Name: 단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 배우세요 수평 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용한 RNA-단백질 상호작용 분석 방법을. 전기영동 중 복합체 형성을 실시간으로 모니터링하여 RNA 생화학적 특성을 연구할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 수치를 준비한 Laura Vanderploeg에게 감사드립니다. Sheets 연구소의 연구는 NSF 보조금 1050395 및 NIH 보조금 (R21HD076828)에 의해 지원됩니다. Ryder 연구소의 연구는 NIH 보조금 R01GM117237 및 R01GM117008에서 지원됩니다. Megan Dowdle은 위스콘신 - 매디슨 대학 (University of Wisconsin-Madison) 대학원 및 생명 공학 교육 프로그램을 통해 National Institute of Health (T32GM008349)의 국립 종합 의학 연구소를 통해 SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship의 지원을받습니다.

1. 수평 네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔의 제조 4 . <ol><li> 필요한 재료 준비. <ol><li> 수평 겔 장치의 경우 27cm x 21cm 쟁반이있는 젤 상자 (37cm x 24cm)와 2 개의 24 웰 빗용 용량을 사용하십시오. 이 설정은 동시에 분석 할 수있는 총 48 개의 샘플을 제공합니다. </li><li> 40 % Acrylamide-Bis 19 : 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0), TEMED 및 10 % APS (ammonium persulfate) 시약을 준비하십시오. </li></ol></li><li> 10 % 천연 아크릴 아마이드 젤 생성. <ol><li> 500 mL 플라스크에 5 x TBE 80 mL, 40 % 아크릴 아미드 100 mL 및 물을 넣어 최종 부피 400 mL로 만든다. </li><li> 10 % APS 4 ML 및 TEMED 400 μL를 추가합니다. 잘 섞다. </li><li> 수평 주조 트레이에 혼합물을 붓고 겔을 30 분 동안 중합시킵니다. 젤의 두께는 약 2cm입니다. 참고 : 젤은 흄 후드에서 속도를 낼 수 있습니다.업 중합. 중합 반응 후 얇은 액체 층이 겔 위에 남습니다. </li><li> 액체를 털어 내고 흐르는 완충액으로 헹구십시오. 조심스럽게 빗 (들)을 제거하고 주사기를 사용하여 실행 버퍼로 우물을 씻어. </li></ol></li><li> 실행 버퍼 준비. <ol><li> 겔 상자에 1x TBE 러닝 버퍼 2 L를 준비하십시오. 5XTBE 400 mL를 1600 mL로 희석하여 혼합한다. 차가운 방에 1x TBE 버퍼를 식힌다. </li></ol></li><li> 젤 사전 가동 <ol><li> 2L의 차가운 완충액을 젤 박스에 넣고 젤을 넣으십시오. </li><li> 차가운 방에서 4 ° C에서 1 시간 120V에서 겔을 미리 실행하십시오. 이 시간 동안 결합 ​​반응을 준비하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 결합 반응 8 <ol><li> 2.1. 다음 반응물을 준비하십시오. 20 mM DTT 10 mM BSA 10 mM 효모 tRNA 5X 결합 완충액 (50 mM HEPES pH 8.0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0.2 % Tween-20) 상업적으로 구입 한 100 nM 형광 표지 RNA 농축 된 Bicaudal-C 단백질 DEPC 처리 된 H 2 O에서 50 % 글리세롤 DEPC 처리 된 H 2 O </li><li> RNase 무료 microcentrifuge 튜브에 바인딩 반응 구성 요소를 조립. <ol><li> 관에 10 mM BSA 5 μL, 20 mM DTT 5 μL, 10 mM 효모 tRNA 5 μL, 5x Binding Buffer 10 μL를 넣는다. </li></ol></li><li> 50 μL에서 250 nM의 최종 농도로 단백질을 첨가하십시오. 45 μL의 최종 부피에 물을 넣으십시오. </li><li> 형광으로 표지 된 RNA 기질 5 μL를 첨가한다. 상업적으로 구입 한 3 &#39;fluorescein으로 표지 된 32 개 뉴클레오타이드 기질을 사용하십시오. </li><li> 혼합하고 암실에서 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한다. </li></ol> 3. 네이티브 수평 폴리 아크릴 아미드 젤의 샘플 분석 <ol><li> 각 반응에 15 %의 50 % 글리세롤을 넣고 부드럽게 섞는다. </li><li> Carefu각 반응 30 μL를 젤에 첨가하십시오. 단일 웰에 적재 할 수있는 시료의 양은 겔의 두께와 웰의 크기에 따라 다릅니다. 우리는 24-well 빗으로 생성 된 겔의 단일 웰에 15 μL와 45 μL의 부피를 적재하고 2 cm 두께로 쏟아 붓습니다. </li><li> 전원 공급 장치를 젤 장치 스위치에 연결 한 후 전압을 조정하십시오. 120 V에서 4 ° C에서 젤을 실행하십시오. 참고 : 수평 겔 장치의 경우, 이는 약 5V / cm가됩니다. 수직 형 겔 장치의 경우, 이것은 16V / cm이다. <ol><li> 형광 표지 RNA의 손상이나 표백을 방지하려면 어둠 속에서 전기 영동을하십시오. </li><li> 분석되는 RNA- 단백질 복합체의 특성에 따라 전기 영동 시간이 달라질 수 있습니다. 참고 : 수평 EMSA 분석의 가장 큰 장점은 전기 영동을 멈추고 젤 이미지를 찍은 다음 gel은 장치에 다시 놓일 수 있고 전기 영동은 더 오랜 시간 동안 계속 될 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 이미징 젤 <ol><li> 형광 물질 검출 및 이미징을 위해 설계된 모든 장비로 분석을 수행하십시오. </li><li> 이미 저에 젤을 올려 놓습니다. </li><li> 이미 저 설정을 조정하십시오. fluorescein-labeled RNA ligand의 경우, FAM (파장 473 nm), 750 Photomultiplier voltage (PMT), 100 μm 픽셀 크기의 세팅을 사용하십시오. </li><li> 젤을 스캔하여 이미지를 캡처하십시오. </li></ol>

<ol><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li>
<li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li>
<li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li>
<li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li>
<li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386(2012).</li>
<li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li>
<li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
<li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li>
<li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

네이티브 폴리 아크릴 아마이드 젤은 단백질 -RNA 상호 작용을 조사하는 데 매우 중요한 도구이며 전통적으로이 젤은 수직으로 전기 영동됩니다 2 , 3 . 우리는 생성 된 전기 폴리 아크릴 아마이드 젤을 대체하여 1 , 4 , 6 , 7 , 15로 전기 영동 한 프로토콜을 수정했습니다. 형광으로 표지 된 RNA 기질과 함께 사용 된 이러한 변화는 단백질 -RNA 결합 상호 작용의 생화학 적 분석에 많은 이점을 제공합니다. 이러한 장점은 다음을 포함합니다 : 버퍼를 하부 챔버에서 상부로 이송하는 펌프를 필요로하는 수직 장치와 비교하여 완...

Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs)는 특정 단백질 - 핵산 상호 작용을 분석하는 귀중한 생화학 도구임이 입증되었습니다 1 , 2 , 3 . 이 분석법은 핵산 - 단백질 복합체 1 의 구성 화학 양롞 인 RNA 또는 DNA 3 에 대한 단백질의 결합 친 화성에 관한 중요한 정보를 제공하며 기질 경쟁 실험 1을 통해 RNA 결합 단백질의 결합 특이성에 대한 중요한 새로운 통찰력을 제공합니다 1 . 이 assays에 대한 전통적인 실험 설정은 정제 단백질과 방사성 표지 RNA 기판을 혼합하는 것으로 구성됩니다. 얻어진 복합체는 다음과 비 변성 분석 (네이티브) 폴리 아크릴 아미드 겔은 수직 장치 (3)에 시료 전기 영동 개의 유리판 사이에 붓고. 이 접근법은 핵산에 대한 단백질 결합의 기초가되는 생화학 적 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하기 위해 철저하게 사용되었지만 몇 가지 한계점이 있습니다. 예를 들어,이 기본 전략은 상대적으로 처리량이 낮으며 여러 바인딩 반응을 병렬로 분석해야하는 응용 프로그램에는 쉽게 적용 할 수 없습니다. 또한 전통적인 수직 장치의 경우 전기 영동 중 여러 번 복합체를 모니터링하는 것이 어렵습니다 3 , 4 . 여기에서는 평판 장치, 수평 전기 영동 및 형광 표지 된 RNA 기질 4 , 5 , 6 , 7에 주조 된 천연 폴리 아크릴 아미드 겔을 사용하는 EMSA 분석의 적용을 제시합니다. 기본 스트레인에 대한 이러한 비교적 간단한 변형의 결합tegy는 몇 가지 강력한 이점을 제공합니다. 특히 수평 플랫 베드 형식은 수십 개의 샘플을 동시에 분석하는 데 적합합니다 4 . 또한, Bicaudal-C 단백질과 RNA 기판 사이에 형성된 RNA- 단백질 복합체 (예 : 수평 겔에서 전기 영동)는 서로 다른 RNA- 단백질 복합체를 분해하고 이들을 미 결합 RNA 기질과 구별하는 능력이 향상되었습니다.

<table><tbody><tr><td>수평 젤 상자</td><td>올빼미</td><td>N/A</td><td>제품이 더 이상 만들어지지 않았습니다. 유사한 젤 상자는 Thermo Scientific의 A 시리즈 젤 상자에서 찾을 수 있습니다. 카탈로그 번호: A2-BP</td></tr><tr><td>24-well large large horizontal gel electrophoresis combs</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>제품이 더 이상 생산되지 않습니다. 유사한 젤 상자는 Thermo Scientific의 A 시리즈 젤 상자 빗에서 찾을 수 있습니다. 카탈로그 번호: A2-24C</td></tr><tr><td>Powerpac 300</td><td>Bio-Rad</td><td>1655050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean II 전기영동 세포</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2940</td><td></td></tr><tr><td>InstaPAGE-19 40% 19:1 아크릴아미드/비스</td><td>IBI</td><td>IB70015</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>IBI</td><td>IB70120</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>IBI</td><td>IB70080</td><td></td></tr><tr><td>효모 tRNA</td><td>Ambion</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 라벨링 RNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>주문은 길이와 원하는 순서로 맞춤 제작할 수 있습니다</td></tr><tr><td>EDTA 테트라소듐 염 수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>E5391-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스 초순수</td><td>US Biological</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>시그마-알드리치</td><td>1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>시그마-알드리치</td><td>3483 12 3</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 -rna 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용의 생화학 적 분석에 광범위하게 사용 되어온 분자 생물학의 기본 도구입니다. 이러한 상호 작용은 전통적으로 두 개의 유리판 사이에 생성 된 폴리 아크릴 아미드 젤과 수직으로 전기 영동 된 샘플로 분석되었습니다. 그러나, 폴리 아크릴 아미드 겔은 트레이에 캐스팅되고 수평으로 전기 영동 됨으로써 여러 이점을 제공합니다. 예를 들어, 형광 RNA 기질과 특정 단백질 사이의 복합체를 분석하는 데 사용되는 수평 젤은 전기 영동이 진행됨에 따라 여러 번 이미지화 될 수 있습니다. 이것은 실험 중 여러 지점에서 RNA- 단백질 복합체를 모니터 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 또한, 수평 겔 전기 영동으로 많은 샘플을 동시에 분석 할 수 있습니다. 이것은 시간 경과 실험을 용이하게 할뿐만 아니라 여러 반응을 동시에 분석하여 여러 구성 요소와 조건을 비교할 수 있습니다. 여기에 우리가 홍보RNA-Protein 상호 작용을 분석하기 위해 수평 고유 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

수평 네이티브 겔 전기 영동의 능력과 다양성을 입증하기 위해 우리는 Bicc1 결합 부위를 포함하는 형광 표지 된 RNA에 Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) 단백질의 결합을 분석했습니다. Bicc1 단백질 mRNA의 특정 리프레 병진 동물 개발 9, 10, 11, 12의 모체 단계뿐만 아니라 성인 13, 14의 특정 기관의 기능 중 세포 운명 결정을 제어하는 기능을한다. 제노 우리의 작업은 Bicc1 단백질 8 제 결합 부위를 식별 : 32 뉴클레오티...

네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용을 분석하기위한 기본적인 도구입니다. 전통적으로 대부분의 실험에서는 수직 겔을 사용했습니다. 그러나, 수평 겔은 전기 영동 중에 복합체를 모니터링 할 수있는 기회와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 우리는 수평 네이티브 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

본 프로토콜의 전반적인 목적은 수평 네이티브 겔 전기영동을 이용하여 RNA-단백질 상호작용을 분석하는 것입니다. 이 방법은 특정 RNA-단백질 상호작용의 특성을 정의하는 것과 같이 RNA 생화학의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전기영동 과정 동안 복합체 형성을 여러 번 모니터링할 수 있다는 점입니다.수평 젤 장치의 경우, 27 centimeter x 21 centimeter 크기의 캐스팅 트레이와 24 well 콤 2개를 수용할 수 있는 젤 박스를 사용하십시오. 이 구성을 통해 총 48개의 시료를 동시에 분석할 수 있습니다. 5x TBE 400 milliliters를 물 1,600 milliliters로 희석하고 혼합하여 1x TBE 전기영동 버퍼 2 liters를 준비하십시오.TBE 버퍼를 냉장실에 넣어 냉각시킵니다. 표준 절차에 따라 40% acrylamide (19:1 비율 권장), 5x TBE, temed 및 10% ammonium per sulfate 시약을 준비합니다. 10% native acrylamide 겔을 제조하려면, 500 milliliter 플라스크에 80 milliliters의 5x TBE, 100 milliliters의 40% acrylamide를 넣고 최종 부피가 400 milliliters가 되도록 물을 추가합니다.10% ammonium per sulfate 4 mL와 TEMED 400 µL를 넣고 잘 섞습니다. 혼합액을 수평 캐스팅 트레이에 붓고 흄 후드 내에서 30분 동안 젤을 중합시킵니다. 중합된 젤의 두께는 약 2 cm가 되며, 젤 상단에 얇은 액체 층이 남게 됩니다.겔을 겔 박스에 넣고 저온실로 옮깁니다. 다음으로, 액체를 따라내고 러닝 버퍼로 헹굽니다. 콤을 조심스럽게 제거하고, 겔 박스에 차가운 러닝 버퍼 2L를 채운 후 주사기를 사용하여 웰을 러닝 버퍼로 헹굽니다.저온실에서 4 °C, 120 V로 1시간 동안 겔을 사전 전기영동합니다. 겔이 사전 전기영동되는 동안 결합 반응액을 준비합니다. RNA-free 마이크로원심분리 튜브 각각에 다음의 결합 반응 성분을 순서대로 첨가합니다: 10 mM BSA 5 µL, 20 mM DTT 5 µL, 10 mM 효모 tRNAs 5 µL, 5x 결합 버퍼 10 µL, 최종 농도가 250 nM이 되도록 50 µL 내에 bicaudal-c 단백질을 첨가, 최종 부피가 45 µL가 되도록 DEPC 처리된 물을 첨가, 그리고 형광 표지된 RNA 기질 5 µL를 첨가합니다.튜브 뚜껑을 닫고 가볍게 튕겨 섞어준 뒤, 튜브를 짧게 원심 분리하고 실온의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 결합 반응이 완료되면 각 반응액에 50% glycerol 15 µL를 첨가하고 가볍게 섞습니다. 각 반응액 30 µL를 겔 웰에 조심스럽게 로딩하며, 단일 웰에 로딩할 수 있는 시료의 양은 겔의 두께와 웰의 크기에 따라 달라집니다.겔 장치에 전원 공급 장치를 연결하고 전원을 켠 다음, 전압을 120 volts로 조정하고 4 °C에서 겔을 전기영동합니다. 형광 표지된 RNA의 손상이나 퇴색을 방지하기 위해 전기영동은 암실에서 수행하십시오. 전기영동 시간은 분석하려는 RNA-단백질 복합체의 특성에 따라 달라집니다.수평 전기영동 이동도 변화 분석(electrophoretic mobility shift assay)의 주요 장점은 전기영동 실행이 완료되기 전에 겔 이미지에서 전기영동을 중단할 수 있다는 점입니다. 형광 기질 검출용으로 설계된 모든 기기로 분석을 수행하십시오. 형광 표지 리간드의 경우, 이미저 설정을 다음과 같이 조정하십시오.플루오레세인 파장 473 nanometers, 광전증배관 전압 750 volts 및 픽셀 크기 100 micrometers로 설정합니다. 젤을 스캔하여 이미지를 캡처합니다. 이미징 후, 젤을 다시 장치에 넣고 전기영동을 더 오랜 시간 동안 계속 진행할 수 있습니다.Bicc1 결합 부위를 포함하는 형광 표지된 Cripto1 mRNA에 제노푸스 bicaudal-C 또는 Bicc1 단백질이 결합하는 것을 수직 및 수평 네이티브 젤 전기영동으로 분석하였으며, 음성 대조군으로서 Bicc1을 CyclinB1 mRNA 유래 형광 표지 RNA와 혼합하였습니다. 두 방법 모두에서 Bicc1이 Cripto1 RNA에 결합하여 특이적 복합체를 형성함이 분명하게 나타났습니다. 하지만 Bicc1-Cripto1 복합체는 수평 젤로 분석했을 때 훨씬 더 뚜렷하게 구분되어 검출이 용이했으며, 단백질-RNA 복합체와 결합하지 않은 RNA를 변별할 수 있었습니다.이미징 후, 겔을 다시 겔 장치에 넣고 3시간 30분 동안 추가로 전기영동을 수행한 뒤 다시 이미징하였습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 복합체들이 더 멀리 이동하였음에도 여전히 쉽게 검출되었으며, 이는 복합체들의 안정성을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하여 적절하게 수행한다면 4~5시간 내에 완료할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 수평 네이티브 겔 전기영동을 이용하여 RNA-단백질 상호작용을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

horizontal-gel-electrophoresis-for-enhanced-detection-protein-rna

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

출처: Stenum, T. S. 외 대장균에서 전이 RNA의 풍부도와 충전 수준 정량화. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 젤 전기영동과 북부 블롯팅을 사용하여 대 장균 내 전이 RNA의 충전 수준을 아미노아실화 및 탈아실화 형태를 분리하여 검출하고 비교하는 방법을 시연합니다.

젤 전기영동과 북부 블롯팅을 통해 대장균에서 tRNA 충전 수준을 검출합니다

이 비디오는 단백질에 대한 변성 폴리아크릴아미드 기반 분리 기술을 보여줍니다. 이 기술은 분자량에 따라 단백질을 예비 식별하는 데 도움이 됩니다.

단백질 분석을 위한 Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel 전기영동: 분자량에 따라 단백질을 분리하고 시각화하는 기술

이 비디오에서는 인간 비기능성 뇌하수체 선종(NFPA)의 종양 조직에서 얻은 복잡한 단백질 혼합물에서 개별 단백질을 분리하는 2차원 겔 전기영동 방법을 보여줍니다. 단백질은 1차원에서 전하를 기준으로 분리되고 2차원에서 분자량에 따라 추가로 분리됩니다.

2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 전하와 분자량에 근거를 둔 복잡한 단백질 혼합물에 있는 단백질의 분석을 위한 별거 기술

이 비디오에서는 적외선 형광 표지 DNA 프로브를 사용하여 단백질-DNA 상호 작용을 감지하는 전기영동 이동성 이동 분석을 시연합니다. 단백질이 DNA 프로브에 결합할 때, 천천히 이동하며 겔에 이동된 밴드로 나타나는 큰 복합체를 형성합니다.

transcription factor-DNA 복합체 검출을 위한 전기영동 이동성 전환 분석

여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다.

IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

우리는 여기서 중요한 생물학적 문제를 해결하기 위해 사례 연구와 같은 적외선 형광 염료 표지 DNA 프로브와 함께 정제 된 SOX-2 단백질을 사용하여 형광 전기 영동 이동성 이동 분석 (fEMSA)의 최적화 된 프로토콜을 설명합니다.

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

우리는 합성에 대 한 프로토콜와 펩 티 드 핵 산 (PNA) 올리고 통합의 정화 수정 잔류물. 수정된 PNAs에 의해 RNA duplexes의 인식 특성에 대 한 생화학 및 생물 방법은 설명 합니다.

시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 RNAs에 더블-좌초 RNAs의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정

쉬스 다공질 팁 인터페이스 설계를 이용하여 모세관 전기 영동 - 질량 분석법에 의한 생체 시료의 대사 프로파일 링을위한 프로토콜이 제시된다.

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

이 논문은 비변성 PAGE와 웨스턴 블롯 분석의 조합을 사용하여 인간 세포의 용해물에서 다이나민 유사 GTPase MxA 단백질의 올리고머 상태를 평가하는 간단하고 빠른 프로토콜에 대해 설명합니다.

비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

배우세요 수평 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용한 RNA-단백질 상호작용 분석 방법을. 전기영동 중 복합체 형성을 실시간으로 모니터링하여 RNA 생화학적 특성을 연구할 수 있습니다.

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

더 많은 동영상 탐색