Name: 레이저 도플러: 췌 장 섬 Microvascular Vasomotion에 Vivo에서 측정 하기 위한 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 배우세요 레이저 도플러를 활용한 췌장 섬 미세혈관 운동성 측정 방법으로 생체 내 혈류 기능 상태를 평가하고 당뇨병 등 췌장 관련 질환의 병리 기전을 규명하는 연구에 활용하세요.

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이 작품은 베이징 조합 의학 대학 청소년 기금 및 중앙 대학 (보조금 번호 3332015200)에 대 한 근본적인 연구 기금에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

모든 동물 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관에 따라 실행 했다. 지도 및 승인의는 연구소의 미세 동물 윤리 위원회 (IMAEC)에 베이징 조합 의학 대학 (PUMC) 현재 프로토콜 입증 되 고 수행 되었다.
1입니다. 동물
<ol><li>실험을 시작 하기 전에 12-h 빛 어두운 주기의 아래 케이지, 제어 온도 (24 ± 1 ℃)와 습도 (55 ± 5%), 3 개의 BALB/c 마우스를 유지. 일반 식품 및 물 쥐를 수 있습니다.</li>
	<li>임의로 나눌 쥐 비 당뇨병 제어 그룹 및 당뇨병 그룹. 정확 하 게 각 개별 마우스 무게 고 각 마우스의 몸 질량을 사용 하 여 주입 볼륨을 계산.</li>
	<li>Streptozotocin (STZ) 주입 하기 전에 4 h에 대 한 마우스를 빨리 하 고 실험 주 1에 정상적으로 정기적으로 물을 제공 합니다.</li>
	<li>PH 4.3에서 0.1 M 나트륨 구 연산 염 버퍼를 준비 합니다. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에는 솔루션의 1 mL를 넣고 microcentrifuge 튜브 빛에 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일에 포장.</li>
	<li>나트륨 구 연산 염 버퍼 (pH 4.3) 사용 하기 전에 5 mg/mL의 최종 작업 집중에에서 STZ 해산.</li>
	<li>1 mL 주사기 25 G 바늘을 사용 하 여 40 mg/kg의 복용량에 STZ의 당뇨병 그룹 복 주사의 쥐를 제공 합니다. 나트륨 구 연산 염 버퍼 (pH 4.3)의 동일한 양으로 비 당뇨병 컨트롤의 마우스를 주사.</li>
	<li>다시 감 금 소에 쥐를 넣어 하 고 일반 식품 및 10% 자당 물 공급.</li>
	<li>실험적인 일 2-5 (즉, 다음 4 일 연속)에 1.3-1.7 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>마지막 STZ 주입 후 10% 자당 물 일반 물으로 교체 합니다.</li>
	<li>빠른 6 h에 대 한 마우스는 하지만 그들에 게 물에 자유 접근을 9 일 후 (실험 하루 14) 그들의 혈액 포도 당 수치를 측정 합니다. 혈액 포도 당 모니터링 시스템을 사용 하 여 혈당을 확인 하는 꼬리 정 맥에서 혈액 샘플을 수집 합니다. 참고: 마우스 혈액 포도 당 수준 > 200 mg/dL로 당뇨병 간주 됩니다.</li>
</ol>2입니다. 악기의 준비
<ol><li>프로브 팁의 광학 표면 및 입자 또는 어떤 먼지 든 지 제거 하는 부드러운, 비-연마 천으로 레이저 도플러 장치의 프로브 커넥터 청소. 악기 (그림 1A)의 포트에 케이블을 꽂습니다.</li>
	<li>플럭스를 실험 주위 (일반적으로 30 분 동안 실내 온도) 열 평형에 표준 함으로써 교정 스탠드를 조립. 유량을 흔들어 부드럽게 10 s 및 하자에 대 한 표준 2 분 동안 휴식.</li>
	<li>교정 자료 가운데 플럭스 표준 컨테이너를 배치 합니다. 최대 높이에 클램프를 조정 하 고 같은 컨테이너 아래쪽으로 가리키도록 클램프에 프로브를 보호. 플럭스 표준 프로브 아래 올바르게 놓였는지 확인 하십시오.</li>
	<li>팁은 제대로 플럭스 표준에 빠져들 때까지 천천히 아래로 프로브를 이동 합니다. 고 레이저 도플러 장치에 "교정"를 눌러 선택한 프로브에 연결 되어 작동 채널을 선택 합니다. "성공적인 교정" 통지 레이저 도플러 장치 화면에 표시 될 때까지 교정 프로그램을 실행 합니다.</li>
	<li>프로브 프로브 홀더를 사용 하 여 보호 합니다. 수동으로 보안을 피하기 위해 운동 조사.</li>
	<li>일정 온도 (24 ± 1 ° C)에서 실험 룸과 습도 (50 ~ 60%)를 유지 합니다.</li>
	<li>외부 빛 유도 된 변화를 피하기 위해 실험을 수행 하기 전에 모든 외부 빛 (형광등 및 스폿 램프) 등을 해제 합니다.</li>
</ol>3입니다. 동물의 준비
<ol><li>압력솥은 수술 장비와 사용 하기 전에 실내 온도에 냉각 하도록 허용.</li>
	<li>쥐에 게 췌 장 섬 microvascular vasomotion 레이저 도플러에 의해 검출 하기 전에 실험 환경에 순응을 10 분.</li>
	<li>3 %pentobarbital 나트륨의 1 mL에 1 mL 주사기를 채우십시오. Anesthetize 쥐 pentobarbital 나트륨 솔루션 (i.p. 75 mg/kg)을 주입.</li>
	<li>건조를 방지 하기 위해 미리 moistened 의료 거 즈와 마우스의 눈을 커버.</li>
	<li>마우스의 식을 완전히 잃는다 고 꼬리에 더 이상 응답 또는 hindfoot pinches 집게와 확인 하십시오. 필요한 경우 pentobarbital 솔루션의 초기 주입 볼륨의 10% 보완 하 여 마 취를 유지 하는 15 분 마다 마 취와 내부 요원 이벤트를 통해 마 취를 모니터링 합니다.</li>
	<li>동물 아래 반 격리 층을 가진 난방 패드를 배치 하 고 동물 부정사 위치에 놓고 레이저 도플러 장치 작업 역에 그것을 전송. 외과 테이프 작업 플랫폼에 마우스를 수정 합니다.</li>
	<li>면봉, betadine 그리고 75% 에탄올으로 마우스의 복 부 피부는 복 부 지역 깨끗 한 면봉을 사용 됩니다.</li>
	<li>2% lidocaine/0.5% bupivacaine (50/50) 혼합물을 피하 주사.  ~ 3 cm를 잘라-거 즈 갯 솜의 중앙에 직경 구멍. 거 즈 스폰지와 복 부 지역 커버.</li>
	<li>집게와 복 부 피부를 들어올리고 메스 또는 피부가 위를 사용 하 여 복 부의 정중 선 따라 초기 수직 절 개 합니다.</li>
	<li>집게와 기본 근육을 잡고 복 부 구멍을 입력을 incise. 어떤 장기를 다치게 하지 않습니다. 가슴 복 부 구멍을 통해 피부와 내부 근육을 접어. 부드럽게 췌 장 몸과 무딘 코 집게의 쌍을 사용 하 여 비장을 노출 합니다.</li>
</ol>4. 데이터 수집 분석
<ol><li>클릭 하 여 레이저 도플러 장치 소프트웨어를 실행 하 여 "파일" → "New" 새로운 측정 파일을 만듭니다. "일반" 탭에서 연결 된 모니터를 구성 하려면 설정 모니터링 기간을 "무료로 실행 합니다." "LDF 모니터" 탭 "다음"을 클릭에 대 한 기본값을 사용 하 여</li>
	<li>"디스플레이 설정 대화 상자."에서 그래프 표시 설정 해당 상자를 선택 하 여 "플럭스, 광, 속도" 채널을 선택 합니다. 다음 매개 변수를 선택: "채널에 대 한 데이터 소스" 및 "레이블, 단위 그리고 색." 다음 클릭 합니다 "."</li>
	<li>"파일 정보 대화 상자"에서 주제 및 측정 (즉, 이름 및 제목 번호, 연산자, 모니터링 시간, 의견, 등)에 대 한 사용자 정보를 입력 하 고 측정 구성 완료 "다음"을 클릭 합니다. 참고: 측정 창 (그림 1B) 소프트웨어에 의해 자동으로 만들어집니다.</li>
	<li>수동으로 췌 전극 진행. 프로브 및 췌 장 조직 사이의 거리가 1 m m 이내 다는 것을 확인 하십시오. 부적 절 한 거리를 인위적으로 증가 또는 감소 혈액 흐름 읽기를 제공합니다.</li>
	<li>Microvascular 혈액 관류 단위 (PU) 데이터를 녹음을 시작 "시작" 도구 모음 아이콘을 클릭 합니다. 모든 실행 1 분 동안 지속적으로 PU 데이터를 수집 합니다. "중지" 측정을 중지 하려면 클릭 합니다. 선택 "파일" → "다른 이름으로 저장" 이름 하 고 완성 된 측정 파일 저장.</li>
	<li>수동으로 첨가제 효과 수축의 지역화 된 피로 피하기 위해 각 실행 후 프로브를 위치 및 휴식. 각 마우스에 대 한 다 지점 (즉, 3 췌 장 조직에서 무작위로 선택한 포인트) microvascular PU 데이터 수확 4.1-4.4 단계 반복 합니다. 기준 컨트롤 아닌 반사 판의 PU 데이터를 측정 합니다.</li>
	<li>복 부 근육 층과 피부 레이어는 봉합 사를 닫습니다. 실험 후 깨끗 한 장에 동물을 놓습니다.</li>
	<li>난방 패드 절반에 복구 케이지를 배치 하 여 동물 따뜻한을 유지. 참고: 주의 온 정, 위생, 액체 및 음식 섭취 및 감염. 수술 후 통증 관리로 2 mg/kg Carprofen 48 h와 마우스를 관리.  마우스는 심한 통증이 나 고통 완화 될 수 없는 상태에 있을 때 pentobarbital 나트륨 i.p. 150 mg/kg을 주입 하 여 안락사를 수행 합니다.</li>
</ol>5. Microvascular Vasomotion의 매개 변수 계산
<ol><li>레이저 도플러 소프트웨어의 "내보내기" 명령을 사용 하 여 시간 및 PU 원시 데이터를 *.xlsx 파일로 내보내고 스프레드시트에서 파일을 엽니다.</li>
	<li>평균 초기 관류 장치 (PUb) 계산 (단계 4.6 참조).</li>
	<li>평균 혈액 관류 (PU는) 측정의 1 분을 다음과 같이 계산: 혈액 관류 (PU는) 평균 = PU-PUb (식 1).</li>
	<li>측정 각 1 분에 대 한 주파수 (사이클/분)을 계산 합니다. 참고: microvascular vasomotion의 주파수는 분당 microvascular vasomotion 웨이브에서 발생 한 봉우리의 수로 정의 됩니다.</li>
	<li>측정 각 1 분 진폭 (ΔPU)을 계산 합니다.<ol>
<li>Microvascular vasomotion의 진폭 (PU최대) 최대 및 최소 (PU분) 간의 차이 계산: 진폭 (ΔPU) = PU최대 -PU분 (식 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>측정 각 1 분에 대 한 상대 속도 (PU)를 계산 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Microvascular 역 기능 (예: 당뇨병, 급성 췌 장 염, 주변 microvascular 질병, 등)을 포함 하는 경우, 일부 질병 감소 혈액 흐름 이어질. 혈액의 흐름에 변화, 이외 중요 한 지표, microvascular vasomotion 같은 미세 혈관의 기능 상태를 반영 하는 있다. 특정 표시기, microvascular vasomotion, microvascular 침대에 microvascular 톤의 진동으로 일반적으로 정의 됩니다. 현재 프로토콜 모니터링 시스템 microvascular 혈액 관류 직접 시각화 및 microvascular vasomotion의 기능 상태의 정량 분석에 대 한 수 있습니다. 우리의 microcirculatory 평가 접근을 선택적으로 대상된 조직 및 장기에 혈액 관류에서 동적인 변화를 식별 하 여 적용할 수 있습니다. 보고서 레이저 도플러 당뇨병에 microvascular 혈액 관류의 역할을 사용 하 여에 대 한 다른 그룹에 의해 출판 및 그 ...

미세 혈관의 기능 상태를 매개로 microvascular vasomotion 납품 및 산소, 영양분, 호르몬의 교환에 대 한 책임 및 대사 제품, 이산화 탄소, 세포 폐기물 등의 제거에 중요 한 1. microvascular vasomotion 또한 혈액 흐름 분포 및 따라서 로컬 microcirculatory 혈압과 염증, 부 종에 많은 질병을 일으킬 수 있는 응답을 영향을 미치는 조직 관류를 조절. 따라서, microvascular vasomotion 장기2,3,4, 조직 및 구성 세포의 생리 기능을 유지 하기 위해 매우 중요 하다. Microvascular vasomotion의 장애는 미세 혈관 관련 질병5의 개발에 중요 한 단계 중 하나를 수 있습니다.
레이저 도플러 관측 및 미세 혈관 연구6의 분야에서 정량화 처음 개발 되었다. 이 기술은 다른 기술 방식 (예: 레이저 반점7, 경 피 성 산소, 등등), 함께 미세 혈관에 혈 류를 평가 하기 위한 황금 표준으로 여겨 왔다. 근거 (즉, 모 세관, arterioles, venules, 등) 로컬 미세의 혈액 관류 장치 레이저 도플러, 장비에 의해 결정 될 수 있다 도플러 이동 원리를 기반으로 합니다. 파장 및 유도 방출 빛의 주파수 변경 microvessels에서 이동 혈액 세포를 발생 하는 빛 입자 또는 그들은 변경 되지 않습니다. 따라서 미세 혈관, 혈액 세포의 속도 수 microvascular 혈액 흐름 방향은 관련 동안 크기 및 도플러 이동 빛의 주파수 분배에 관련 된 중요 한 요소는. 다른 방법을 사용 하 여, 다양 한 조직 microcirculatory 연구는 mesenteries를 포함 하 여 사용 되 고 지 느 러 미, 생쥐의 피부 집계로 챔버 쥐, 햄스터, 그리고 심지어 인간8. 그러나, 현재 프로토콜에서 우리는 기능에 초점을 사용 하 여 계산 되는 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 상태 레이저 도플러 및 수 제 평가 매개 변수 시스템.
췌 장 섬 미세 주로 췌 장 섬 microvessels의 구성 이며, 독특한 특징을 전시. 췌 장 섬 모 세관 네트워크의 exocrine 대응9의 모 세관 네트워크 보다 5 배 높은 밀도 보여 줍니다. 입력된 포도 당 및 인슐린은 목표에 대 한 도관을 제공, 섬 내 피 세포 제공 산소 metabolically 활성 셀 섬에 β 세포. 또한, 증거를 신흥 보여 섬 microvessels; β-세포의 기능에 영향을 미치는에서 뿐만 아니라 인슐린 유전자 발현과 β-세포 생존 조절에 뿐만 아니라 관련 된 β-세포 증식; 홍보 그리고, vasoactive 신생 물질 및 성장 요인10의 수를 생산. 따라서,이 점에서 우리는 추측할 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태 섬 β-세포 기능에 영향을 미칠 수 있습니다 및 급성/만성 췌 장 염, 당뇨병 및 다른 질병의 병 인에 관여 췌 장 관련 질병입니다.
췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태의 병 적인 변화를 분석 하는 것은 위에서 언급 한 질병에 췌 장 섬 미세의 기여를 결정 하는 가능한 전략 될 수도 있습니다. 여기 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 결정 하는 접근을 설명 하는 자세한 단계별 절차를 제공 합니다. 일반적인 측정 대표 결과에 표시 됩니다. 마지막으로, 이점 및 방법의 제한 토론, 추가 응용 프로그램 함께 강조 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>MoorVMS-LDF2</td><td>Moor Instruments</td><td>GI80</td><td>PeriFlux 5000 (Perimed Inc.)은 데이터를 수집하는 대체 장치로 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>MoorVMS-PC 소프트웨어</td><td>Moor Instruments</td><td>GI80-1</td><td>MoorVMS-LDF2</td></tr><tr><td>교정 스탠드</td><td>소프트웨어 Moor Instruments</td><td>GI-cal</td><td>교정 도구</td></tr><tr><td>교정 베이스</td><td>Moor Instruments</td><td>GI-cal</td><td>교정 도구</td></tr><tr><td>캘리브레이션 플럭스 표준</td><td>Moor Instruments</td><td>GI-cal</td><td>캘리브레이션 도구</td></tr><tr><td>One Touch UltraEasy 혈당계</td><td>Johnson and Johnson</td><td>#1955685</td><td>고혈당 확인</td></tr><tr><td>One Touch UltraEasy 스트립</td><td>Johnson and Johnson</td><td>#1297006</td><td>고혈당 확인</td></tr><tr><td>스트렙토조토신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0130</td><td>시트르산나트륨 완충액(pH 4.3)에 용해</td></tr><tr><td>펜토바르비탈 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3761</td><td>작동 농도 3 %</td></tr>에<tr><td>탄올</td><td>Sinopharm Inc.</td><td>200121</td><td>작업 농도 75 %</td></tr> <tr><td>설탕</td><td>Amresco</td><td>335</td><td>작업 농도 10 %</td></tr> <tr><td>의료 거즈</td><td>China Health Materials Co.</td><td>S-7112</td><td>외과</td></tr><tr><td>용 무딘 코 집게</td><td>Shang Hai Surgical Instruments Inc.</td><td>N-551</td><td>외과</td></tr><tr><td>수술 테이프</td><td>3M Company</td><td>3664CU</td><td>외과</td></tr><tr><td>거즈 스폰지</td><td>Fu Kang Sen Medical Device CO.</td><td>BB5447</td><td>외과</td></tr>용 <tr><td>메스</td><td>Yu Lin Surgical Instruments Inc.</td><td>175C</td><td>외과</td></tr><tr><td>피부 가위</td><td>Carent</td><td>255-17</td><td>외과</td></tr><tr><td>봉합</td>사 <td>Ning Bo Surgical Instruments Inc.</td><td>3325-77</td><td>수술용</td></tr><tr><td>주사기 및 25-G바늘</td><td>MISAWA Inc.</td><td>3731-2011</td><td>스케일 : 1 ml</td></tr></tbody></table>

레이저 도플러: 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 측정 하기 위한 도구

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

미세 혈관의 기능 상태, microvascular vasomotion 산소와 영양분의 공급과 이산화탄소와 폐기물의 제거에 대 한 중요 하다. Microvascular vasomotion의 장애는 미세 혈관 관련 질병의 발달에 있는 중요 한 단계를 수 있습니다. 또한, 매우 vascularized 췌 장 섬 내 분 비 기능을 지원 하기 위해 적응입니다. 이 점에서 그것은 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태 췌 장 섬 기능에 영향을 수 있습니다 추론 가능한 보인다. 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태의 병 적인 변화를 분석 기여를 결정 하는 가능한 전략 있을 수 있습니다 그 췌 장 섬 미세 혈관 관련된 질환, 당뇨병 mellitus, 같은 게 췌 장 염, 등. 따라서,이 프로토콜은 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태를 확인 하 고 설정 매개 변수 (평균 혈액 관류, 진폭, 주파수, 및 상대를 포함 하는 레이저 도플러 혈액 흐름 모니터를 사용 하 여 설명 합니다. 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 속도) microcirculatory 기능 상태의 평가 위해. Streptozotocin 유도 당뇨 마우스 모델에서 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 장애인된 기능 상태를 관찰합니다. 결론적으로, 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 평가 하기 위한이 방법은 췌 장 섬 질병에 관련 된 메커니즘을 계시 할지도 모른다.

Microvascular vasomotion 측정 레이저 도플러 기기 반도체 레이저 다이오드를 장착 사진 그림 1A에 표시 됩니다. 그림 1B사용자 인터페이스 소프트웨어를 제공. 위에서 언급 한 방법을 사용 하 여, 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 hemodynamic 매개 변수는 비 당뇨병 제어 및 당뇨병 쥐에 대 한 발견 했다. 다양 한 기술, 레이저 도플러 flowmetry를 포함 하 여 반영 및 흩어져 빛, 적외선 분광학, 그리고 때문에 처음 정의 되었다 microvascular vasomotion 공부 하 사용 되었습니다 이미징 기술. 표 1 연구 그룹 및 당뇨병과 관련 된 질병에 미세 혈관의 역할을 결정 하기 위해 레이저 도플러 기술을 사용 하는 게시 된 기사를 요약.
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췌 장 섬 microvascular vasomotion 섬 혈액 분포를 조절 하 고 섬 β 세포의 생리 기능을 유지 합니다. 이 프로토콜은 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 의 기능 상태를 확인 하 고 췌 장 섬 미세 췌 장 관련 질병에의 기여를 평가 하는 레이저 도플러 모니터를 사용 하 여 설명 합니다.

레이저 도플러: 췌 장 섬 Microvascular Vasomotion에 Vivo에서 측정 하기 위한 도구

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 생체 내(in vivo) 췌장 섬 미세혈관의 혈관 운동 상태를 결정하여 관련 질환에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이 방법은 병리적 상태에서 췌장 섬 미세혈관의 혈관 운동이 변화하는지 여부와 같이 의료 순환 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저희는 당뇨병의 발전 과정에서 진화한 기능적 기계적 순환이 존재함을 입증했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다.이 기술의 주요 장점은 임상 및 실험실 환경 모두에서 조직과 기관의 미세혈관 혈관 운동의 기능적 상태를 평가할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 췌도 관련 질환에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 신장 및 망막 관련 미세혈관 질환과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.이 기술의 응용 분야는 미세혈관 혈관운동의 기능적 상태에 나타나는 추세의 특성을 이해하는 것까지 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 실험 중 레이저 도플러를 통해 얻어지는 미세혈관 학술 데이터의 양이 방대하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 많은 요인이 미세혈관 순환 데이터의 정확한 수집에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로, 이 방법에 대한 시연이 매우 중요합니다.본 프로토콜은 생쥐에게 5일 연속으로 STZ를 매일 주사하는 것으로 시작합니다. STZ를 sodium citrate buffer에 녹여 5 mg/mL의 작동 농도로 조제합니다. 그 다음, 1 mL 주사기와 25 gauge 바늘을 사용하여 복강 내 주사를 실시합니다.마우스는 주사 전 4시간 동안 금식해야 하지만, 물 섭취는 제한하지 않아야 합니다. 대조군 마우스에는 동일한 부피의 순수 sodium citrate buffer를 주사합니다. 주사 후에는 마우스에게 일반 사료와 10% sucrose water를 제공합니다.STZ 주입 5일 후, 10% sucrose water를 일반 물로 교체합니다. 9일 후에 혈당을 측정합니다. 먼저 마우스에게 물은 자유롭게 섭취하게 하되 6시간 동안 금식시킵니다.그 다음, 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하고 표준 휴대용 혈당계를 사용하여 혈당을 측정합니다. 혈당 수치가 200 mg/dL를 초과하는 마우스는 당뇨병으로 간주합니다. 레이저 도플러 장치를 사용하기 전, 먼저 부드럽고 마모성이 없는 천으로 프로브 팁과 프로브 커넥터의 광학 표면을 닦아낸 후, 케이블을 기기의 포트에 연결합니다.다음으로, 교정 스탠드를 조립합니다. 먼저 보관된 플럭스 표준시료가 상온에 도달하도록 둡니다. 이 과정은 약 30분 정도 소요됩니다.그 다음, 플럭스 표준액을 10초 동안 부드럽게 흔든 후 교정 베이스 위에 2분간 그대로 둡니다. 이어서, 클램프를 최대한 높이 올린 다음 프로브를 클램프에 고정합니다. 이제 프로브를 플럭스 표준액에 천천히 담그고 프로브 홀더를 사용하여 프로브를 고정합니다.계속하려면 실내 조명을 낮추고 레이저 도플러 장치의 보정(calibration) 버튼을 누르십시오. 그런 다음 프로브가 연결된 작업 채널을 선택하고 보정 프로그램을 실행하십시오. 마취된 마우스를 작업 플랫폼 위에 배와 등 쪽이 위로 향하는 앙와위(supine position)로 배치하고 수술용 테이프를 사용하여 고정하십시오.다음으로, 경부에서 꼬리까지 복부 피부를 75% ethanol로 소독한 후, 중앙에 3 cm 너비의 구멍이 있는 마른 거즈 스펀지로 해당 부위의 주변을 덮습니다. 이어서 포셉으로 복부 피부를 들어 올리고, 메스나 피부 가위를 사용하여 복부 정중선을 따라 수직으로 초기 절개를 실시합니다. 그런 다음 포셉으로 하부 근육을 잡고 절개하여 복강으로 진입합니다.어떤 장기에도 손상을 주지 마십시오. 복강을 드러내기 위해 피부와 그 아래의 근육을 흉부 위로 접은 다음, 뭉툭한 끝의 포셉을 사용하여 췌장 체부와 비장을 조심스럽게 노출시킵니다. 이제 레이저 도플러 장치의 제어 소프트웨어에서 새로운 측정 파일을 생성하고 연결된 모니터를 설정하십시오.일반(general) 탭에서 모니터링 기간을 프리런(free run)으로 설정하고, LDF 모니터 탭은 공장 기본값을 사용하십시오. 다음으로, 디스플레이 설정 대화 상자를 열고 적절한 채널을 선택하십시오. 그런 다음 채널 및 레이블의 데이터 소스, 단위, 색상 매개변수를 전환한 후 다음(next)을 클릭하십시오.다음으로, 파일 정보 대화 상자에 피험자와 측정에 관한 식별 정보를 입력하고 다시 다음을 클릭하여 진행합니다. 이제 설정이 완료되었으며 측정 창이 나타납니다. 이어서, 전극을 췌장 1mm 이내까지 수동으로 전진시킵니다.측정의 정확도는 프로브와 췌도 조직 사이의 거리에 따라 달라집니다. 조직과 프로브 사이에 1 mm 간격을 세심하게 유지하지 않으면 혈류 측정값이 부정확해질 수 있습니다. 기록을 시작하려면 시작 아이콘을 클릭하십시오. 그러면 미세혈관 혈류 PU 데이터가 저장되기 시작합니다.이 과정을 1분 동안 수행하며, 기록 중에 표시되는 효과를 조절하기 위해 디스플레이 압축 및 확장 버튼과 그래프 트레이스 높이 증가 또는 감소 버튼을 사용한 다음 기록을 중단하십시오. 그 후, 적절한 이름으로 파일을 저장하십시오. 이제, 가산 효과와 수축 및 이완 능력의 국소적 고갈을 방지하기 위해 프로브의 위치를 수동으로 다시 조정하십시오.각 마우스의 췌장 내 무작위 지점 세 곳에서 PU 데이터를 수집합니다. 실험 도중 어느 시점에 비반사 플레이트에서 PU 데이터를 측정하여 기저 대조군 값을 확보합니다. 세 번의 측정을 마친 후, 3-0 봉합사로 근육층을 봉합하고 4-0 봉합사로 피부층을 봉합합니다.이제 마우스가 깨끗한 홈 케이지로 옮겨질 준비가 될 때까지 회복 케이지에서 관찰하십시오. 일반적으로 췌도(pancreatic islet)의 미세혈관 상태는 주기적인 수축 및 이완 단계로 나타납니다. 이러한 전반적인 혈역학적 현상은 혈류 관류 패턴을 형성합니다.레이저 도플러 장치를 사용하여 비당뇨병 및 당뇨병 쥐의 미세혈관 혈류 관류 분포 패턴을 보여주는 PU 데이터를 수집하였습니다. 그 결과는 완전히 달랐습니다. STZ로 유도된 당뇨병 쥐에서는 췌장 섬 미세혈관 혈관운동의 수축과 이완 리듬이 혼란스럽고 불규칙했던 반면, 비당뇨병 대조군에서는 리듬감 있는 진동이 나타났습니다.다음으로, PU 프로파일을 사용하여 혈관운동을 정량화했습니다. 대조군과 비교하여, STZ로 유도된 당뇨병 쥐의 췌도 미세순환 평균 혈류 관류는 감소했습니다. 또한, 이 쥐들은 혈관운동의 진폭과 빈도가 유의하게 감소했으며, 췌도로 향하는 혈류 관류의 상대적 속도 또한 감소한 것으로 나타났습니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 프로브와 췌장 조직 사이의 거리가 1mm 이내인지 확인하는 것이 중요합니다. 거리가 부적절하면 혈류 측정값이 인위적으로 증가하거나 감소하여 나타납니다.이 절차에 이어, 허혈 시각화, 혈류 평가, 미세혈관 혈관 운동의 기능적 상태 평가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 레이저 스펙클 및 산소 전이와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 내분비학 및 대사 분야의 연구자와 임상의가 췌도 관련 질환 뒤에 숨겨진 미세순환 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 레이저 장비를 사용하는 것은 방사선 노출로 인해 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 주변 환경이 눈에서 최소 200 millimeter 떨어져 있어야 하는 등의 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

laser-doppler-tool-for-measuring-pancreatic-islet-microvascular

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오에서는 세포 역학의 장기적인 시각화를 위해 안정화된 창을 통해 쥐 췌장의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.

Intravital Imaging: 안정화된 이미징 창을 통해 마우스 췌장의 세포 수준을 관찰하는 방법

레이저 microdissection은 실질의 미세한에서 선택한 셀의 복구를 할 수있는 기술입니다. 여기 transcriptomic 연구에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 섬을 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리 프로토콜은 따라서 자신의 컬렉션을 촉진 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상시킵니다.

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

우리는 광학 프로젝션 단층 촬영 (OPT)의 적응을...

당뇨병 연구에서 β-세포 질량 분포의 평가를위한 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 부근

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

인슐린 유도 혈관 근육 관류를 조절 하 고 증가 microvascular 표면적 (microvascular 모집) 용 질 exchange에 사용할 수 있는 혈액과 조직 interstitium 사이. 결합된 intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 동시에 큰 배와는 미세 혈관에서 인슐린의 활동을 평가 하 여 vivo에서.

Intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 마우스 Hindlimb의 인슐린 유도 된 혈관과 근육 관류 결합

이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

여기에서, 우리는 마우스 뒷다리에 있는 혈류를 측정하기 위하여 레이저 도플러 관류 화상 진찰을 위한 기술 그리고 필요한 통제를 보여주는 프로토콜을 제시합니다.

마우스 힌드림에 있는 레이저 도플러 관류 화상 진찰

우리는 급성 췌장 조직 조각의 준비와 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사에서의 사용을 제시하여 많은 수의 살아있는 세포, 오랜 기간 동안 그리고 높은 시공간 분해능으로 칼슘 역학을 동시에 연구합니다.

급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사

췌장의 생체 내 고해상도 이미징은 췌장 내 생체 내 이미징 창으로 촉진되었다.

췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

마우스에서 오른쪽 신장 절제 후 일측 신장 허혈-재관류 시 신장 미세혈관 혈류 변화를 모니터링하기 위해 레이저 스펙클 대조 영상 시스템을 사용하였습니다.

쥐의 신장 허혈-재관류 손상 중 레이저 반점 조영 영상으로 모니터링되는 미세혈관 관류

배우세요 레이저 도플러를 활용한 췌장 섬 미세혈관 운동성 측정 방법으로 생체 내 혈류 기능 상태를 평가하고 당뇨병 등 췌장 관련 질환의 병리 기전을 규명하는 연구에 활용하세요.

레이저 도플러: 췌 장 섬 Microvascular Vasomotion에 Vivo에서 측정 하기 위한 도구

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