레이저 도플러: 췌 장 섬 Microvascular Vasomotion에 Vivo에서 측정 하기 위한 도구

본 실험 절차의 전체적인 목표는 생체 내(in vivo) 췌장 섬 미세혈관의 혈관 운동 상태를 결정하여 관련 질환에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이 방법은 병리적 상태에서 췌장 섬 미세혈관의 혈관 운동이 변화하는지 여부와 같이 의료 순환 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저희는 당뇨병의 발전 과정에서 진화한 기능적 기계적 순환이 존재함을 입증했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다.

이 기술의 주요 장점은 임상 및 실험실 환경 모두에서 조직과 기관의 미세혈관 혈관 운동의 기능적 상태를 평가할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 췌도 관련 질환에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 신장 및 망막 관련 미세혈관 질환과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

이 기술의 응용 분야는 미세혈관 혈관운동의 기능적 상태에 나타나는 추세의 특성을 이해하는 것까지 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 실험 중 레이저 도플러를 통해 얻어지는 미세혈관 학술 데이터의 양이 방대하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 많은 요인이 미세혈관 순환 데이터의 정확한 수집에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로, 이 방법에 대한 시연이 매우 중요합니다.

본 프로토콜은 생쥐에게 5일 연속으로 STZ를 매일 주사하는 것으로 시작합니다. STZ를 sodium citrate buffer에 녹여 5 mg/mL의 작동 농도로 조제합니다. 그 다음, 1 mL 주사기와 25 gauge 바늘을 사용하여 복강 내 주사를 실시합니다.

마우스는 주사 전 4시간 동안 금식해야 하지만, 물 섭취는 제한하지 않아야 합니다. 대조군 마우스에는 동일한 부피의 순수 sodium citrate buffer를 주사합니다. 주사 후에는 마우스에게 일반 사료와 10% sucrose water를 제공합니다.

STZ 주입 5일 후, 10% sucrose water를 일반 물로 교체합니다. 9일 후에 혈당을 측정합니다. 먼저 마우스에게 물은 자유롭게 섭취하게 하되 6시간 동안 금식시킵니다.

그 다음, 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하고 표준 휴대용 혈당계를 사용하여 혈당을 측정합니다. 혈당 수치가 200 mg/dL를 초과하는 마우스는 당뇨병으로 간주합니다. 레이저 도플러 장치를 사용하기 전, 먼저 부드럽고 마모성이 없는 천으로 프로브 팁과 프로브 커넥터의 광학 표면을 닦아낸 후, 케이블을 기기의 포트에 연결합니다.

다음으로, 교정 스탠드를 조립합니다. 먼저 보관된 플럭스 표준시료가 상온에 도달하도록 둡니다. 이 과정은 약 30분 정도 소요됩니다.

그 다음, 플럭스 표준액을 10초 동안 부드럽게 흔든 후 교정 베이스 위에 2분간 그대로 둡니다. 이어서, 클램프를 최대한 높이 올린 다음 프로브를 클램프에 고정합니다. 이제 프로브를 플럭스 표준액에 천천히 담그고 프로브 홀더를 사용하여 프로브를 고정합니다.

계속하려면 실내 조명을 낮추고 레이저 도플러 장치의 보정(calibration) 버튼을 누르십시오. 그런 다음 프로브가 연결된 작업 채널을 선택하고 보정 프로그램을 실행하십시오. 마취된 마우스를 작업 플랫폼 위에 배와 등 쪽이 위로 향하는 앙와위(supine position)로 배치하고 수술용 테이프를 사용하여 고정하십시오.

다음으로, 경부에서 꼬리까지 복부 피부를 75% ethanol로 소독한 후, 중앙에 3 cm 너비의 구멍이 있는 마른 거즈 스펀지로 해당 부위의 주변을 덮습니다. 이어서 포셉으로 복부 피부를 들어 올리고, 메스나 피부 가위를 사용하여 복부 정중선을 따라 수직으로 초기 절개를 실시합니다. 그런 다음 포셉으로 하부 근육을 잡고 절개하여 복강으로 진입합니다.

어떤 장기에도 손상을 주지 마십시오. 복강을 드러내기 위해 피부와 그 아래의 근육을 흉부 위로 접은 다음, 뭉툭한 끝의 포셉을 사용하여 췌장 체부와 비장을 조심스럽게 노출시킵니다. 이제 레이저 도플러 장치의 제어 소프트웨어에서 새로운 측정 파일을 생성하고 연결된 모니터를 설정하십시오.

일반(general) 탭에서 모니터링 기간을 프리런(free run)으로 설정하고, LDF 모니터 탭은 공장 기본값을 사용하십시오. 다음으로, 디스플레이 설정 대화 상자를 열고 적절한 채널을 선택하십시오. 그런 다음 채널 및 레이블의 데이터 소스, 단위, 색상 매개변수를 전환한 후 다음(next)을 클릭하십시오.

다음으로, 파일 정보 대화 상자에 피험자와 측정에 관한 식별 정보를 입력하고 다시 다음을 클릭하여 진행합니다. 이제 설정이 완료되었으며 측정 창이 나타납니다. 이어서, 전극을 췌장 1mm 이내까지 수동으로 전진시킵니다.

측정의 정확도는 프로브와 췌도 조직 사이의 거리에 따라 달라집니다. 조직과 프로브 사이에 1 mm 간격을 세심하게 유지하지 않으면 혈류 측정값이 부정확해질 수 있습니다. 기록을 시작하려면 시작 아이콘을 클릭하십시오. 그러면 미세혈관 혈류 PU 데이터가 저장되기 시작합니다.

이 과정을 1분 동안 수행하며, 기록 중에 표시되는 효과를 조절하기 위해 디스플레이 압축 및 확장 버튼과 그래프 트레이스 높이 증가 또는 감소 버튼을 사용한 다음 기록을 중단하십시오. 그 후, 적절한 이름으로 파일을 저장하십시오. 이제, 가산 효과와 수축 및 이완 능력의 국소적 고갈을 방지하기 위해 프로브의 위치를 수동으로 다시 조정하십시오.

각 마우스의 췌장 내 무작위 지점 세 곳에서 PU 데이터를 수집합니다. 실험 도중 어느 시점에 비반사 플레이트에서 PU 데이터를 측정하여 기저 대조군 값을 확보합니다. 세 번의 측정을 마친 후, 3-0 봉합사로 근육층을 봉합하고 4-0 봉합사로 피부층을 봉합합니다.

이제 마우스가 깨끗한 홈 케이지로 옮겨질 준비가 될 때까지 회복 케이지에서 관찰하십시오. 일반적으로 췌도(pancreatic islet)의 미세혈관 상태는 주기적인 수축 및 이완 단계로 나타납니다. 이러한 전반적인 혈역학적 현상은 혈류 관류 패턴을 형성합니다.

레이저 도플러 장치를 사용하여 비당뇨병 및 당뇨병 쥐의 미세혈관 혈류 관류 분포 패턴을 보여주는 PU 데이터를 수집하였습니다. 그 결과는 완전히 달랐습니다. STZ로 유도된 당뇨병 쥐에서는 췌장 섬 미세혈관 혈관운동의 수축과 이완 리듬이 혼란스럽고 불규칙했던 반면, 비당뇨병 대조군에서는 리듬감 있는 진동이 나타났습니다.

다음으로, PU 프로파일을 사용하여 혈관운동을 정량화했습니다. 대조군과 비교하여, STZ로 유도된 당뇨병 쥐의 췌도 미세순환 평균 혈류 관류는 감소했습니다. 또한, 이 쥐들은 혈관운동의 진폭과 빈도가 유의하게 감소했으며, 췌도로 향하는 혈류 관류의 상대적 속도 또한 감소한 것으로 나타났습니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 프로브와 췌장 조직 사이의 거리가 1mm 이내인지 확인하는 것이 중요합니다. 거리가 부적절하면 혈류 측정값이 인위적으로 증가하거나 감소하여 나타납니다.

이 절차에 이어, 허혈 시각화, 혈류 평가, 미세혈관 혈관 운동의 기능적 상태 평가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 레이저 스펙클 및 산소 전이와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 내분비학 및 대사 분야의 연구자와 임상의가 췌도 관련 질환 뒤에 숨겨진 미세순환 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 레이저 장비를 사용하는 것은 방사선 노출로 인해 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 주변 환경이 눈에서 최소 200 millimeter 떨어져 있어야 하는 등의 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.