그러나, CEM, 같은 4 개의 광선으로 대칭 신경 세포와 신경 클래스에서 모든 4 개의 신경 세포는 볼 수 단지 1 / 3의 시간. 또 다른 3 분 테스트 벌레의 표시, 4 개의 뉴런의 고 나머지 3만 3만 구별할 수 차이 등 쪽과 복 부 셀 시체, 좌우 비대칭 (데이터 표시 되지 않음) 하지 사이. 좁은 포트는 z 축에 걸쳐 웜 동요를 방지 하기 위해 낮은 채널 높이와 결합...

미세 장치 증가에 액세스할 정확 하 게 제어 환경의 점에서 동물, C. 선 충, 선 충 류 실험적 조작된1수와 같은. 이러한 연구는 행동 분석, 칼슘 이미징 연구, 또는 특정 고기, 실험 결과1,2,3,4,의 더 정확한 측정 결과 대 한도 검 진 5,6. 마이크로 소규모 액체 상태는 상세한 실험 시 약의 최소한의 금액을 이용 하는 동안 실행 될 수 있습니다 제공 합니다. 거기는 새로운 미세 장치 디자인의 지속적인 생산 다르며 각각의 사용, 자연 정현파 모션 C. 선 충 의 행동 분석 및 신경 영상 연구, 신경 이미징에 사용 되는 장치를 함정을 허용 하는 경기장에서 그리고 후 각 연구, 유전자에서 높은 처리량 phenotypic 분석 화면4,5,,67대 한 허용 하는 장치. 마스터 몰드의 제작, 다음 미세 장치는 건설 비용이-마스터의 재사용성을 제공-사용 하기 쉬운, 높은 처리량 연구를 통해 빠른 데이터 생성에 대 한 허용. 등입니다 (PDMS) 폴리머를 사용 하 여 장치의 제조 시간 이내 신제품의 창조에 대 한 수 있습니다.
칼슘 이미징 연구 대상 세포에 표현 된 유전자 인코딩된 칼슘 지표 (GECIs)를 사용 하 여 실시간으로8,9,,1011에 그 세포의 신경 역학 측정. C. 선 충 의 투명 한 자연 동물에이 단백질의 형광 레벨의 기록에 대 한 수 있습니다. GECIs 녹색 형광 단백질 (GFP)을 의존 하는 전통적으로,-하지만 더 최근의 연구 더 나은 신호 대 잡음 비율 및 레드 이동 여기 프로필 있도록 이러한 센서 적응 센서 GFP Calmodulin M13 펩 티 드 (GCaMP)를 기반으로. GCaMP3의 개발에 따라 단백질이 규격 다양, GCaMP6s 및 GCaMP6f 같은 센서를 포함 하 여 (느린 빠르고 형광 오프 비율, 각각), RFP Calmodulin M13 펩 티 드 (RCaMP), 뿐만 아니라 빨간색 이동 있다 활성화 프로필입니다. C. 선 충 세포 관련 유전자 발기인 시퀀스와 이러한 GECIs 조합의 관심사, 특히 감각 신경12,13,,1415 의 세포를 타겟팅 할 수 있습니다. , 16.
미세 연구에 선 충 C. 사용의 용이성 명백한 동안, 거의 모든 연구는 광고에 나온 것에 집중 했다. 남성만 0.01-0.02에 대 한 회계에 불구 하 고 야생 형식 인구의 %, 귀중 한 발견 그들의 특성에서 발생할 수 있습니다. 자웅 동체 신경 시스템의 물리적 텀 수십 년17완벽 하 게 매핑 되었습니다, 반면 남성 텀 동물18의 머리 지역에서 특히 불완전, 남아 있습니다. 칼슘 이미징 남성에서의 사용은 남성 신 경계와 두 남녀 사이 발생 하는 차이 대 한 이해를 생성 하는 데 도움이 됩니다. 선 충 C. 성인 남성의 더 작은 크기는 큰 광고에 나온 것을 위한 전통적인 후 각 장치의 로드 포트에 효과적이 고 신뢰할 수 있는 트래핑 방지할 수 있습니다. 이 해결 하기 위해 Chronis 후 각 칩19 의 수정된 된 버전 좁은 로드 포트, 낮은 채널 높이, 개발 되었다 고 웜 로드 포트 (이 동물 회전), 양자 왼쪽/오른쪽의 시각화에 대 한 허용에 신경 쌍입니다. 이 디자인 허용: 젊은 성인 남성 (1) 효과적인 트랩핑, 양자 쌍된 뉴런의 두 멤버와 남성 뉴런에서 신경 활동의 정확한 영상 (3)의 시각화에 대 한 동물의 보다 안정적인 방향 (2).
점점, 연구 선 충 C. 남성 ascarosides (ascr), 또는 선 충 류 페로몬20,,2122,23의 다양 한 광고에 나온 것 보다 다르게 응답 표시 ,24. 따라서, 신경 역학과 남성 텀 내 표현에 대 한 이해를 개발 훨씬 더 관련 되고있다. 남성 선 충 C. 포함 자웅 동체25,26에 없음 87 섹스 관련 신경으로에 텀을 변경-아직 불확 실한 방법. 이러한 독특한 신경 역학 이미지를 수 있는 더 나은 섹스 관련 응답 및 신경 표현 이해 하 고 우리 수 있습니다.
이 프로토콜은 남성 C. 선 충 의 신경 영상에 대 한 남성 적응 후 각 칩의 사용을 설명 합니다 chemosensation. 재 1 M 글리세롤 남성, 이전 일치에 자웅 동체에 안정적으로 응답 nociceptive 신경 연구27. Ascarosides에 노출은 변수 동물 동물에서 시험 될 동물의 많은 수를 요구 하는 응답을 유도 수 있습니다. 남성 전용 CEM 뉴런의 응답 이전 표시 되었습니다, 전기 생리학 및 칼슘 이미징 연구를 통해 변함없이 ascaroside #323응답.

<table><tbody><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>대학 웨이퍼</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2035</td><td>MicroChem</td><td>Y111070-0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>개발자</td><td>MicroChem</td><td>Y020100-4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>웨이퍼 마스크</td><td>Cad/Art Services</td><td>-</td><td>맞춤 주문. 25,000dpi로 인쇄됩니다.</td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Ellsworth 접착제</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>1.0mm 피부 펀치</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P150</td><td></td></tr><tr><td>소프트 튜빙</td><td>콜-팔머</td><td>EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>하드 튜빙</td><td>IDEX 건강 & 과학</td><td>1622</td><td></td></tr><tr><td>핀</td><td>뉴잉글랜드 소형 튜브</td><td>NE-1027-12</td><td></td></tr><tr><td>차단 핀</td><td>뉴잉글랜드 소형 튜브</td><td>0.415/0.425" OD x .500 롱</td><td>배치 PB07027</td></tr><tr><td>3mL 주사기</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>30mL 주사기</td><td>바이탈리티 의료</td><td>302832</td><td>완충 저장소로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 블런트 니들 23 게이지, 폴리프로필렌 루어</td><td>구성 요소 공급 회사</td><td>NE-231PL-50</td><td></td></tr><tr><td>루어 연결이 있는 스톱콕; 3-방향; 남성 잠금; 5 플로우 패턴; 비멸균</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30600-07</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest 프리미엄 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>메르카토르 제어 시스템 LF-5 플라즈마 시스템</td><td>메르카토르</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>스카치 테이프</td><td>스카치</td><td>BSN43575</td><td></td></tr><tr><td>시리즈 20 챔버</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>P-2</td><td></td></tr><tr><td>진공 건조제</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>420250000</td><td>내경 24cm</td></tr><tr><td>무게 보트</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-01017-27</td><td></td></tr><tr><td>Classic Plus Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1501-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-25554-06</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫</td><td>Genesee Scientific</td><td>30-202</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Sheldon Manufacturing Inc</td><td>9120993</td><td>모델 번호: 1500E.</td></tr><tr><td>60mm, 비통풍식, 날카로운 모서리 페트리 접시</td><td>TriTech Research</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.A1</td><td></td> <td>Zeiss-Hammamatsu</td><td></td></tr> <tr><td>Orca Flash 4.0 Digital CMOS</td><td>Hammamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Blue Fluorescent</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM6-LCR-SA</td><td>24-30V/7.9A DC.</td></tr><tr><td>조명 어댑터</td><td>Zeiss</td><td>423302-0000</td><td></td></tr><tr><td>시리즈 1 및 2 소형 불활성 PTFE 차단 밸브</td><td>Parker</td><td>001-0017-900</td><td>유량 제어용 3방향 밸브.</td></tr><tr><td>ValveLink8.2&reg;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td>유량 스위치 컨트롤러</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager-Free</td><td></td> <td>소프트웨어, 다운로드 위치: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>ImageJ-Free</td><td></td> <td>소프트웨어, 다운로드 위치: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Agar, Bacteriological Grade</td><td>Apex</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>에이펙스</td><td>20-260</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>VWR</td><td>BDH0224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-1kg</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270741-4L</td><td></td></tr><tr><td>테트라미솔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756-10(G)</td><td>4 &deg;C.에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>플루오레세인</td><td>시그마-알드리치</td><td>FD2000S-250mg</td><td>감광성. 광보호용 바이알에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G6279-1L</td><td></td></tr><tr><td>아스카로사이드 #3</td><td>-</td><td>-</td><td>슈뢰더 연구실(코넬 대학교)에서 합성.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-215</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>BDH</td><td>BDH9268.25</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-025</td><td></td></tr><tr><td>ASH GCaMP3 line</td><td>-</td><td>-</td><td>CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Bargmann 실험실에서 개발. 알브레히트 연구소 도서관에서 제공.</td></tr><tr><td>CEM GCaMP6 라인</td><td>-</td><td>-</td><td>JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::d sRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Robyn Lints가 개발했습니다. Srinivasan Lab 라이브러리에서 제공했습니다.</td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>"Reservoir"</td><td></td><td></td><td>--To create a Reservoir: "30 mL syringe"는 "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile"에 연결되며, 이는 "3 mL syringe" 및 "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge"에 연결됩니다. 폴리프로필렌 루어". 그런 다음 "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer"를 바늘 아래의 약 1/3 지점에서 "Soft Tubing"에 삽입합니다.</td></tr></tbody></table>

남성 선 충 c. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

칼슘 지표의 사용은 크게 신경 역학 및 규칙의 우리의 이해를 강화 했다. 완전히 매핑된 신 경계와 투명 한 해부학, 선 충 류 꼬마 선 충, 칼슘 표시기를 사용 하 여 실시간 신경 역학을 이해 하기 위한 이상적인 모델을 제공 합니다. 미세 기술 및 실험 설계와 함께, 자유로운 이동 및 덫을 놓은 동물 칼슘 이미징 연구가이 표시기를 사용 하 여 수행 됩니다. 그러나, Chronis 그 외 여러분에서 설명한 후 각 칩 등의 트랩 장치를 이용 하 여 대부분 이전 연구는 보다 적게 일반적인 남성은 둘 다 형태학 상으로 그리고 구조적으로 더 일반적인 자웅 동체에 사용 하기 위해 설계 된 장치 비슷하지. 적응된 후 각 칩 설계와 젊은 성인 동물을 사용 하 여 남성 신경 이미징에서 증가 효율성에 대 한 조작. 차례는 웜 포트 동물 회전 하 고 2D 영상에서 양측 쌍 개별 뉴런의 분리에 대 한 로드로 통합 되었다. 벌레는 자웅 동체 연구 이전에 설명 된 대로 odorant 미세 소자 내에서 제어 흐름에 노출 됩니다. 칼슘 과도 다음 ImageJ의 오픈 소스 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. 여기에 설명 된 절차는 남성 기반 C. 선 충 의 증가 금액에 대 한 허용 해야 칼슘 이미징 연구, 섹스 관련 신경 신호 전달의 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 심화.

그림 1A-B에서 전체 장치 설치의 예를 볼 수 있습니다. 그림 1A 는 적절 한 저수지 건설 및 설치를 보여 줍니다. 그림 1B 미세 장치에 저수지의 연결을 보여 줍니다. 그림 1C 는 개별 포트 선명도 대 한 분류와 미세 장치를 묘사 한다.
남성 적응 미세 장치 디자인 로드 포트에 곡선을 포함 되어 있지만 흐름 역학은 Chronis에 의해 설계 된 장치에 동일 외.19(-2 C그림 2A</str...

C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 페로몬 노출 시 수컷 C. elegans 머리 뉴런에서 발생하는 이미지 칼슘 일시 현상을 효율적으로 포착하는 것입니다. 이 방법은 성별 특이적 신경 회로 조절을 이해하는 것과 같이 신경생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이제 미세 유체 트랩 장치에서 수컷 C. elegans를 효율적으로 이미지화할 수 있다는 점입니다.일반적으로 이 방법이 처음인 경우, 동물 로딩이 처음에는 어려울 수 있고 생체 페로몬이 모든 동물에서 칼슘 일시적 변화를 유발하지는 않기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 저장조 조립을 시작하려면, 튜브의 한쪽 끝에는 바늘을, 다른 쪽 끝에는 금속 튜브를 삽입하여 튜브 세트 3개를 준비합니다. 그런 다음, 각 저장조마다 3방향 루어 밸브를 가져와 플런저를 제거한 30 milliliter 주사기, 3 milliliter 주사기 및 준비한 튜브를 연결합니다.각 리저버에 자극 S basal 또는 플루오레신이 포함된 S basal 중 적절한 버퍼를 채웁니다. 그런 다음, 시린지를 튕기거나 펌핑하여 리저버와 튜빙 내의 기포를 모두 제거합니다. 이제 새로운 3 mL 시린지와 튜빙에 S basal을 채우고 마이크로 유체 장치의 배출구 포트에 삽입합니다.버퍼가 유입구 구멍 표면에 나타날 때까지 시린지에 살짝 압력을 가합니다. 다음으로, 유량 조절, 버퍼 및 자극 저장조 튜브를 해당 유입구 구멍에 연결하며, 이때 로딩 포트 구멍과 연결될 튜브 양쪽 모두에 액체 방울이 있는지 확인합니다. 이제 벌레 로딩 포트 유입구에 방울이 나타날 때까지 시린지에 조심스럽게 압력을 조금 더 가한 다음, 해당 포트에 고체 차단 핀을 삽입합니다.다음으로, 배출 포트에서 주사기를 제거하고 하우스 진공(house vacuum)에 연결된 배출 라인을 장착합니다. 이제 현미경의 비디오 피드에서 플로트 채널 내에 기포가 있는지 장치를 검사하십시오. 라이브(live)를 클릭하여 실시간 영상을 관찰하고, 다음 단계로 진행하기 전에 기포가 자연스럽게 소멸될 때까지 기다립니다.다음으로, 형광 광원을 켜고 GFP 필터를 사용하여 유동 역학이 적절한지 확인합니다. 3웨이 밸브를 작동시켜 밸브가 열렸을 때 비디오 피드에 형광 제어 흐름이 나타나는지 관찰합니다. 시작하려면, 시딩되지 않은 NGM 한천 배지에 벌레 한 마리를 옮긴 후 벌레가 기어갈 수 있도록 둡니다.그 후, S basal로 플레이트를 띄웁니다. 벌레가 포함된 용액을 시린지로 빨아들입니다. 이제 장치에서 배출구 루어 밸브(luer valve)를 사용하여 진공을 꺼서 흐름을 중단시킵니다.그런 다음, 웜 로딩 포트를 막고 있는 고정 핀을 제거합니다. 웜이 들어 있는 튜브를 로딩 포트에 삽입합니다. 배출구 루어 밸브를 열고 실시간 비디오 피드를 관찰합니다.이제 벌레가 나타날 때까지 시린지에 가볍게 압력을 가하십시오. 벌레가 꼬리부터 들어가는 경우 다시 끌어내십시오. 자극에 노출되려면 반드시 머리부터 들어가야 합니다. 꼬리가 채널에 완전히 들어가기 전에 벌레를 다시 끌어내야 하며, 그렇지 않으면 채널에서 벌레를 꺼내기가 매우 어려워 보통 벌레를 채널 밖으로 완전히 밀어내고 새 벌레를 로딩해야 합니다.이제 시린지의 압력을 이용하여 벌레를 채널을 통해 전진시키고, 벌레의 머리가 완충액 흐름에 노출되되 채널 내부로 너무 깊이 들어가 자유롭게 움직이지 않도록 위치시킵니다. 마비되지 않은 동물에서는 약간의 축 방향 또는 회전 운동이 예상됩니다. 다만, 완충액에 마비제를 첨가하면 이러한 효과가 거의 제거됩니다.실험 중 움직임의 가능성을 줄이기 위해, 포획 효율이 더 높은 고령의 수컷을 사용하거나, 벌레 투입구의 너비 또는 두께를 줄이거나, 마비제에 노출되는 시간을 늘리십시오. 소프트웨어를 사용하여 청색광 여기 상태에서 녹화를 진행하십시오. 노출 시간을 100 milliseconds로 설정하고, 이미지 획득 창을 연 다음, 시간 지점을 300으로 설정하고 간격을 0으로 맞춘 후 이미지 획득을 시작하십시오.5초 후, 완충액을 제어하는 3방향 밸브를 변경하여 자극을 가합니다. 10초간의 자극이 적절한 시작점이며, 자극 길이는 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 자극 후, 버튼을 다시 눌러 흐름을 원래대로 전환하고 30초 분량의 비디오 촬영이 완료될 때까지 계속 기록합니다.이렇게 하면 g camp 형광이 기선으로 돌아가게 됩니다. 이제 다음 실험 전까지 준비물을 30초 동안 그대로 둡니다. 노시셉티브 뉴런인 ASH에서 g camp three를 발현하는 벌레는 1 M glycerol에 반응하여 ASH 뉴런 내의 형광 수치가 가시적으로 변화하며, 이는 신경 활동이 일어났음을 나타냅니다.뉴런은 전체 비디오 동안 분석 영역 내에 유지되어야 하며, 그렇지 않으면 움직임 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 이 경우, 해당 시점의 분석 영역을 이동시키고 강도 값을 병합하여 하나의 트레이스를 생성하십시오. 노출 동안 유인성 생체 페로몬인 ascaroside three로 자극을 받은 수컷의 경우, 4개의 CEM 뉴런에서 칼슘 일시 변화를 측정하였습니다.동물마다, 그리고 뉴런마다 반응의 형태, 부호 및 크기가 다양하게 나타났습니다. 따라서 페로몬 반응을 연구할 때는 많은 수의 동물을 분석하는 것이 매우 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 수컷 C elegans를 미세 유체 장치에 로딩하고 머리 뉴런의 칼슘 일시 변화(calcium transience)를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.동일한 과정을 자웅동체(hermaphrodites)에 적용하여 신경 반응의 성별 특이적 차이를 확인할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 첫 번째 동물 이미징은 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 첫 번째 기록이 끝난 후, 새로운 동물을 이미징하도록 준비하는 데는 약 10분이 소요됩니다.이 절차를 수행한 후, 신경 회로가 어떻게 조절되는지 더 자세히 이해하기 위해 광유전학(optogenetics)과 같은 다른 방법들을 이 프로토콜과 결합할 수 있습니다.

using-an-adapted-microfluidic-olfactory-chip-for-imaging-neuronal

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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학습하세요 C. elegans 수컷 머리 신경의 칼슘 이미징을 위한 적응형 미세유체 칩 기법을 통해. 이 방법은 페로몬에 대한 성별 특이적 신경 회로 반응을 실시간으로 관찰하여 신경생물학 연구에 활용됩니다.

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