Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

leapfrogging의 전반적인 목표는 배아 발생에 필수적인 유전자의 돌연변이 라인 생성을 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 발생 유전학 및 기타 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 F1 세대에서 필수 유전자의 돌연변이체를 얻을 수 있다는 점입니다.

본 절차를 시작하려면, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Cas9-sgRNA 복합체를 Xenopus 배아의 1세포기에 미세주입합니다. 수정 후 4.5시간이 되어 초기 포배기(blastula stage 9)에 도달하면, 배아를 25°C 배양기에서 꺼내어 상온에서 계속 발달하도록 합니다. 수정 후 5시간에 이식 절차를 시작하려면, 파스퇴르 피펫을 사용하여 주입되지 않은 배아 하나를 홈이 파인 60mm 아가로스 디쉬로 옮깁니다. 이 배아는 이식 수용체가 됩니다.

또한 PGC 공여자 배아 하나를 접시에 옮깁니다. 포셉을 사용하여 각 배아에서 난황막을 수동으로 제거합니다. 그리고 두 배아를 회전시켜 식물극이 보이고 수술이 가능한 상태가 되도록 합니다.

다음으로, 헤어 루프로 수신 배아를 고정하면서 눈썹털 칼의 날카로운 끝을 표면 바로 아래의 식물극에 삽입합니다. 그리고 빠르게 위로 긋는 동작으로, 향후 병세포(bottle cells)가 형성되어 척추공을 표시하게 될 구역 내에 정사각형 모양으로 네 번의 얕은 절개를 가합니다. 정사각형의 네 면이 그려지면, 눈썹털 칼을 사용하여 앞서와 유사한 절개 동작으로 각 절개 부위를 포배강 바닥까지 거리의 약 1/3에서 1/2 깊이까지 더 깊게 절개합니다.

수용측 배아의 깊은 식물성 영역에 하나 이상의 수평 절개를 가하여 식물성 조직 외식편을 분리합니다. 그런 다음, 신속하게 PGC 공여측 배아에도 동일한 절차를 반복하여 이식에 사용할 비슷한 크기의 식물성 조직 조각을 만듭니다. PGC를 포함하는 조직이 공여측 배아에서 제거되면, 눈썹털 칼과 헤어 루프를 사용하여 외식편을 수용측 배아에 만들어진 개구부에 배치합니다.

눈썹 칼의 자루를 이식편 표면과 평행하게 유지한 채, 수혜체 배아의 식물성 표면에 뚫린 구멍 속으로 이식편을 부드럽게 밀어 넣으십시오. 헤어 루프를 사용하여 공여체 배아의 사체를 아가로스 표면을 따라 부드럽게 밀어 웰 안으로 옮기십시오. 이때 사체의 열린 상처 부위가 벌크 액체를 향하도록 하십시오.

수용체 배아를 인접한 웰로 밀어 넣고, 마찬가지로 이식된 식물극 조직이 벌크 액체를 향하고 있는지 확인합니다. 배아가 약 초기 낭배기인 10단계에 도달할 때까지, 이식 과정에서 배아를 빈 웰로 옮겨가며 추가 배아를 이용해 PGC 이식을 반복하여 더 많은 이식체 쌍을 만듭니다. 이식 후 보통 30~45분이 지나 이식편이 제자리에 고정되면, 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 함몰 부위에서 아가로스 코팅된 24-웰 플레이트의 개별 웰로 매우 조심스럽게 옮깁니다.

배아의 식물극이 위쪽을 향해 벌크 용액을 마주 보도록 배아를 회전시킵니다. 배아 쌍을 쉽게 추적할 수 있도록 공여체 사체와 이식 수혜체를 인접한 웰에 배치하고 이 정보를 기록하십시오. 그런 다음 배아가 담긴 24-웰 플레이트를 25 °C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 초기 꼬리눈 단계(early tail bud stage)에 도달한 각 이식 수혜체를 아가로스가 코팅된 새로운 6-웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 리프프로깅(leapfrogged) 배아를 배양하고, 사체에서 얻은 공여체 DNA 분석을 텍스트 프로토콜에 따라 수행합니다. 리프프로깅은 생식선이 돌연변이 대립유전자로 효율적으로 교체된 동물을 생성하므로, F1 세대에서 돌연변이 표현형을 얻을 수 있습니다.

이 표에 제시된 바와 같이, Blitz 등은 멜라노사이트 및 망막 색소 침착에 필요한 tyrosinase 유전자좌를 표적으로 한 F0 동물 대부분이 tyr 마이너스 알비노 동물과의 교배를 통해 측정했을 때 공여체 유래 돌연변이 게놈의 100% 생식세포 전달을 보였다고 보고했습니다. 이 영상을 시청함으로써 Xenopus 원시 생식세포를 이식하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.