Name: 높은 지방 다이어트 먹이 초파리 Melanogaster 의 높은 처리량 Triacylglyceride 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster에서 고지방 다이어트로 비만을 유도하고 고처리량 triacylglyceride 분석으로 지방 축적을 측정하는 방법입니다. 이 기술은 대사 질환 연구와 신속한 약물 발견에 활용됩니다.

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우리는 에리카 테일러가이 원고를 편집 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 부여는 건강의 국가 학회 (P01 HL098053, P01 AG033561 R01 HL054732) R.B., 박사 후 연구 보충 (R01 HL085481)와 친목 (AAUW)에서 S.B.D., 및 S.B.D.에는 미국 심장 협회에서 교부 금에 의해 투자 되었다 그리고 R.T.B.

1. 프로토콜을 먹이 HFD <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> 표 1. 비행 음식 레시피. 
이 표에서 우리의 제어 음식을 준비 하는 데 사용 하는 다른 재료를 요약 합니다. 일단, 음식의 10 mL 작은 유리병에 부 어 냉각 이며, 장기 저장을 위한 4 ° C에 저장.
<ol><li>HFD 준비 <ol><li>높은 지방 식품의 1kg를 만들기 위해 미리 만든 정상 비행 음식의 700 g의 무게 (표 1 참조) 및 분석 균형을 사용 하 여 두 개의 별도 용기에 코코넛 오일의 300 g.</li>
		<li>는 내용을 완전히 용 해 될 때까지 각 컨테이너는 전자 레인지에서 개별적으로 열. 비행 음식 컨테이너에 코코넛 오일 붓으십시오. 기름은 비행 거리 음식으로 잘 혼합 때까지 털 다를 사용 하 여 저 어. 
		참고: 아무 음식이 나 기름 덩어리는 표시 되어야 합니다. 날 식품은 전자 레인지에 때, 음식을 혼합 끓는 방지를 1 분 간격으로 중지.</li>
		<li>다시 높은 지방 음식 무게. 총 중량 1kg (음식 + 코코넛 오일의 300 g 700 g) 미만의 경우 추가 물 (약 10ml) 난방 중 증발에 대 한 보상 하 고 다시을 무게 1 kg.</li>
		<li>부 어 잘 혼합된 약 10 mL 유리병 (유리병 볼륨의 약 25%) 당 높은 지방 음식. 다음으로, 투박한 파리를 방지 하기 위해 커버 &#39; 오염. 실 온에서 1 시간을 기다린 다음 4 주 스토리지에 대 한 4 ° C에 튜브까지 전송. 
		참고: 일반 음식 (NF) 제어 음식으로 사용 됩니다. 또한 유리병 당 NF의 10 mL (유리병 볼륨의 약 25%)를 붓는 다. HFD 음식에 대 한 NF의 30%를 코코넛 오일 바꿉니다. 제어 및 실험 조건, 파리 NF와 HFD (10 mL 유리병 당 음식의)의 동일한 금액을 부여 했다.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> 그림 1 . 초파리 먹이 HFD. 
체계는 (와 코코넛 오일의 추가) 제어 식품 (코코넛 오일-NF의 추가 없이 일반 다이어트) 또는 HFD 파리에 대 한 다른 먹이 단계를 보여 줍니다. 전체 과정 초기 성인 파리 컬렉션 후 10 일 소요 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="2"> <li>HFD D. melanogaster의 먹이 참고:이 프로토콜 제어 음식과 HFD 먹이 어떤 비행 라인와 호환 되는 절차를 포함. 제어 및 실험 파리 같은 금액 음식 NF (HFD)를 포함 하는 튜브에 배치 됩니다.
	<ol><li>파리 anesthetize를 사용 하 여 CO 2. 
		참고: 새로운 일에 대 한 읽기를 참조 하십시오 모금에 D. melanogaster 처리에 대 한 21.</li>
		<li>0-5를 수집 튜브 및 (튀기)에 의해 전송에서 하루 오래 된 파리 NF (실 온에서 이전 예 열)를 포함 하는 새로운 튜브에 파리. 21 5 추가 일에 대 한 파리 시대 하자 ° c.</li>
		<li>5 일의 끝에, 4에서 HFD와 NF를 포함 된 튜브에 밖으로 ° c. 
		참고: 찬 온도, 파리 생활 스트레스 수로 튜브를 사용 하기 전에 따뜻하게 실 온에서 30 분 동안 앉아 보자.</li>
		<li>물티슈를 사용 하 여, 깨끗 하 고 튜브의 측면에서 과잉 액체를 제거.</li>
		<li>에 대 한 필터 종이의 작은 조각을 삽입 1 cm x 3 cm, 어떤 과잉 액체를 흡수 하 고 지방 음식으로. 
		참고:이 단계는 파리 HFD 음식에 집착 하는 것을 방지 하는 것이 중요.</li>
		<li>그런 다음 전송 높은 지방 음식에 파리 (튀기). 5 일 동안 가로 그들 측에, (서 안) 21-22 ° C에서 튜브를 하다. 
		참고: 방지이 부분적으로 높은 지방 음식, 막대기 음식 및 다이를 파리를 일으키는 녹아 수로 높은 온도.</li>
		<li>후 5 일, (튀기)에 의해 전송 그들의 용기를 30 분 동안 비어 있도록 음식 없이 새로운 튜브에 NF를 HFD 파리. 다음으로, 무게는 파리를 진행. 
		참고:이 HFD 먹이 프로토콜에에서 중요 한 단계 중 하나는 잘 혼합된 HFD, 무료로 비행 음식이 나 압축 된 오일의 어떤 덩어리를 준비 하는. 균질 혼합 및 HFD 45-30 ° C에 냉각 하는 것이 좋습니다, 튜브에 붓는 고 4 ° C. 적절 한 나이에 음식을 저장 하기 전에 제어 및 실험 파리의 정합은 제어 영양 및 환경 조건 사전 뿐만 아니라 중요 한 HFD 먹이 하. 단계에서 먹이, 제어 및 실험 파리 제공 되어야 합니다 NF와 HFD의 동일한 금액. 결코 밀된 튜브 또는 병 (transgenerational 효과 피하기 위해)에서 파리를 수집 합니다. 항상 NF와 HFD 식이 제한이 나 다른 crowding 효과 피하기 위해 먹이 동안 유리병 당 최대 25 파리를 넣어. HFD는 30%의 코코넛 오일으로 구성 되어, 따라서 22 ° C의 위 온도 일으키는 기름진 음식에 다 막대기 파리 HFD 녹아 부분적으로 수 있습니다. HFD는에 파리를 놓기 전에 어떤 잔여 기름 제거 하는 음식에서 어떤 초과 액체를 흡수 하는 필터 종이 삽입 튜브 청소. HFD에 파리의 인큐베이션 기간 동안 튜브 파리에 대 한 지방 없는 수평 표면을 제공 하기 위해 그들의 측면에 누워 있다.</li>
	</ol></li> <li>파리 무게 <ol><li>각 유전자 형 및 성별 테스트를 사용 하 여 매우 민감한 규모 미리 레이블, 빈 1.7 mL 튜브 무게를 기록 하.</li>
		<li>비행 마 취 또는 CO 2를 사용 하 여 anesthetize의 동일한 유전자 형, 성별, 36 파리 수집 및 1.7 mL 튜브 무게 중 하나로 브러시로 상태를 먹이.</li>
		<li>같은 매우 민감한 규모와 파리를 포함 하는 튜브 무게.</li>
		<li>결정이 수식에 따라 평균 비행 무게: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> 참고:이 프로토콜에서 파리의 수는 36.</li>
		<li>플래시 동결 1.7 mL 튜브 2 분 수집에 대 한 액체 질소에 폭락에 의해 파리를 포함 하 고 상자에 튜브를 넣어. 그런 다음 전송 상자-80 ° C (바람직 온도)를 스토리지에 대 한 태그 분석 결과 함께 사용 될 때까지. 
		주의: 매우 낮은 온도에서 액체 질소가 이다. 적절 한 개인 보호 장비를 사용 하십시오.</li>
	</ol></li></ol> 2. 태그 분석 결과 <ol><li>태그 표준 농도의 준비 <ol><li>PBT의 500 mL를 준비 (PBS 1 X 0.05% 트리톤).</li>
		<li>사용 0.5 mL 튜브와 태그 솔루션 (자료 테이블), 준비의 공백 (PBT만) 100 µ L (2 µ g / µ L, 1 µ g / µ L, 0.5 µ g / µ L, 0.25 µ µ g/L는; 6 표준 태그 농도의 100 µ L 0.125 µ µ g/l는; 0.0625 µ µ g/L는)는 PBT와.</li>
		<li>얼음에 튜브를 놓고 파리를 연 삭 진행.</li>
	</ol></li> <li>파리를 연 삭 <ol><li>-80 ° C (1.3 단계)에서 냉동된 파리를 꺼내. 얼음에 파리를 포함 하는 튜브를 전송</li>
		<li>첫째, 96-잘 볼 디스펜서로 분쇄 볼 2mm 금속, 작은 붓을 사용 하 여 추가 공 제거.</li>
		금속 알갱이 접시에 직접 전송 공 디스펜서와 플립 위에 거꾸로 <li>장소 96 잘 연마 플레이트. 잘 당 한 공 이어야 한다.</li>
		<li>PBT의 600 µ L 96 잘 연마 플레이트의 각 행에 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여.</li>
		<li>집게, 추가 3 당 잘 난다. 파리 각 행/96-잘이 격판덮개의 우물에서의 유전자 형, 성별 및 식품 상태를 나타냅니다.</li>
		<li>단단히 모자가 96 잘 접시에 놓습니다. 테이프는 누설을 상단에 배치 될 수 있습니다.</li>
		<li>제대로 연 삭 기계 연 삭 96 잘 접시를 놓습니다. 최고 속도와 프레스 기계를 설정 &#34; 실행 &#34;을 3 분에 대 한 파리</li>
		<li>후 3 분, 연 삭을 중지 하 고 격판덮개 원심 분리 진행: centrifu4000 x g, 4 ° c.에서 15 분 동안 ge 원심, 후 관리는 상쾌한 펠 릿 혼합 하지 않도록 신중 하 게 연 삭 접시.</li>
	</ol></li> <li>샘플 로드 및 태그 콘텐츠 결정 <ol><li>새로운 분 광 광도 계 96 잘 접시를 가져가 라. 접시의 각 행에 태그 시 약의 200 µ L 로드 다중 채널 피 펫을 사용 하 여.</li>
		<li>빈을 만들려면 첫 번째 행의 첫 번째 우물에 PBT의 부하 20 µ L. 아래로 pipetting으로 혼합. 거품 형성 방지.</li>
		<li>나머지에 (2.1.2 단계)에서 각 표준 희석의 부하 20 µ L 웰 스의 첫 번째 행과 아래로 pipetting으로 믹스. 거품 형성 방지.</li>
		<li>상쾌한의 20 µ L을 연 삭 플레이트의 각 행에서 분 광 광도 계 96 잘 접시에 해당 하는 행 전송 다중 채널 피 펫을 사용 하 여. 여기저기 잘 혼합 플라스틱. 거품 형성 방지.</li>
		<li>다음, 가스 투과성 호 96 잘 접시 위에 배치.</li>
		<li>품 어 10 분 동안 37 ° C에서 접시 
		참고: 우물에 거품 경우 원심에서 모든 거품을 제거 하려면 2000 x g 2 분 접시. 거품의 존재는 흡 광도 읽기에 방해가 됩니다.</li>
		<li>읽기 550 플레이트의 각의 흡 광도 nm 호환 microplate 리더를 사용 하 여. 다음, 표준 곡선을 추적 하 고 알 수 없는 샘플의 농도 [µ g / µ L] 결정.</li>
		<li>태그 콘텐츠 당 평균 비행 중량의 양을 결정 하는 다음 수식을 사용 하 여: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> 참고:이 프로토콜 3 파리의 PBT 600 µ L에 다진 했다; 결과, 비행 당 평균 볼륨 200 µ L.</li>
	</ol></li> <li>Bradford 분석 실험 그리고 단백질 콘텐츠 태그 콘텐츠의 정규화 <ol><li>7을 준비 하는 것은 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 표준 희석의 100 µ L (75 µ g/mL, 100 µ g/mL, 150 µ g/mL, 200 µ g/mL; 250 µ g/mL; 500 µ g/mL; 1000 µ g/mL)는 PBT와.</li>
		<li>새 96 잘 접시 하 고 접시의 각 행에 1 X Bradford 시의 200 µ L 로드.</li>
		<li>에 첫 번째 행의 첫 번째 잘 만들 빈 PBT의 10 µ L를 추가. 아래로 pipetting으로 혼합. 거품 형성 방지.</li>
		<li>나머지에 각 표준 희석의 추가 10 µ L 웰 스의 첫 번째 행과 아래로 pipetting으로 믹스. 거품 형성 방지.</li>
		<li>96 잘 접시에 해당 하는 행에 연마 플레이트의 각 행에서의 표면에 뜨는 10 µ L을 전송 다중 채널 피 펫을 사용 하 여. 여기저기 잘 혼합 플라스틱. 거품 형성 방지.</li>
		<li>96 잘 접시 위에 가스 투과성 호 장소.</li>
		<li>품 5 분 동안 실내 온도에 격판덮개. 우물에 거품 경우 원심에서 그들을 제거 하려면 2000 x g 2 분 접시. 
		참고: 거품의 존재는 흡 광도 읽기에 방해가 됩니다.</li>
		<li>읽기 빈의 흡 광도, 표준, 595에서 알 수 없는 샘플을 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm. 표준 곡선을 사용 하 여 각 행에 있는 샘플의 농도 [µ g / µ L] 결정.</li>
		<li>정상화 단백질 수준 다음 수식을 사용 하 여 콘텐츠 태그: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

생쥐에서 비만 유도 개월19,20걸릴 수 있습니다. 파리에서 프로토콜을 먹이이 HFD 과잉 지방 축적의 문제에 일의 또는 더 적은, 18 h ( 그림 2참조) 후 지방 축적 증가 일으키는 유도 수 있습니다. HFD 설명 프로토콜 먹이 포도 당 콘텐츠 12 증가 하 고 Bmm lipase와 PGC-1 식24감소. 이것은 지방 질 및 포도 당 내용25,26 모두 증가 Bmm 식24빠른 감소 되도록 성인 초파리 의 금식과 달리. 또한, Bmm 또는 PGC-1 레벨을 올...

우리는 비만, 및 그것의 관련된 경제적 부담이는 세계적인 문제1시간 에입니다. 매 3 미국인 중 2 개는 체중 또는 비만 관련된 심장 병 리, 성인 인구2내에서 죽음의 주요 원인으로. 새로운 효율적인 방법은 적절 하 게 구성 요소 유전 및 분자 모형 유기 체를 사용 하 여 변화 증후군의 규칙에 연루 조사 필요 합니다. 이러한 이유로, 우리 과일 파리 초파리 모델 생쥐와 인간3,4,,56을 포함 한 포유류와 함께 가장 기본적인 생물 학적 프로세스를 공유 하기 때문에 선택 합니다. 초파리의 게놈은 높게 진화 하는 동안 보존 하지만 전반적으로 훨씬 더 작은 적은 유전자 복제와 대사 복잡성,4 많은 인간 질병 내포 하는 근본적인 메커니즘을 이해 하기에 적합 , 7 , 8. 또한, 특성 프로세스 지방 조직, 창 자에 의해 실시 하 고 췌 비행에 포도 당 및 지질 물질 대사에, 예를 들어 인간9, 와 유사한 규제 기능을 중재 10,11. 또한, 비만, 인슐린 저항 및 당뇨병 인간에서의 제어에 관련 된 기본적인 분자 경로 초파리 melanogaster12,,1314 보존 기능 , 15 , 16. 같은 더 높은 유기 체 초파리 는 포유류 심장3,17의 유사한 과정에 의해 개발 하는 동안 형성 되는 뛰는 심장. 따라서, 안정적인 HFD 프로토콜 및 높은 처리량 태그 분석 결과, 초파리의 유전 도구 상자를 사용 하 여 효율적인 심사 목적에 맞게 먹이의 개발 연구 하 고 근본적인 유전 기초를 이해 하는 중요 한 수단을 제공 기본 복잡 한 대사 질환입니다.
HFD 음식 자체 포화 지방산 대사 증후군18와 관련 된 것으로 알려진의 주로 구성 되는 코코넛 오일 보충 표준 실험실 비행 음식에서 이루어집니다. 귀하는 초파리 에서 프로토콜 먹이 되는 것을 효과적으로 그리고 reproducibly 우리의 최적화 HFD organismal 지방 함량의 문제에 증가 유도 비만 모델 포유류, 설치류, 개월19,20걸릴 수 있습니다, 일12,14. 이 프로토콜, 높은 처리량 태그 분석 결과와 함께에서 유전적 요인, 환경 영향과 새로운 변조기의 뚱뚱한 물질 대사를 마약 후보자의 효과 대 한 효율적인 대량 검사를 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 가능성이 결과 이해 및 비만 비만 관련 된 인간의 병 리 전투 관련.
먹이 프로토콜 다목적 이며 단일 포화 또는 불포화 지방산의 신진 대사와 기능 효과 연구에 적용할 수 있습니다. 이 높은 처리량 태그 분석 결과 사용 하 여 D. melanogaster에 국한 되지 않습니다 하지만 작은 모형 유기 체 표 피와 거친 세포 외 매트릭스 (예를 들어, 다른 초파리 종, C. 선 충의 다양 한 적응 수 있습니다. 다른 신흥 무척 추 동물 모형 유기 체) 개발, 성인 또는 변화 질병의 단계의 모든 단계에서 다른 환경, 유전적 또는 생리 적인 조건 하에서 지방 콘텐츠를 측정 하. 태그 분석 결과 무료 지방산, 글리세롤, 글리세롤 3 인산 염 그리고 마지막으로 H2O2 와 4-aminoantipyrine (4-AAP) 3, 5-반응으로 태그 저하 효소 반응의 일련의 색채 측정에 기반 dichloro-2-hydroxybenzene 된 (3, 5 DHBS) 96-잘 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 된 빨간 색된 제품을 생산 하

<table><tbody><tr><td>Talboys Ball dropper/bead Dispenser</td><td>Talboys</td><td>#: 930150</td><td></td></tr><tr><td>Talboys High Throughput Homogenizer</td><td>Talboys</td><td>#: 930145</td><td></td></tr><tr><td>그라인딩 볼, 스테인리스 스틸&nbsp;</td><td>OPS Diagnostics, LLC# GBSS</td> <td>156-5000-01</td><td>5000 볼</td></tr><tr><td>Masterblock 96 웰 딥 마이크로플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td># T-3058-1</td><td>케이스 80 플레이트;</td></tr><tr><td>96 웰 마이크로플레이트 플랫 바텀</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M4436</td><td>40 플레이트</td></tr><tr><td>Greiner CapMat 멀티웰 플레이트 밀봉</td>용 <td>Sigma Aldrich</td><td># C3606</td><td>50 밀봉 플레이트</td></tr><tr><td>시약 저장고& 주의;</td><td>Thomas Scientific</td><td># 1192T71</td><td>12/PK</td></tr><tr><td>Thermo Scientific 핀피펫 4661040</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661040</td><td>1-10 ul 멀티피펫</td></tr><tr><td>Thermo Scientific 핀피펫 4661070</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661070</td><td>30-300ul 멀티피펫</td></tr><tr><td>Thermo Scientific 핀피펫 4661020</td><td>Thermo Scientific</td><td>#4661020</td><td>10-100ul 멀티피펫</td></tr><tr><td>멀티채널 팁</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3131-S</td><td>10 uL 피펫</td></tr><tr><td>다채널 팁</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3133-S</td><td>200 uL 피펫</td></tr><tr><td>다채널 팁</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>#P1125</td><td>100 uL 피펫</td></tr><tr><td>집게&nbsp;</td><td>Roboz Surgical</td><td># 5 Dumonts</td><td>초미세 집게</td></tr><tr><td>Mettler Toledo Excellence XS 분석 저울 Mfr# XS64</td><td>Cole-Parmer 과학 전문가</td><td># EW-11333-00</td><td></td></tr><tr><td>Metler Toledo Excellence XS 탑로딩 저울</td><td>Cole-Parmer 과학 전문가</td><td># EW-11333-49</td><td></td></tr><tr><td>96-Well microplate 원심분리기</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td># Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Microplate 리더</td><td>분자 장치</td><td># SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td><td>Biostad</td><td># 3527</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides 시약</td><td>Thermo Scientific</td><td># TR22421</td><td></td></tr><tr><td>트리글리세리드 표준</td><td>Stanbio</td><td>#2103 - 030</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay</td><td>Bio-RAD</td><td># 500-0205</td><td>1x 염료 시약</td></tr><tr><td>코코넛 오일</td><td>Nutiva</td><td># 692752200014</td><td>15 0z jar</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Thermo Scientific</td><td># AM9625</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>가스 투과성 호일</td><td>Macherey-Nagel</td><td># 740675</td><td>50개</td></tr><tr><td>필터 종이</td><td>VWR</td><td># 28317-241</td><td>100</td></tr>개의 <tr><td>초파리 바이알</td> <td>팩Genesee Scientific</td><td>Cat #: 32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>퀵 스타트 소 혈청 알부민 표준</td><td>Bio-Rad</td><td># 5000206</td><td></td></tr><tr><td>FlyNap 마취</td><td>캐롤라이나</td><td># 173025</td><td>100mL</td></tr><tr><td>Kimwipes Low-Lint</td><td>Uline</td><td># S-8115</td><td>1-Ply, 4.4 x 8.4"</td></tr></tbody></table>

높은 지방 다이어트 먹이 초파리 melanogaster 의 높은 처리량 triacylglyceride 분석 결과

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

심장 질환은 인간의 죽음은 전세계의 번호 하나 원인이 다. 수많은 연구 비만 심장 기능 상실 사이 강한 연결 인간, 하지만 더 많은 도구 및 연구 노력 하는 데 필요한 더 관련 된 메커니즘을 명료 하 게. 세기 동안, 초파리 의 유전자 매우 온순한 모델이 되었습니다 핵심 유전자 및 분자 경로 매우 종에 걸쳐 보존 될 입증의 발견에. 많은 생물학 과정 및 질병 메커니즘 기능 개발 (예를 들어, 몸 계획, 심장), 암, 신경 질환 등 즉석에서 보존 하 고. 최근, 비만 심장 질환 모형 유기 체에서와 같은 보조 병 리의 연구는 인간의 신진 대사 증후군에 관련 된 주요 레 귤 레이 터의 식별에 매우 중요 한 역할을 했다.
여기, 우리는 비만, 즉, 과도 한 지방 축적을 유발 하 고 태그 축적의 형태로 지방 콘텐츠를 모니터링 하는 효율적인 프로토콜을 개발 하는 효율적인 도구로이 모델 유기 체를 사용 하 여 제안 합니다. 높은 보존 뿐만 아니라, 하지만 덜 복잡 한 게놈 비행 또한 빠른 실험, 비용 효율성과 결합에 대 한 짧은 수명이 있다. 높은 지방 다이어트 (HFD) 비만 지방 콘텐츠에 높은 재현할 것을 목표로 관련된 증가 측정 하기 위한 높은 처리량 triacylglyceride (태그) 분석 결과 유도 하기 위해 초파리 에서 먹이 기를 위한 상세한 프로토콜을 제공 하는이 종이 대규모 유전자 또는 화학 심사에 대 한 효율적인. 효율적으로 규제 메커니즘 비만에 참여 조사 뿐 아니라 신약 개발에 약물의 효과의 빠른 테스트를 위해 발견에 대 한 표준화 된 플랫폼을 제공 하는 새로운 기회를 제공 하는 이러한 프로토콜 또는 비만, 당뇨병 및 대사 관련된 질환의 예방.

D. melanogaster, 다른 종족과 경우는 성적인이 형태 성 남성 및 여성22사이. 그것은 잘 알려진 여성은 남성22보다 그들의 인체에 더 많은 지방, 더 큰입니다. 우리의 프로토콜의 효율성을 테스트 하려면 우리 차이 태그 콘텐츠 남성과 여성 표준 실험실 wildtype (w1118)의 파리 확인 하려면 태그 분석을 수행 합니다. 데이터는 여성의 그들의 남성 대조 물 (그림 2A, B) 보다 더 몸 전체 지방을 보여줍니다. 데이터는 또한 분석 결과 안정, 시간이 지남에 태그 정량화에 아무 변화를 보여주었다 (부 화 후 최대 50 분)와 아무 생물학 견본 크기 (3 또는 5 파리)에 따라.
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이것은 높은 지방 다이어트를 먹이 초파리, 이해 기본적인 분자 메커니즘 lipotoxicity에 연루에 대 한 모델에서에서 비만 유발 하는 프로토콜 이다. 초파리 와 다양 한 식이, 환경, 유전적 또는 생리 적인 조건 하에서 (곤충) 잠재적으로 다른 모델에 지방 축적을 측정 하기 위한 높은 처리량 triacylglyceride 분석 결과를 제공 합니다.

높은 지방 다이어트 먹이 초파리 Melanogaster 의 높은 처리량 Triacylglyceride 분석 결과

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

본 고지방 식이 프로토콜 및 고처리량 트리아실글리세롤 분석의 전반적인 목적은 drosophila melanogaster와 같은 모델 생물에서 비만을 유도하고, 다양한 조건에서 그에 따른 지방 함량의 변화를 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 유기체 비만 및 대사 증후군인 당뇨병, 간 및 심장 지방증과 관련된 장기 특이적 지질독성을 포함하여 대사 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 drosophila에서 과도한 지방 축적을 며칠 만에 유도할 수 있으며, 약 1시간 만에 지방 함량을 동시에 측정할 수 있다는 점입니다.이 기술의 함의는 대사 질환의 진단 및 치료로 확장되며, 고처리량 프로토콜을 통해 이 모델 시스템을 이용한 신속한 약물 발견 연구가 가능해집니다. 실험을 시작하려면, 분석 저울을 사용하여 분석 저울을 사용하여 고지방 먹이 1kg을 준비하기 위해, 미리 제조된 파리 먹이 700g과 코코넛 오일 300g을 두 개의 별도 용기에 각각 담습니다. 각 용기를 전자레인지에 넣고 내용물이 완전히 녹을 때까지 개별적으로 가열합니다.녹인 코코넛 오일을 초파리 먹이 용기에 붓고, 오일이 먹이에 잘 섞일 때까지 거품기로 저어줍니다. 고지방 먹이의 무게를 다시 측정합니다. 전체 무게가 1kg 미만인 경우, 무게를 1kg으로 맞추기 위해 물 약 10mL를 추가합니다.다음으로, 잘 섞인 고지방 사료 10 milliliters를 각 바이알에 붓습니다. 오염을 방지하기 위해 치즈클로스로 사료를 덮고 실온에서 1시간 동안 식힙니다. 냉각 후, 바이알을 4 degrees Celsius로 옮겨 최대 4주 동안 보관합니다.CO2를 사용하여 파리를 마취시킵니다. 바이알에서 0~5일 된 파리를 수집하여, 미리 데워둔 일반 먹이(normal food) 또는 NF가 들어 있는 새 바이알로 옮깁니다. 파리를 21°C에서 5일 더 노화시킵니다. 5일이 지나면 4°C에 보관했던 고지방 식이(high fat diet) 또는 HFD 및 NF가 들어 있는 바이알을 꺼냅니다.초파리가 HFD 먹이에 달라붙는 것을 방지하기 위해 와이프를 사용하여 바이알 측면의 과도한 액체를 닦아내고 제거합니다. 약 1cm x 3cm 크기의 작은 필터 페이퍼 조각을 고지방 먹이에 삽입하여 남은 액체를 흡수하도록 합니다. 그다음, 초파리를 고지방 먹이 위로 옮깁니다.바이알을 21~22°C에서 5일 동안 수평으로 눕혀 둡니다. 5일 후, NF 및 HFD 군의 초파리를 먹이가 없는 새 바이알로 옮겨 30분 동안 장을 비우게 합니다. 그 다음 초파리의 무게를 측정합니다.테스트할 각 유전자형 및 성별에 대해 초정밀 저울을 사용하여 미리 라벨을 붙인 빈 1.7 milliliter 튜브의 무게를 기록합니다. 동일한 유전자형, 성별 및 섭식 상태를 가진 파리 36마리를 마취시킨 후 붓을 사용하여 미리 무게를 잰 1.7 milliliter 튜브 하나에 수집합니다. 그런 다음 동일한 초정밀 저울로 파리가 들어 있는 튜브의 무게를 측정합니다.초파리가 들어있는 1.7 milliliter 튜브를 액체 질소에 2분 동안 담가 급속 냉동시킵니다. 튜브를 수거하여 박스에 넣습니다. 그다음, TAG assay에 사용할 때까지 보관하기 위해 박스를 -80 °C 냉동고로 옮깁니다.먼저, -80°C 냉동고에서 냉동된 파리를 꺼내 튜브를 얼음 위에 둡니다. 2mm 금속 분쇄 볼을 96웰 볼 디스펜서에 넣고, 작은 붓을 사용하여 여분의 볼을 제거합니다. 다음으로, 96웰 분쇄 플레이트를 볼 디스펜서 위에 거꾸로 놓은 후, 이를 뒤집어 금속 볼을 분쇄 플레이트로 직접 옮깁니다.각 웰에 볼이 하나씩 들어 있는지 확인하십시오. 그런 다음, 멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 분쇄 플레이트의 각 행에 PBT 600 µL를 첨가합니다. 핀셋을 사용하여 웰당 세 마리의 초파리를 넣으십시오.96웰 분쇄 플레이트의 각 행 또는 웰에 초파리의 유전자형, 성별 및 먹이 조건을 표시하십시오. 96웰 분쇄 플레이트의 캡을 단단히 닫으십시오. 누출이 발생하지 않도록 상단에 테이프를 붙이십시오.96-웰 분쇄 플레이트를 분쇄기에 적절하게 배치합니다. 기기를 최고 속도로 설정하고, 작동 버튼을 눌러 파리를 3분 동안 분쇄합니다. 3분 후, 분쇄를 중단하고 원심분리를 진행합니다.원심분리 후, 상층액이 펠릿과 섞이지 않도록 분쇄 플레이트를 주의해서 다루십시오. 멀티채널 피펫을 사용하여 새로운 96웰 분광 광도계 플레이트의 각 행에 TAG 시약 200 µL를 분주합니다. 공시료(blank)를 만들기 위해 첫 번째 행의 첫 번째 웰에 PBT 20 µL를 분주합니다.피펫팅을 통해 위아래로 섞어줍니다. 첫 번째 행의 나머지 웰에 각 표준 희석액 20 microliters를 넣고, 피펫팅으로 위아래로 섞어줍니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 분쇄 플레이트의 각 행에서 상층액 20 microliters를 96웰 분광광도계 플레이트의 해당 행으로 옮깁니다.피펫팅하여 잘 섞어줍니다. 그 다음, 96-웰 플레이트 상단을 가스 투과성 호일로 덮습니다. 플레이트를 37 °C에서 10분 동안 배양합니다.호환 가능한 마이크로플레이트 리더를 사용하여 플레이트의 각 웰에 대한 흡광도를 550 nanometers에서 측정합니다. 표준 실험실 야생형 초파리를 대상으로 한 태그 분석 결과, 암컷이 수컷보다 전신 지방량이 더 많은 것으로 나타났습니다. 또한 데이터에 따르면, 해당 분석법은 태그 정량화에 있어 시간 경과에 따른 변동이 없으며 생물학적 시료 크기에 따른 변동도 없어 안정적인 것으로 확인되었습니다.고지방 식이(high fat diet, HFD)와 대조군 식이를 섭취한 암컷 초파리의 TAG 분석 결과, HFD 섭취가 초파리의 지방 함량을 증가시키며 시간이 지남에 따라 점진적으로 축적됨이 밝혀졌습니다. HFD를 18시간 동안 섭취한 것만으로도 초파리에서 지방 함량의 유의미한 증가가 유도되었습니다. 이 절차를 수행할 때, 고지방 식이 공급을 위해 깨끗하게 세척된 바이알을 사용하는 것이 중요합니다.초파리를 22°C 이하에서 보관하십시오. 또한 태그 분석 중 피펫팅을 할 때 상층액과 찌꺼기가 섞이지 않도록 주의하십시오. 이 기술은 개발 이후, 대사 및 관련 질환을 연구하는 연구자들이 영양 과잉의 영향과 지방 축적의 유전적 근거, 그리고 drosophila에서 나타나는 지질독성 심근병증과 같은 관련 장기 기능 장애를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오는 착색된 사료를 사용하여 먹이를 모니터링하고 첨가된 화합물이 먹이 활동에 미칠 수 있는 영향을 모니터링하는 초파리에 대한 먹이 분석을 설명합니다. 예시 프로토콜은 여러 내분비 교란 화학물질(EDC)의 효과를 테스트합니다.

수유 테스트: Drosophila melanogaster의 수유 선호도 평가

이 프로토콜은 단일 동물 해상도에서 Drosophila melanogaster의 산란 선호도를 테스트하기 위한 고처리량 분석을 설명합니다.  이 분석은 간단한 의사 결정 과정을 제어하는 유전자 및 회로 구성 요소를 식별할 수 있는 간단하고 효율적이며 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다.

높은 처리량 분석은 개인의 알을 낳는 환경 설정을 검사합니다<em&gt; 노랑 초파리</em

여기에서 우리는 세 번째 령 (L3) 초파리의 애벌레 단계에서 유기체 지방 수준을 측정하는 방법을 제시한다. 이 방법은 변경된 지방 저장과 애벌레를 구분하는 지방 조직의 비교적 낮은 밀도를 이용한다. 부력 기반의 분석은 신속하게 재현, 경제적 선별을위한 유용한 도구입니다.

지방 수준을 결정하는 부력 기반 방법<em&gt; 초파리</em

우리는 보람 유도 및 보상 상태의 변화에 대한 조치로 자발적인 에탄올 소비를 사용하여 초파리 (Drosophila의 melanogaster의) 경험을 nonrewarding위한 프로토콜을 설명합니다.

사용 보상 추구 행동의 변화를 측정하는 간단한 방법<em&gt; 노랑 초파리</em

CApillary FEeder (CAFE) 분석은 음식 섭취의 기저에 있는 메커니즘을 조사하기 위한 간단하고 예산 친화적이며 매우 신뢰할 수 있는 방법입니다. 다재다능한 유전자 모델 유기체인 Drosophila melanogaster와 함께 사용되는 이 제품은 음식 섭취의 조절 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 강력한 수단을 제공합니다.

모세관 공급 분석은 식품 섭취를 측정<em&gt; 노랑 초파리</em

염색 음식 양이 많은 음식 섭취 량 분석 제공 하는 강력한 고 높은 처리량 먹이 동기 평가를 의미 합니다. 결합 식품 소비 분석 결과 thermogenetic 및 optogenetic 스크린은 성인에서 식욕을 기본 신경 회로 조사 하는 강력한 접근 방식을 초파리 melanogaster.

양이 많은 음식 섭취 량 분석을 결합 하 고 강제로 초파리 에서 식욕을 공부 하는 뉴런을 활성화

TreadWheel 회전 모션을 사용 하 여 부드럽게 파리 타고 난, 부정적인 geotaxis을 이용 하 여 성인 초파리 melanogaster 에서 운동 유도. 대사 상태를 평가 하기 위해 운동 유전자, 섹스, 다이어트, 생리 및 분자 분석에 미치는 영향 등의 요소 사이의 상호 작용의 분석에 대 한 수 있습니다.

초파리 melanogaster 운동을 부드럽게 유도 위한 TreadWheel: 간격 훈련 프로토콜

여기에 설명된 프로토콜은 다른 다량 영양소 품질의 식단에 노출된 Drosophila 멜라노가스터 애벌레에 의해 정의된 시간 간격 내에 섭취되는 음식의 양을 정량화할 수 있도록 하는 프로토콜이다. 이 소는 신경 열유전학 스크린의 맥락에서 행해질 것입니다.

드로소필라 애벌레를 사용하여 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취의 정량화

우리는 파리에 대한 두 선택 먹이 분석에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 수유 분석은 빠르고 실행하기 쉬우며 소규모 실험실 연구뿐만 아니라 파리의 고처리량 행동 스크린에도 적합합니다.

드로소필라의 신속한 식품 선호 분석

마이크로 플레이트 피더 분석법은 Drosophila에서액체 음식 소비를 정량화하기 위한 경제적이고 높은 처리량 방법을 제공합니다. 3D 프린팅 장치는 파리가 트레이서 염료로 공급 용액을 소비하는 1536웰 마이크로 플레이트에 파리가 보관되는 96웰 마이크로 플레이트를 연결합니다. 용액 량 감소는 분광계로 측정됩니다.

드로소필라에서 소비의 정량화를 위한 높은 처리량 마이크로 플레이트 피더 분석

이 프로토콜은 액체 배지를 사용하여 성인 Drosophila melanogaster의 생존 가능성에 대한 화학 독성 물질의 영향을 평가하는 효율적이고 저렴한 방법을 설명합니다.

성인 Drosophila Melanogaster의 화학적 독성 평가

배우세요 Drosophila melanogaster에서 고지방 다이어트로 비만을 유도하고 고처리량 triacylglyceride 분석으로 지방 축적을 측정하는 방법입니다. 이 기술은 대사 질환 연구와 신속한 약물 발견에 활용됩니다.

높은 지방 다이어트 먹이 초파리 Melanogaster 의 높은 처리량 Triacylglyceride 분석 결과

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