Name: 신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 학습하세요 신생아 및 성인 마우스 피부에서 1차 각질 세포를 분리하고 배양하는 방법을. 이 기술은 피부 장벽 기능과 선천성 면역 반응을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 내과학 연구소 (R01AR069653 to Zhang LJ)와 국립 보건원 (National Institute of Health Support) (5T32AR062496-03 to CA)에 의해 지원되었습니다.

모든 동물 실험은 UCSD 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 1. 신생아 피부로부터의 일차 마우스 KC 분리 및 배양 <ol><li> C57B / 6 wildtype 마우스의 출생 후의 0-2 신생아를 가위로 목을 베고 희생시킵니다. 손목과 발목 관절 바로 위의 팔다리를 잘라 낸 다음 작은 구멍을 남기고 꼬리를 완전히 잘라냅니다. </li><li> 전체 피부를 벗기기 위해서는 먼저 날카로운 가위를 꼬리 부분의 구멍을 통해 삽입하고 몸의 등쪽 중간 선을 따라 피부를 목에있는 구멍으로 자릅니다. 다음으로, 한 포셉을 사용하여 노출 된 몸체와 다른 포셉을 잡고 피부를 잡아 당기고 몸 전체의 피부를 부드럽게 껍질을 벗기고 다리 운동을하면서 하나의 연속 동작으로 껍질을 벗깁니다. <ol><li> 손상되지 않은 부분으로 피부를 떼어 내고 피부를 부러지지 않도록주의하십시오. 그러면 디스펜스 단계에서 세포가 손실 될 수 있습니다. </li></ol></li> &lt;li&gt; 10cm 페트리 접시에 멸균 PBS 15 ML로 벗겨 피부를 씻어 다음 KC 성장 매체에 4 MG / ML dispase를 포함 얼음 차가운 dispase 소화 버퍼로 가득 2 ML 튜브에 각 강아지의 피부를 놓으십시오 (KC 기초 배지는 0.06 mM의 CaCl2를, DGS, 및 항생제 / 항진균제를 갖는다). 참고 : 다중 피부 분리 물을 혼합하여 12 mL 디스펜스 용액이 들어있는 1 개의 15 mL 튜브 (튜브 당 최대 5 개의 스킨)에서 배양 할 수 있습니다. 회 전자에 4 ° C 냉장고에서 하룻밤 피부 튜브를 품어. <ol><li> 피부가 접히지 않도록주의하십시오. 접힌 부위가 dispase 용액에 충분히 노출되지 않습니다. </li></ol></li><li> 다음날 (12-18 시간 후) 디스 페아 제 용액과 함께 피부를 페트리 접시에 옮기십시오. 여분의 dispase 멀리 씻어 15 ML 멸균 PBS와 새로운 페트리 접시에 각 조직 조각을 전송하십시오. </li><li> 포셉의 두 쌍을 사용하여, PBS에서 피부를 파악,피부를 들어 올리고 표피면을 아래로하고 진피면을 위로하여 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 조심 스레 피부 주름을 스트레치하여 페트리 접시에서 완전히 확장되도록하십시오. </li><li> 새로운 페트리 접시에 각 피부에 대한 트립신 기반 소화 솔루션 500 μL를 놓으십시오. 겸자를 사용하여 천천히 표피를 아래로 들어 올리면서 표피를 들어 올리십시오. 진피를 생물학적 위험 물질로 폐기하십시오. 분리 된 표피를 옮기고 기본 층이 아래쪽에있는 트립신 용액의 각 방울에 부유시킨다. <ol><li> 표피가 트립신 솔루션에 접혀 있다면, 상피에서 기본 KCs의 효율적인 소화를 보장하기 위해 집게를 사용하여 모든 주름을 제거합니다. </li></ol></li><li> 20 분 동안 온화한 교반과 수평 쉐이크에 실온 (뚜껑을 덮은 상태로) 트립신 솔루션의 페트리 접시에 피부를 품어. </li><li> 표피 당 보충 된 KC 성장 배지 2 mL를 첨가한다.표피)를 배양 접시에 첨가 하였다. 겸자를 사용하여 표피를 잡고 앞뒤로 활발히 표피를 문질러 표피 시트에서 단일 세포를 릴리스하십시오. <ol><li> 세포가 표피에서 분리되면 서서히 흐려지는 것을보십시오. 페트리 접시를 기울여 접시에 남아있는 표피 시트를 떠나는 새로운 튜브에 세포 현탁액을 수집하고 전송하십시오. </li></ol></li><li> 2 ML KC 성장 매체를 추가 한 후 표피 시트의 마찰을 두 번 더 반복하고 같은 튜브에 세포 suspensions를 결합. </li><li> 적절한 혈청 피펫을 사용하여 세포 덩어리를 깰 수 있도록 세포 솔루션을 부드럽게 몇 번 피펫 쳐서 새로운 50 mL 원심 튜브에 100 μm 필터를 통과시킵니다. </li><li> 180 X g에서 5 분 동안 여과 된 세포를 원심 분리하십시오. </li><li> 뜨는에서 대기음과 부드럽게 1 ML 차가운 KC 성장 매체 / 표피에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> hemocytometer로 세포를 센다. <br/&gt; 참고 : KC는 자연히 현탁액에서 분화 할 수 있으므로 세포가 최적의 성능을 발휘할 수 있도록 격리 후 가능한 한 빨리 세포를 플레이 팅해야합니다. 우리는 KC 자발 분화 속도를 줄이기 위해 셀을 얼음 위에 놓는 것이 좋습니다. </li><li> 세포 부착을 촉진 세포 외 매트릭스 (ECM) 제품으로 미리 코팅 문화 요리에 KC 성장 매체 5 X 10 4 / cm 2 의 밀도로 세포를 씨앗. 주 : 우리는 ()를 참조 물질의 표를 참조 젤라틴 계 도료는 상용 가능한 (예를 들어 부착 요소를 사용하여 세포를 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 배양기에서 배양하고, 새로운 배지이었다. 격일로 보충했다. <ol><li> 코팅을 위해, 세포 시딩 이전에 10 분 내지 2 시간 동안 실온으로 가온 된 세포 부착 코팅 물질로 배양 접시를 코팅한다. 직전에 부착 요소를 제거하십시오.세포 현탁액을 추가. </li></ol></li><li> 초기 도금 후 매체를 변경하여 연결되지 않은 세포를 제거하고 세포가 실험 전에 원하는 confluency에 도달 할 때까지 매일 매체를 교체하십시오. </li></ol> 2. 성인 꼬리 가죽으로부터의 일차 마우스 KC 격리 <ol><li> 동물 시설 규정에 따라 성인 C57BL / 6 마우스 (바람직하게는 6 ~ 15 주 사이, 남성 또는 여성)를 희생하십시오. 꼬리 받침에서 몸통의 꼬리를 잘라내어 꼬리 끝 부분에 가시 구멍이 생길 수 있도록 꼬리 끝의 ~ 2mm를 자릅니다. </li><li> 꼬리 가죽을 벗겨 내려면 먼저 날카로운 날을 사용하여 꼬리 선단을 꼬리 끝 부분까지 자릅니다. 다음, 하나의 포셉을 사용하여 노출 된 꼬리뼈와 다른 포셉을 잡아서 피부를 잡아 당기고 꼬리뼈를 부드럽게 하나의 연속 동작으로 껍질에서 벗겨냅니다. 껍질을 벗긴 피부를 밋밋 라인에서 잘라내어 각 조각의 길이가 2-3cm 미만이되도록하십시오. </li><li> 껍질을 벗긴 피부를 헹구십시오.10cm 페트리 접시에 멸균 PBS 15 ML의 다음 얼음 차가운 dispase 소화 버퍼 (KC 성장 매체에 4 MG / ML dispase) 가득한 2 ML 튜브에 각 꼬리에서 피부를 놓으십시오. 참고 : 여러 개의 피부 조각을 결합하여 12 mL의 디스 페스 용액이 들어있는 1 개의 15 mL 튜브 (튜브 당 최대 5 개의 꼬리)에 배양 할 수 있습니다. <ol><li> 회 전자에 4 ° C 냉장고에서 하룻밤 피부 튜브를 품어. </li></ol></li><li> 꼬리 표피에서 단일 세포 현탁액을 분리하기 위해 1.4에서 1.13 단계를 수행하십시오. </li><li> 콜라겐으로 사전 코팅 문화 요리에 KC 성장 매체에서 10 x 10 4 / cm 2 (hematocytometer로 계산)의 밀도로 성인 세포를 씨앗. 참고 : 우리는 시판되는 콜라겐 기반 코팅 키트를 사용합니다 (자세한 내용은 표 참조). 세포를 5 % CO 2 , 37 ℃의 가습 된 배양기에서 배양하고, 매일 새로운 배지를 보충 하였다. 일반적으로 c궁극적 인 요리는 세포 파종 전에 30 분 ~ 1 시간 동안 콜라겐으로 코팅해야합니다. 우리는 젤라틴 기반의 코팅 물질 인 부착 인자와 비교하여 콜라겐으로 코팅 된 경우 요리에 성인 KC 부착이 유의하게 증가한다는 것을 관찰했다. </li><li> 초기 도금 후 매체를 변경하여 연결되지 않은 세포를 제거하고 세포가 실험 전에 원하는 confluency에 도달 할 때까지 매일 매체를 교체하십시오. </li></ol> 3. 고 칼슘에 의한 KCs의 체외 분화 <ol><li> 말단 분화를 유도하기 위해, 배지에 0.2 mM의 CaCl2를 추가. </li><li> 또는 높은 칼슘을 첨가하기 전에 저칼슘 KC 기저 배지에서 성장 보조제없이 일일 배양 된 KC를 굶기십시오. 참고 : 성장 인자 기아는 초기 분화 및 K10 5 와 같은 조기 분화 마커의 유도에 대한 세포 투입을 향상시킬 것입니다 </sup&gt;. </li></ol> 4. UVB 조사에 의한 KC로부터의 세포 사멸 및 TNFα 방출 <ol><li> 세포가 confluency에 도달 할 때까지 매일 매체 변화와 KC 성장 매체 (37 % C 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에서)에서 마우스 KCs를 문화. UVB 조사 직전, 성장 매체를 제거하고 PBS 500 μL로 교체하십시오. 그런 다음 세포를 25 mJ / cm 2 UVB 또는 모의 컨트롤 (UVB 없음)으로 처 리하십시오. 주 : UVB 조사는 이전 10 바와 같이 8 개의 W 전구 (312 ㎚)와 휴대용 UVB 램프를 사용하여 수행된다. UVB 조사 후 PBS를 흡인하고 새로운 배지를 첨가한다. </li><li> 측정 및 6, 8의 CCK-8 세포 생존 분석으로 세포 생존율을 정량화하고, 제조자의 지시 11 다음 24 시간 후 UVB 치료. </li><li> 원하는 시점에서 UVB로 치료 KCs에서 조건 미디어를 수집하고 TNFα 릴리스를 측정제조사의 지시에 따라 마우스 TNF (Mono / Mono) ELISA kit에 의한 조건 매질에서 7 , 12 . </li></ol>

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피부 표피는 몸을 외부 환경으로부터 분리 및 보호하고 수분 손실, 병원체, 열 및 자외선 조사로 인한 손상을 방지하는 중요한 장벽으로 작용합니다. KC는 표피의 주된 세포 계통이며 표피 KC의 일차 배양은 장벽 형성의 생물학적 과정과 in vitro에서의 환경 모욕 에 대한 KCs의 반응을 연구하고 이해하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 일차 표피 KC를 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 일차 마우스 KC는 신생아 마우스 피부에서 편리하게 분리 될 수 있지만, 성숙한 KC의 격리 및 성공적인 배양은 표피의 얇아짐 및 성인 마우스 등쪽 피부의 높은 모근 밀도로 인해 어렵다고 간주됩니다. 여기에 설명 된 방법은 기본 KC의 편리하고 풍부한 출처로 성인 마우스 꼬리 피부를 사용합니다. 두꺼운 표피 및 낮은 것의 존재 때문에<html> 꼬리 피부의 모낭 밀도가 낮아지면 표피를 진피에서 분리하여 KC를 분리하는 중...

피부는 신체에서 가장 큰 기관이며 표피는 바깥쪽에 가장 많이 있습니다. 표피는 신체와 환경을 분리하기 위해 손상되지 않은 표피 장벽을 형성하는데 결정적인 역할을하므로 물 손실을 방지하고 알레르기 항원, 병원체 및 UVB 노출과 같은 환경 모욕으로부터 보호합니다. 표피는 미분화 된 기저 각질 세포 (KCs)의 단일 층에서부터 기저층, 가시 돌기 층, 과립층 및 각질층으로 구성된 다층 층상 상피로 발전한다. 표피 줄기 세포와 중계 증폭 세포로 구성된 기초 KC는 증식 성이 있고 미분화되어있다. 기초 KC가 세포주기를 빠져 나감에 따라, 세포는 분화를 결정하고 세포 - 세포 접합의 성숙과 표피 투과성 장벽 (epidermal permeability barrier, EPB)의 형성과 함께 표피 표면을 향해 서서히 이동한다. 가시 광선 층의 KC는 초기 별 차이를 표현합니다.케라틴 10 (K10)과 같은 이온 마커; KCs가 세분화 된 층으로 이동함에 따라 세포는 Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) 및 Involucrin (INV)과 같은 후기 분화 마커를 발현합니다. 각질층에서 KC는 말단 분화 된 각질 세포가되어 새로운 세포가 그들을 대체 할 때 결국 박리를 통해 흘러 나온다. 칼슘은 표피에서 가장 생리적 인 작용제로 간주 되며 in vitro 및 in vivo 에서 유사한 방식으로 분화 를 유발합니다. 정상 피부 표피에서는 칼슘 이온이 피부 표면을 향한 농도가 증가하는 특징적인 &quot;농도 구배&quot;를 형성합니다 1 , 2 , 3 . 칼슘 농도는 가장 낮은 층 (기저부 및 가시 돌기)의 낮은 수준에서 상부의 과립층의 첨단으로 상승한 다음 가장 표면적인 층 (각질층)에서는 무시할 수있는 수준으로 떨어집니다.<html> 칼슘 구배는 성분 투과성 장벽의 출현과 동시에 발생하며 칼슘 신호 전달이 KC 분화의 중요한 역할을한다는 것을지지합니다. 시험 관내 에서 낮은 칼슘 (0.02-0.1 mM)은 단일 층으로서 기저부 KCs의 증식을 유지하지만, 높은 칼슘 (&gt; 0.1 mM)은 단단 - 접합 형성 및 유도에 의해 입증 된 바와 같이 말단 분화에 대한 세포의 신속하고 돌이킬 수없는 공약을 유도한다 기초 칼슘 4 , 5 에 대한 높은 칼슘 처리시 LOR 및 INV 장벽 형성 외에도 표피 KC는 피부의 타고난 면역계의 중요한 구성 요소입니다. UVB 조사 또는 손상시 방출되는 병원균 또는 손상 관련 분자 패턴 (DAMP)에 대한 반응으로 KC는 TNFα, IL6 및 IFNβ와 같은 염증성 사이토 카인을 대량 생산하여 면역계 활성화를 유도합니다&gt; 6 , 7 , 8 , 9 . 병원균 제거를 위해서는 KC로부터의 적절한 염증 신호가 필요하지만 통제되지 않은 염증 반응은 건선이나 주사와 같은자가 염증성 피부 질환의 발병을 유발할 수 있습니다 6 , 8 . 전반적으로, KC는 손상되지 않은 피부 장벽을 유지하고 병원균 침입 또는 환경 모욕시 면역 반응을 시작하는 데 중요한 역할을합니다. 그러므로 상피 세포의 일차 배양은 상피 생물학, KC 분화 및 KC 자극에 의한 타고난 면역 반응을 연구하는데 유용한 기술이다. 주요 마우스 표피 KC의 분리 및 배양은 KC의 다양한 자각 감수성 및 감수성으로 인해 어려운 과정이 될 수 있습니다. 여기에서 우리는 신생아 마우스 피부에서 KCs를 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다성인 마우스 꼬리 피부. 성인 KC 격리의 경우, 우리는 다음과 같은 이유로이 조직에서 생존 가능한 KC를 충분히 분리하기가 어려울 수 있으므로 마우스 등쪽 피부를 사용하지 않습니다. 첫째, 모발주기 (휴지기)의 휴지기에있는 성인의 지느러미 피부는 얇은 표피는 단지 1-2 층의 세포로 이루어지기 때문에 낮은 세포 수율과 표피와 진피의 비효율적 인 분리가 이루어 지는데, 이것은 성공적인 KC 격리를위한 중요한 단계입니다. 둘째로, 성인의 지느러미 피부에 존재하는 높은 모낭 밀도는 진피에서 표피를 분리하는 어려움에 더 기여합니다. 대신, 우리는 일상적으로 꼬리 피부를 성인 마우스 KCs의 공급원으로 사용합니다.이 상피는 표피 KC 3-5 층으로 두껍습니다. 또한 모낭의 밀도가 낮아 표피 분리를 방해하지 않으므로 마우스의 나이와 머리카락 순환 단계에 관계없이 성인 마우스 꼬리 피부와 KC 격리가 가능합니다. 고립 된 신비탈크 KC는 젤라틴 코팅 배양 접시에 뿌리는 반면, 콜라겐 코팅 배양 접시는 성숙한 세포가 신생아 대응 물과 비교할 때 손상된 능력 때문에 분리 된 성인 KC를 배양하는데 사용됩니다. 마우스 KC를 배양하기 위해 저칼슘 기저 배지에는 표피 성장 인자 (EGF), 소 트랜스페린, 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF1), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 소 혈청 알부민 (BSA) 및 하이드로 코르티손이 포함 된 dGS가 보충된다. 초기 도금 후 2-4 일 사이에 대부분의 분화 된 KC는 매일 중간 배양 중에 씻겨 나갈 수 있고 나머지 접착 세포는 전형적인 조약돌 형태 4를 나타내며 증식하고 초기 분화 마커 K10을 발현하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 신생아 또는 성체 야생형 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>야생형 마우스(원래 Jackson Laboratory에서 구입)는 UCSD의 동물 사육장에서 사육 및 유지됩니다.</td></tr><tr><td>KC 기저 배지(EpiLife)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>MEPICF500</td><td>0.06mM CaCl2</td></tr><tr><td>Defined Growth Supplement(dGS)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S0125</td><td>배양 배지용 정의 성장 보조제</td></tr><tr><td>Dispase 분말</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>17105041</td> 효소를 사용하여 <td>진피</td></tr><tr><td>에서 표피를 해리합니다.부착 인자</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S006100</td><td>젤라틴 기반 코팅</td></tr><tr><td>재료 코팅 매트릭스</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>R011K</td><td>콜라겐 기반 코팅 재료</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>12604-013</td><td>표피 시트에서 각질 세포를 해리하는 부드러운 트립신 유사 효소</td></tr><tr><td>100 &mu; m 세포 스트레이너 나일론 메쉬</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 세포 생존 키트</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td><td>CK04-11</td><td></td></tr><tr><td>마우스 TNF (모노 / 모노) ELISA Set II</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>555268</td><td></td></tr><tr><td>유선 핸드 헬드 UV 램프</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>EB-280C</td><td></td></tr><tr><td>8 와트 UV 튜브</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>세포 배양을 위한 BLE-8T312</td><td></td></tr><tr><td>광 도립 현미경</td><td>ZEISS, 예나, 독일</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

keratinocyte (KC)는 피부의 가장 바깥 쪽 레이어 인 표피의 주된 세포 타입입니다. 표피 KCs는 UVB 조사 또는 병원체와 같은 환경 모욕에 대하여 온전한 피부 장벽을 형성하고 또한 그 모욕에 염증 반응을 개시해서 피부 방위를 제공에있는 긴요 한 역할을한다. 여기에서는 신생아 마우스 피부 및 성인 마우스 꼬리 피부에서 KC를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 cheleed 태아 소 혈청 (cFBS)에 비해 정의 성장 보조제 (dGS)를 사용하여 culturing 조건을 설명합니다. 기능적으로, 우리는 신생아 및 성인 KC 모두가 높은 칼슘 - 유도 된 말단 분화, 단단한 접합 형성 및 층화에 매우 반응한다는 것을 보여준다. 또한, 배양 된 성인 KC는 UVB에 의해 유발 된 세포 사멸에 민감하며 UVB 조사시 다량의 TNF를 방출 할 수 있습니다. 함께 여기에 설명 된 방법 은 체외 모델의 설정에 대한 연구자에게 유용 할 것입니다신생아 마우스 및 / 또는 성인 마우스에서 표피 생물학을 연구합니다.

신생아 및 성인의 KCs의 높은 칼슘 유도 된 말단 분화. 관세청 도금 및 0.06 mM의 CaCl2를 유지 일차 마우스 상피 세포는 단층으로 성장하고, 각 셀은 조약돌 모양을 나타내는, 구별 간 공간 다각형했을 때 합류 (도 1a 및도 2a). CaCl2를 행 0.2mM의 승강은 세포의 급격한 형태 변화를 유도. 높은 칼슘 스위치 후 8 시간 이내에 세포가 평평 해지고 뚜렷한 세포 간 공간이 덜 명확 해졌으며 24 시간이 지나면 단단한 접합점을 가진 세포 - 세포 접착이 분명 해졌다 ( 그림 1A 및 그림 2B ). 각질화 된 세포 외피의 형성과 수직 세포 층상 화는 고 칼슘 스위치 후 ...

표피 각질 형성 세포 (epidermal keratinocytes)는 기능적인 피부 장벽을 형성하고 외부 환경 모욕에 대한 숙주 방어의 최전선에 위치하고 있습니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 표피 각질 형성 세포를 분리하고 1 차 배양하고 각질 세포에서 최종 분화 및 UVB 유발 염증 반응을 유도하는 방법을 설명합니다.

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 신생아 또는 성체 생쥐의 피부에서 일차 배양 생쥐 각질세포를 분리하여 인비트로(in-vitro) 분화를 연구하거나, UVb 노출에 따른 선천성 면역 반응을 연구하는 것입니다. 이 방법은 각질세포의 분화가 어떻게 조절되는지, 또는 표피 각질세포가 외부 자극에 어떻게 반응하는지에 대한 표피 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신생아 및 성체 생쥐 피부 모두에서 각질세포를 통상적인 방법으로 분리할 수 있으며, 혈청 없이 배양할 수 있다는 점입니다.제 실험실의 연구원인 Fengwu Li가 저와 함께 절차를 시연하겠습니다. 먼저 야생형 C57 BL6 생후 0~2일령 생쥐 신생아의 사지를 손목 관절 바로 윗부분에서 제거하고, 꼬리 끝부분을 약간 남긴 채 완전히 절단하십시오. 날카로운 가위를 꼬리 구멍을 통해 삽입하여 몸통의 등쪽 정중선을 따라 목의 개구부까지 피부를 절개하십시오.포셉 하나로 노출된 몸통을 잡고, 다른 포셉으로 피부를 잡습니다. 그다지 피부가 조각나지 않도록 주의하며 몸통에서 다리 그루터기 방향으로 한 번의 연속적인 동작으로 피부 전체를 부드럽게 벗겨냅니다. 벗겨낸 피부를 10 cm 페트리 접시에 담긴 50 mL의 멸균 PBS로 헹군 후, 피부가 접히지 않도록 주의하며 얼음처럼 차가운 dispase 소화 버퍼가 들어 있는 2 mL 튜브에 넣습니다.모든 신생아 피부 시트의 수집이 완료되면, 튜브를 4°C의 회전 혼합기에 넣고 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날 아침, 튜브의 내용을 새로운 페트리 접시에 분배합니다. 그런 다음, 잔류 dispase를 제거하기 위해 각 조직 조각을 50 mL의 멸균 PBS가 담긴 새로운 페트리 접시로 옮깁니다.두 개의 핀셋을 사용하여 피부 시료를 각각의 페트리 접시에 표피 면이 아래로 향하게 놓고, 피부 주름을 조심스럽게 펴서 시료가 접시 바닥에 완전히 펼쳐지도록 합니다. 각 접시에 500 µL의 트립신 기반 소화 용액을 첨가하고, 한 개의 핀셋으로 표피를 고정한 상태에서 다른 핀셋으로 각 진피를 천천히 들어 올려 표피로부터 분리합니다. 분리된 표피의 기저면이 아래를 향하도록 트립신 용액에 띄우고 접시의 덮개를 닫습니다.그 다음, 피부 조각을 수평 진탕기(horizontal shaker)에 넣고 실온에서 20분 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 배양이 끝나면 각 페트리 접시의 표피당 2mL의 보충된 각

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

인간의 피부에서 가능한 성인 상피 줄기 세포를 분리의 신속하고 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 모낭과 세포 배양에 대한 단세포 suspensions 또는 조직의 파편의 격리에 따버릴 다음 피부 콜라겐 매트릭스의 효소 소화를 활용합니다.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

이 비디오는 효소 분해와 기계적 파괴 방법을 조합하여 인간 피부의 표피층에서 가장 두드러진 세포인 각질 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 선택적 성장 배지를 사용하여 다른 피부 세포 유형보다 각질 세포의 우선적 성장을 돕습니다.

인간 피부 각질 세포 분리: 피부 샘플에서 1차 각질 세포를 배양하는 방법

성체 줄기세포 생물학을 연구하기 위한 이상적인 모델은 쥐의 모낭입니다. 여기에서는 모낭, 줄기세포 및 표피 각질세포의 다양한 집단을 분리하기 위한 프로토콜을 제시하며, 쥐 등쪽 피부의 효소 분해와 FACS 분석을 사용합니다.

등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

인간의 피부는 외부 환경에 대 한 방어의 첫 번째 줄 역할을 합니다. 우리는 성인 피부에서 기본 인간의 keratinocytes를 격리 하기 위한 방법을 제시. 이러한 격리 keratinocytes 수많은 실험 설정에 유용 하 고 공부 하는 분자 메커니즘 피부 생물학에 생체 외에서. 에 대 한 매우 적합 한...

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

이 프로토콜의 목표는 분자 생물학, 생화학, 형광 활성화 세포 선별 및 1 차 체외 용도 (예를 들어, 클로노겐성)와 같은 다양한 다운스트림 응용 을 위해 성인 마우스의 등쪽 피부로부터 표피 각질 세포를 분리하는 것입니다. 각질 세포).

마우스 표피 각질 세포와 체외 클로노겐 문화의 격리

이 프로토콜은 마우스 모델에서 피부 각질을 분리하고, 금속 태그가 달린 항체로 염색하고, 다른 세포 주기 단계에서 관심 있는 단백질의 발현 패턴을 프로파일화하기 위해 질량 세포 측정에 의해 염색된 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

여기서 우리는 3D 서스펜션 문화에서 표피 스페로이드의 체계적인 재배를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 상피 조직 유형과 여러 인간의 질병 및 조건의 모델링에 사용하기위한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

본 프로토콜은 성인용 마우스 입맛에서 파생된 구강 각질 세포의 격리 및 배양을 설명합니다. 면역스테인링을 이용한 평가 방법도 보고된다.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

이 프로토콜은 살아있는 세포 이미징에 사용하기 위해 갓 채취한(계대 0) 각질세포의 배양을 간략하게 설명합니다.

Keratinocyte Live Cell Imaging을 위한 1차 배양 생성

여기서는 마우스 혈관선상에서 원발 주변 세포를 분리, 정제, 배양하는 프로토콜을 제시하며, 달팽이 측벽 질환을 연구하기 위한 산화 스트레스 및 세포 노화의 시험관 내 모델을 구축하는 방법을 제시합니다.

신생아 마우스에서 혈관선상균의 1차 경계 세포 분리 및 배양

학습하세요 신생아 및 성인 마우스 피부에서 1차 각질 세포를 분리하고 배양하는 방법을. 이 기술은 피부 장벽 기능과 선천성 면역 반응을 연구하는 데 활용됩니다.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

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