Name: Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: 배우세요 Xenopus 원시 생식 세포 이식을 활용한 CRISPR/Cas9 기반 leapfrogging 기법으로 필수 유전자 돌연변이 계통을 효율적으로 생성하는 방법을. 이 기술은 F1 세대에서 동형 결합성 널 돌연변이체를 얻어 배아 발생에서 치명성을 극복합니다.

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이 작품은 보조금의 지원으로 수행 되었다 5R21HD080684-02, 아동 건강의 국가 학회 및 인간 발달에서. 저자 켄 조 그의 지속적인 열정과 지원에 대 한 감사를 기원 합니다. 저자 또한 싶습니다 원고, 숀 맥 나 마라와 국가 Xenopus 자원 (RRID:SCR_013731)에 마 Wlizla의 중요 한 독서에 대 한 그의 카메라, 리브가 Charney의 사용에 대 한 브루스 블 룸 베르크를 인정 하는 가치에 대 한 X. tropicalis 수 유 및 동물 관리 식이요법에 관한 대화.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용, Irvine가 주 대학의 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. PGC 식 위한 준비
<ol><li>앞에서 설명한23으로 해 부 도구를 사전에 준비 합니다. 참고: 눈 썹 머리 칼 수술을 수행 하는 동안 태아를 안정 시키기 위해 머리 루프의 도움으로 절 개를 만드는 데 사용 됩니다. 눈 썹 머리와 머리 루프 붕 규 산 유리 펫 파스퇴르는 화 염에 그려 왔다 처음으로 붙어 있으며 남았다 부분에 깨진 (참조 그림 1A, 화살촉) 큰 손 재주에 대 한 짧은, 좁은 팁 (그림 1B)를 만들 때 수술을 수행.</li>
	<li>SgRNAs 절차 이전 기술된24 을 사용 하 여 생성 합니다. 참고: 짧게, 짧은 DNA 서식 파일 sgRNAs에 대 한 코딩 만들어집니다를 오류-무료, thermostable DNA 중 합 효소 겹치는 deoxyoligonucleotides 5' 살 균 소 T7 발기인, 단련 되 고 "입력"를 포함 하 여. SgRNA 합성 반응 생체 외에서 (키트 사용)에 따라 하룻밤 몇 시간 동안 알을 품는. 반응은 DNAse 처리는 서식 파일을 제거 하는. sgRNAs 페 놀/클로 프롬 추출 및 암모늄 아세테이트/소 프로 파 놀 강수량, 키트 제조 업체의 지침24에 따르면의 표준 방법으로 정화 된다.</li>
	<li>Microinjections를 수행 하기 전에 곧 준비 Cas9 sgRNA 단지 첫 번째 변성 ~ 250 여 RNAse 무료 (diethylpyrocarbonate 대우) H2O 60-65 ° C에서 5 분의 3 µ L 전체 볼륨에서 sgRNA의 ng 뒤에 빠른 냉각 5 분 동안 얼음에. 몇 초 동안에 sgRNA 원심 1 µ g / µ L Cas9 단백질의 1 µ L을 추가 하 고 복잡 한 형성을 촉진 하는 37 ° C에서 10 분 동안 품 어. 참고:이 부 화에 따라 튜브 수 보관 얼음에 microinjection에 대 한 배아를 준비 하는 동안.</li>
	<li>X. tropicalis 배아 체 외에서 수정 표준 방법을 사용 하 여 앞에서 설명한25얻을. 01-25,26 젤리 10 분 후 수정에서 태아. 참고: 수정 시간 시간 후 정자 현 탁 액 계란에 추가 되 고 접시 1/9thX와 홍수입니다 간주 됩니다 마크의 Ringers 수정 (MMR)26. 1/9에 드 jellying X. tropicalis25, X. laevis, 달리 수행에 대 한 3% 시스테인 무료 자료 (하지 HCl 소금), 포함 된 x MMR pH 7.8-8.0, 조정 뒤에 1/9에 여러 세척 x MMR. Agarose (1%)에 배아를 전송-1/9를 포함 하는 코팅된 접시 실 온에서 x MMR.</li>
	<li>즉시 1 1 %agarose 코팅 접시에 주입 될 배아 전송 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 x MMR.</li>
	<li>
1 세포 단계에서 주입. Xenopus microinjection 방법에 대 한 자세한 설명에 대 한 참조26,27 를 참조 하십시오.
	<ol>
<li>4 동물 극에서 단일 사이트에 각 배아 주사 Cas9 sgRNA 복잡의 홀란트 (최종 금액 = 1 Cas9 및 sgRNA의 ~ 250 pg의 ng; 보십시오 토론)24. 사출 사이트 치유의 10-20 분 후 1/9를 포함 하는 agarose 코팅 접시 배아 전송 x MMR 및 25 ° c.에 품 어 또한 배아 이식 받는 사람 역할을 하 uninjected 형제의 접시를 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
페 트리 접시 (60 m m) ~ 5 m m를 포함 하는 준비-0.3에서 1 %agarose 두꺼운 층 x MMR, X. tropicalis또는 1에서 이식 하 고 X. laevis에 대 한 x MMR.
	<ol>
<li>만들기 우울증 ~ 3-4 m m 3를 삽입 하 여 깊은-4 우물 형 (96-잘 PCR 플레이트 절단 하 여 만든) x 녹은 agarose 접시를 붓는 때에 ( 그림 1C 참조 및 D). 몰드는 agarose는 강화 된 때까지 링 스탠드에 부착 된 클램프를 사용 하 여 페 트리 접시의 바닥 위에 몇 밀리미터를 잡으십시오.</li>
		<li>또한, 우물 1/9에 1 %agarose 얇은 층으로 코팅 하 여 집 개별 배아 24-잘 접시에 게 x MMR. 참고: 이러한 우물에 추가 문화 매체는 MMR 보충 gentamycin 황산/mL의 50 µ g 1/9 x.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. PGCs의 이식
<ol><li>때 배아 그냥 무대에 도달 Nieuwkoop와 페이 버28 blastula 9 (그림 2A), ~4.5 h 후 수정 (hpf) X. tropicalis, 25 ° C 배양 기에서 그들을 제거 하 고 추가 대 한 실내 온도에 equilibrate 수 있도록 0.5 h입니다.</li>
	<li>5 이식 하려면 hpf (그림 2B)를 사용 하 여 파스퇴르 피 펫 (Cas9-sgRNA 주사) 한 PGC 기증자 배아 전송 0.3에서 (단계 1.7에서에서 만든) 불경기를 포함 하는 60 m m agarose 접시 x MMR (1 또는 x MMR X. laevis를 사용 하는 경우). 또한 한 uninjected 형제 태아,이 접시를 이식 받는 전송. 참고: 그것은 중요 이러한 배아의 각각의 정체성 혼동 하지는.</li>
	<li>수동으로 집게를 사용 하 여 각 배아에서 vitelline 봉투를 제거 하 고 그들의 식물성 극 보기에서 및 수술에 대 한 접근은 모두 배아를 회전. 참고: 배아의 수동 드 vitellination의 설명 이전 되었습니다 설명된26.</li>
	<li>눈 썹 머리 칼의 날카로운 팁을 사용 하 여, 4 개의 얕은 절 개는 blastopore를 표시 하는 미래의 병 셀 형성 됩니다 영역 내부 받는 사람 배아의 식물성 극에 사각형의 형태로 확인 합니다. 태아, 표면, 및 위쪽으로 머리 루프와 배아를 안정화 하는 동안 움직임을 슬라이스 하는 게 바로 아래에 눈 썹 머리 칼 끝을 삽입 하 여 절 개를 확인 합니다. 참고: 그림 2 4.5-7.0 hpf 셀 크기를 보여 병 세포 (점선된 흰색 원)을 형성할 것 이다 예측에 대 한 가이드를 제공 하 고에서 뉴캐슬과 간격 배아의 식물 경관을 보여준다. 목표 파선된 블랙 박스 표시 됩니다 incisions를 만드는 것입니다.</li>
	<li>사각형의 네 면 절 개에 의해 delineated는, 일단의 약 1/3 ~ 1/2 blastocoel 바닥에 거리의 깊이 도달 비슷한 절삭 동작을 사용 하 여 눈 썹 머리 칼으로 각 절을 심화.</li>
	<li>받는 사람 배아에서 식물 조직 explant 무료 (그림 3A 및 B) 수평 (식물 표면에 평행) 함으로써 깊은 식물 지역에서 cut(s). 참고: PGC 포함 된 식물성 explant의 크기는 약 0.4-0.45 m m 면 당 및 0.25-0.3 m m 깊이에서. 받는 사람 배아에서이 식물 explant 이상 필요 하 고 따라서 옆으로 폐기를 설정 해야.</li>
	<li>신속 하 게 작업,이 절차 (단계 2.4-2.6) 이식에 대 한 비슷한 크기 식물 조직 파편을 만드는 PGC 기증자 배아에 반복 합니다. 참고: 그것은 그것의 열려있는 상처를 치유 받는 사람 배아에 대 한 시간을 최소화 하기 위해 작은 지연으로이 두 번째 해 부를 실시 하는 것이 중요.</li>
	<li>일단 PGCs를 포함 하는 조직 기증자 태아에서 제거, 눈 썹 머리 나이프와 머리 루프를 사용 하 여이 explant 받는 사람 배아에서 만든 오프닝에 위치로 이동. 참고: 기증자 이식의 내부 표면 내부 받는 사람 배아의 직면 한다. 받는 사람 배아를 이식의 등 쪽 복 부와 왼쪽 오른쪽 축의 방향에 맞게 필요는 없습니다.</li>
	<li>눈 썹 머리 칼, 이식의 표면에 병렬 개최의의 긴 가장자리를 사용 하 여 부드럽게 눌러 받는 사람 배아의 식물 표면에 오프닝으로 이식.</li>
	<li>이식 배치 되었습니다 일단 부드럽게 슬라이드 "시체" 기증자 배아의 agarose 표면에 걸쳐 agarose 우울증으로 하는 hairloop 또는 눈 썹 머리 칼의 샤프트를 사용 합니다. 시체의 오픈 상처 대량 액체를 직면 하 고는 다는 것을 확인 하십시오. 그렇지 않다면, 눈 썹 머리 칼을 사용 하 여이 방향을 달성 하기 위해 배아를 회전.</li>
	<li>받는 사람 배아 이식 장소에는 인접 한 우울증으로 치유와 슬라이드 하 고 마찬가지로 이식할된 식물성 극 조직 대량 액체를 직면 하 고는 다는 것을 확인 한다.</li>
	<li>다른 이식/시체 쌍;을 만듭니다 기증자와 받는 사람 배아의 다른 쌍을 사용 하 여이 절차 (단계 2.1-2.11) 반복 이러한 빈 우울증을 전송 합니다. 참고: 중요 한 시체 및 배아 이식-베어링의 일치 쌍을 추적 하는 표기법은 이다. 기증자 시체 이식 베어링 동물 성적인 성숙을 도달할 때까지 쉽게 분석 될 수 없습니다 이식된 PGCs에 Cas9-sgRNA-유도 된 mutagenesis의 효율성에 대 한 프록시로 사용 됩니다 (아래의 단계 3.3, 참조 및 토론 ).</li>
	<li>계속 이식 배아 약 gastrula 조기에 10, 약 6.5는 도달할 때까지 X. tropicalis 에서 hpf ( 그림 2E참조).</li>
</ol>3. 후 배아 들 치유
참고: 이식 ~ 30 분 이내에 치료 하 고 정상 세포 세포의 용 해 (그림 3C) 배아에서 풍기에서 일부 yolky 파편을 관찰 하는.
<ol><li>
일단 치유, agarose 코팅 24-잘 접시의 개별 웰 스에 우울증에서 매우 부드럽게 전송 배아에 파스퇴르 피 펫을 사용 합니다. exudate 됩니다 (그림 3D) 전송 하는 동안 혼합 유체에 의해 제거.
	<ol>
<li>대량 해결책에 직면을 식물 극 배치 되도록 배아를 회전 합니다. 다시, 기증자 시체를 놓고 태아 쌍;의 유지에 도움을 받는 인접 한 우물에 이식 이 정보를 기록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>숙박 문화에 대 한 25 ° C 배양 기에 태아를 포함 하는 24-잘 접시를 전송 합니다. 참고: 다음 날, 배아는 도달 했다 tailbud 단계.</li>
	<li>Agarose 코팅 6 잘 플레이트 MMR 보충 gentamycin 황산/mL, 잘 당 1 태아의 50 µ g 1/9 x를 포함 시키려면 이식 받는 사람을 이동 합니다. 이러한 일치 하는 기증자 시체의 명확한 기록 유지 이식 받는 사람.</li>
	<li>시퀀싱 PCR amplicons5,,1724 또는 PCR amplicons ( 토론참조)에 의존 하는 다른 방법을 사용 하 여 의해 mutagenesis 효율성 평가, 0.2 mL PCR 스트립 튜브를 개별 시체를 이동 합니다. 매체의 대부분을 제거 하 고 100 µ L 세포의 용 해 버퍼24 K (PK)으로 위아래 pipetting P200 피 펫을 사용 하 여 반복 하는 성분을 포함 하에서 균질.</li>
	<li>배아 세포24 PK 소화를 허용 하도록 하룻밤 6 h 56 ° C에서 수행 합니다. 10 분 뒤에 4 ° c 빠른 냉각 90-95 ° C에가 열 하 여 PK를 비활성화 추가 정리 단계 없이 lysates를 사용 하 여 씨를 직접 생어 DNA 시퀀싱24에 대 한 짧은 amplicons PCR 반응. -20 ° c.에 lysates 저장 참고: 몇 일 이내는 tadpoles 먹이 단계 (약 단계 45-46)에 도달 한다 그리고 planktonic 분말 (세라 미크론)의 정지 먹 일 수 있습니다.</li>
	<li>청결을 유지 하 고 미생물 자라 난 최소화를 문화 매체의 매일 변화 ~ 1 주 후 물방울 흐름 순환 수 중 시스템에 tadpoles 작은 탱크를 이동 합니다. 시퀀싱 데이터를 사용 하 여 낮은 mutagenesis 효율 tadpoles에서 매우 효율적으로 mutagenized PGCs와 tadpoles를 분리. 변 태 완료 되 면 연구실에서 성인 수생 시스템에는 froglets를 이동 합니다. 참고: 국가 Xenopus 자원 (해양 생물학 연구소, 나무 구멍, MA)에 의해 개발 된 식이요법 올챙이 먹이29 그리고 성인 개구리 유지 보수30에 대 한 가이드를 제공 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 상관이 있다.

이 보고서에서는 PGCs. 이식의 PGCs를 포함 하는 식물 조직의 이식에 대 한 상세한 프로토콜을 수정 하는 생식을 게놈 편집 기술 (예: CRISPR/Cas9)와 함께에서 사용 하면서 동물의 거의 모든 그것의 체세포 조직 유전자 야생 유형으로 유지. 성공 하려면 leapfrogging 위해 수행 간이식을 수행 하기 전에 고려해 야 할 중요 한 요인의 수가 있다.
돌연변이 체 대립 유전자와는 생식의 완전 한 교체를 위해 하나 먼저 sgRNAs의 비보에 효율을 결정 한다는 것이 좋습니다. 경험에 따르면 대부분 sgRNAs CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) 또는 CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/)에 의해 설계 된 효율적인 250 pg/배아에서 사용 하는 경우는. 그러나, 어떤 경우 (예를 들어, 의해 기습 외17, <e...

어떻게 유전자 표현 형 인코딩합니다 Mendel의 법률의 재발견 이후 생물학에서 주요 질문 되었습니다. 인코딩된 제품 약속 잠복 새로운 생물학 및 장황 질병 상태에 대 한 도구를 제공 하기의 기능과 유전자, 그들의 규칙 및 유전자 네트워크 내에서 상호 작용의 역할의 이해. 절반 이상이 세기1, 아프리카 발톱된 개구리, Xenopus, 기초 생물학 및 의학, 발달의 유전 통제를 포함 하 여 다양 한 주제에 대 한 연구에 대 한 선도 모델을 하고있다. 역사적으로, Xenopus 에 대부분의 연구는 allotetraploid 개구리, X. laevis, 사용 하지만 더 최근에, 그것의 diploidy 인 X. tropicalis 개발 되었습니다 양서류 유전자 모델. 완전 한 게놈 시퀀스 두 Xenopus 종2,3에서 조립 되어 있다. "개구리 커뮤니티"입니다 지금 전환점에 어디 기본 게놈 수정 기술 허용 유전자 기능 연구 거의 것입니다. 프로그래밍 가능 CRISPR/Cas9 endonucleases 유전자의 mutagenesis를 biallelic 돌연변이 가능한 대부분의 세포에서 동물4,,56,7의 고효율 만들었습니다. 8,9,,1011. Bhattacharya 외 하 여 강조 하는 이러한 연구 12 및 Shigeta 외. 13, 많은 유전자의 기능 mutagenesis F0 모자이크 동물에 의해 공부 될 수 있다 나타났습니다. 이 접근에는 많은 이점이; 그러나, Cas9-sgRNA-microinjected 배아 종종 기능 (LOF)의 불완전 한 손실로 인해 가변 고기를 표시합니다. 더 크게, 돌연변이 라인의 세대는 매우 일부 응용 프로그램에 대 한 유리한-특히 모성 mRNA 기여 있는 유전자를 공부를 할 때. 모성 mRNAs 및 단백질, 그리고 epigenetics에 그들의 영향 embryogenesis14,,1516, 많은 유전자의 초기 발달 기여를 렌더링으로 오랜된 기간 동안 유지 F0 분석에의 내 화 따라서, 다른 LOF 방법이 제시해 주셔야 합니다.
돌연변이 체 라인을 만들 경우, 경로 homozygous LOF 배아를 얻는 몇 가지 장애물 있다. 첫째, 효율적인 mutagenesis biallelic 돌연변이 생산 하는 필수 유전자 기능의 손실이 가능한 라인의 생산을 방해 하는 성적 성숙에 살아남기 위해 실패에서 하기 때문에 불리 한 될 수 있습니다. 일반적인 솔루션은 Cas9-sgRNA 전달 금액의 주의 적정. 여기, 목표는 또한 생식 mutagenesis 효율성을 극대화 하면서 치 사 율 감소 사이의 균형을 달성 하는. 두 번째 문제 표준 사육 체계에서 발생 하는 phenotypic 분석 F2 세대까지 지연 됩니다. 표준 방식을 사용 하 여, 성적 돌연변이 체 대립 유전자는 생식을 통해 F1 heterozygous "캐리어", 성적 성숙 성장 다음 생산 outcrossed는 전송 하는 F0 동물 성숙. 2 F1 heterozygotes는 다음 25%의 예상된 Mendelian 주파수에서 F2 돌연변이 배아를 생산 하기 위해 intercrossed. 따라서, 번 식의 2 세대 돌연변이 고기의 분석을 위해 필요 하다. 돌연변이 동물 homozygotes 또는 복합 heterozygotes (즉, 자손 포함 하는 두 개의 다른 돌연변이 체 대립 유전자 F1 intercross에서 사용 하는 부모의 동물의 genotypes에 달려 있는) 수 있습니다.
프로그래밍 가능한 nuclease 중재 mutagenesis 세균 세포에 기초가 넘기17라는 새 메서드를 제한 하 여 이러한 장애물을 극복할 수 있습니다. 두 가지 주요 구성 요소는 leapfrogging: Cas mRNA sgRNA, 또는 nuclease sgRNA 단지 (또는, 원리, TALENs 또는 아연 손가락 nucleases)의 (1) microinjection 단일 셀 단계에서 효율적으로 배아 유전자 mutagenize를, 다음 (2) PGCs의 생 PGCs 제거 되었습니다 wildtype 형제 배아로 이식. 두 단계는 돌연변이 세균 세포로 효율적이 고 완전 한 생식 보충 때 얻어질 수 있다. Blackler 1960 년대 Xenopus PGCs 늦은 neurula에서 배아 초기 tailbud 단계18,19사이 이식 될 수 있는 시연. Leapfrogging, Blackler의 접근 PGCs 태아20,21의 식물성 극에 지역화는 blastula 단계17, 간이식을 수행 하 여 수정 되었습니다. Gastrulation 전에 이식 두 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 이식 및 후속 표준 개발의 engraftment 이식 blastula 단계 (관찰 되지 않은)에서 수행 하는 경우 더 효율적으로 발견 되었다. 둘째, zygotic 녹음 방송 시작 직후 blastula 단계 간이식을 수행, 하나 치 발달 유전자 변이 gastrulation 또는 그 방해를 그렇지 않으면 잘못 된 늦은 neurulae 이어질에서 발생을 피할 수 있다. PGC 이식-베어링 ("사간") 배아는 성적 성숙, 성장 및 이러한 F0 동물 사이 intercrosses는, 많은 경우에, F1 자손의 100% (대부분 되 고 복합 LOF 형 표시 증명 heterozygotes), 대상된 돌연변이와 완전 한 생식 교체를 나타내는.
그것 leapfrogging Xenopus에 유전 접근을 가속화 될 것으로 예상 된다. 또한 임산부 효력 유전자 (게시 되지 않은 관찰) LOF 분석에 대 한 "호스트 전송" 방법22 에 대 한 대안을 제공 leapfrogging. 현재 발행물에서 PGC 이식에 초점 특히 방법에 대 한 자세한 설명을 제공 됩니다 X. tropicalis 에서 ( X. laevis에 대 한 작은 수정). Xenopus작업 다른 실험실에 더 빠른이 기술 이전을 촉진 하기 위하여 여기 PGCs의 식은 설명 했다. 이 방법의 원리 (예: urodeles), 다른 양서류에 성공 해야 하 고 방법론에서 유기 체 관련 수정 효율적인 mutagenesis 달성 될 수 있는 다른 많은 동물을 응용 프로그램에 대 한 허용 해야 하 고 PGCs는 쉽게 transplantable.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20 또는 11252-30</td><td></td></tr><tr><td>눈썹 헤어 나이프</td><td></td><td></td><td>홈메이드</td></tr><tr><td>헤어 루프</td><td></td><td></td><td>홈메이드</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫, 붕규산 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue (시아노아크릴레이트 기반)</td><td>Elmer's Products, Inc.</td><td>KG581</td><td>파스퇴르 피펫에 눈썹 털과 머리 고리를 부착하기 위해 다른 유사한 접착제를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>올리고데옥시뉴클레오티드, 맞춤형 주문</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>sgRNA 합성을 위한 맞춤형 주문 템플릿 올리고, 설계 세부 사항은 Nakayama et al., 2014 참조.</td></tr><tr><td>메가스크립트 T7 키트</td><td>Ambion/ThermoFisher</td><td>AM1334</td><td>또는 Megashortscript T7 (AM1354) 키트</td></tr><tr><td>페놀, 트리스 버퍼링</td><td></td><td></td><td>모든 상업 공급업체의 고품질 증류 페놀</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td></td><td></td><td>모든 상업 공급업체의 고품질 클로로포름</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>모든 상업 공급업체</td>의 고품질 에탄올 <td></td><td></td></tr><tr><td>디에틸피로카보네이트(DEPC)</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 단백질, 핵 국소화 신호 PNA</td><td>Bio, Inc.</td><td>CP01</td><td>제조업체의 권장 사항에 따라 DEPC 처리 된 물을 사용하여 재구성</td></tr><tr><td>10X Marc의 Modified Ringers 솔루션</td><td></td><td></td><td>Homemade. 1X MMR(EDTA 부족)에 대한 레시피(참조 26)는 100mM NaCl, 2mM KCl, 1mM MgSO4, 2mM CaCl2, 5mM Hepes입니다. 용액은 pH를 7.4로 조정합니다.</td></tr><tr><td>아가로스</td><td></td><td></td>: <td>모든 분자 생물학 등급의 아가로스로 충분합니다:</td></tr><tr><td>60 X15 mm 페트리 플레이트</td>, <td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td>, <td>Falcon</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>, Sigma Chemical Co.</td><td>C7352-100G</td><td>염기가 아닌 염기, HCl 염이 아님</td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K</td><td>Roche</td><td>03 115 828 001</td> 일반적으로 Roche 혈청 미크론 혈청 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>올챙이 식품에서 ~ 20mg / ml. 성장 배지에 재현탁합니다. 다양한 온라인 소매점에서 구입할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

xenopus 에 leapfrogging crispr/cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

편집 하는 게놈 돌연변이 라인의 창조 많은 유기 체에서 유전자 분석을 가속. CRISPR/Cas9 메서드가 아프리카 발톱된 개구리, Xenopus, 생물 의학 연구에 대 한 오랜 모델 유기 체에서에서 사용 하기 위해 적응 되었습니다. CRISPR/Cas9-타겟 mutagenesis와 homozygous 돌연변이 라인을 만들기 위한 전통적인 번 식 계획 몇 가지 어렵고 힘 드는 단계 있다. 특히 노크 embryogenesis에 필수적인 유전자와 관련 된 장애를 극복 하기 위해 돌연변이 배아의 생성을 촉진 하기 위하여 leapfrogging 이라는 새로운 방법을 개발 되었다. 이 기술을 활용 하 여 "잘라내기 및 붙여넣기" Xenopus 배아의 견고성 embryological 방법. Leapfrogging PGC 연기나 wildtype 형제에 효율적으로 mutagenized 기증자 배아에서 원시 생식 세포 (PGCs)의 전송을 사용합니다. 이 메서드는 공상 동물 wildtype 체세포 돌연변이 생식을가지고 작성 하 여 필수적인 유전자의 효율적인 돌연변이 대 한 수 있습니다. 때 두 F0 동물 운반 "도약 이식" (즉, 돌연변이 세균 세포)는 intercrossed, 그들은 생산 homozygous, 또는 복합 heterozygous, null F1 배아, phenotypic 데이터를 얻기 위해 전체 생성 시간 절약. F0 phenotypic 분석 CRISPR/Cas9 mutagenesis 다음 내 화물은 임산부 효력 유전자 분석을 위한 새로운 접근 방법을 제공 합니다 또한 leapfrogging. 이 원고 leapfrogging PGC 이식 성공적으로 수행 하는 방법에 대 한 특별 한 강조와 함께 하는 방법을 자세히 설명 합니다.

이식, 다음 CRISPR/Cas9 mutagenesis의 효능의 질적 결정 축산 성장과 성적 성숙 동물 유지에 노력을 소비 하기 전에 수행 되어야 합니다. 때문에 들고 토끼 뜀 이식 동물 somatically wildtype는 생식은 직접 측정을 위한 접근 하기 어려운, 기증자 태아의 시체를 저장 중요 해 집니다. 시체에서 DNA 분석 이식된 생식17에서 발생 하는 mutagenesis의 범위에 대 한 프록시 역할을 합니다.
Mutagenesis의 성공을 평가 하는 한 가지 방법은 직접 시퀀스 PCR amplicons 대상 게놈 영역에 걸친 것입니다. 이것은 특히 비용과 비효율적인 경우 하고자 많은 동물에서 수많은 개별적으로 복제 된 DNA 파편을 연속 된다. 대신, 그들은 모자이크 배아 유전자에서 파생 ...

생존을 위해 필수적인 유전자 돌연변이 라인을 만들기 위한 기술 장애물 포즈. Leapfrogging 게놈 야생-타입 동물 생식 변이 들고 만드는 원시 생식 세포 이식으로 편집을 결합 하 여 치 사 율 circumvents. Leapfrogging 또한 F1 세대에서 null homozygous 돌연변이의 효율적인 생성을 허용합니다. 여기, 이식 단계는 보여 줍니다.

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

leapfrogging의 전반적인 목표는 배아 발생에 필수적인 유전자의 돌연변이 라인 생성을 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 발생 유전학 및 기타 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 F1 세대에서 필수 유전자의 돌연변이체를 얻을 수 있다는 점입니다.본 절차를 시작하려면, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Cas9-sgRNA 복합체를 Xenopus 배아의 1세포기에 미세주입합니다. 수정 후 4.5시간이 되어 초기 포배기(blastula stage 9)에 도달하면, 배아를 25°C 배양기에서 꺼내어 상온에서 계속 발달하도록 합니다. 수정 후 5시간에 이식 절차를 시작하려면, 파스퇴르 피펫을 사용하여 주입되지 않은 배아 하나를 홈이 파인 60mm 아가로스 디쉬로 옮깁니다. 이 배아는 이식 수용체가 됩니다.또한 PGC 공여자 배아 하나를 접시에 옮깁니다. 포셉을 사용하여 각 배아에서 난황막을 수동으로 제거합니다. 그리고 두 배아를 회전시켜 식물극이 보이고 수술이 가능한 상태가 되도록 합니다.다음으로, 헤어 루프로 수신 배아를 고정하면서 눈썹털 칼의 날카로운 끝을 표면 바로 아래의 식물극에 삽입합니다. 그리고 빠르게 위로 긋는 동작으로, 향후 병세포(bottle cells)가 형성되어 척추공을 표시하게 될 구역 내에 정사각형 모양으로 네 번의 얕은 절개를 가합니다. 정사각형의 네 면이 그려지면, 눈썹털 칼을 사용하여 앞서와 유사한 절개 동작으로 각 절개 부위를 포배강 바닥까지 거리의 약 1/3에서 1/2 깊이까지 더 깊게 절개합니다.수용측 배아의 깊은 식물성 영역에 하나 이상의 수평 절개를 가하여 식물성 조직 외식편을 분리합니다. 그런 다음, 신속하게 PGC 공여측 배아에도 동일한 절차를 반복하여 이식에 사용할 비슷한 크기의 식물성 조직 조각을 만듭니다. PGC를 포함하는 조직이 공여측 배아에서 제거되면, 눈썹털 칼과 헤어 루프를 사용하여 외식편을 수용측 배아에 만들어진 개구부에 배치합니다.눈썹 칼의 자루를 이식편 표면과 평행하게 유지한 채, 수혜체 배아의 식물성 표면에 뚫린 구멍 속으로 이식편을 부드럽게 밀어 넣으십시오. 헤어 루프를 사용하여 공여체 배아의 사체를 아가로스 표면을 따라 부드럽게 밀어 웰 안으로 옮기십시오. 이때 사체의 열린 상처 부위가 벌크 액체를 향하도록 하십시오.수용체 배아를 인접한 웰로 밀어 넣고, 마찬가지로 이식된 식물극 조직이 벌크 액체를 향하고 있는지 확인합니다. 배아가 약 초기 낭배기인 10단계에 도달할 때까지, 이식 과정에서 배아를 빈 웰로 옮겨가며 추가 배아를 이용해 PGC 이식을 반복하여 더 많은 이식체 쌍을 만듭니다. 이식 후 보통 30~45분이 지나 이식편이 제자리에 고정되면, 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 함몰 부위에서 아가로스 코팅된 24-웰 플레이트의 개별 웰로 매우 조심스럽게 옮깁니다.배아의 식물극이 위쪽을 향해 벌크 용액을 마주 보도록 배아를 회전시킵니다. 배아 쌍을 쉽게 추적할 수 있도록 공여체 사체와 이식 수혜체를 인접한 웰에 배치하고 이 정보를 기록하십시오. 그런 다음 배아가 담긴 24-웰 플레이트를 25 °C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 초기 꼬리눈 단계(early tail bud stage)에 도달한 각 이식 수혜체를 아가로스가 코팅된 새로운 6-웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 리프프로깅(leapfrogged) 배아를 배양하고, 사체에서 얻은 공여체 DNA 분석을 텍스트 프로토콜에 따라 수행합니다. 리프프로깅은 생식선이 돌연변이 대립유전자로 효율적으로 교체된 동물을 생성하므로, F1 세대에서 돌연변이 표현형을 얻을 수 있습니다.이 표에 제시된 바와 같이, Blitz 등은 멜라노사이트 및 망막 색소 침착에 필요한 tyrosinase 유전자좌를 표적으로 한 F0 동물 대부분이 tyr 마이너스 알비노 동물과의 교배를 통해 측정했을 때 공여체 유래 돌연변이 게놈의 100% 생식세포 전달을 보였다고 보고했습니다. 이 영상을 시청함으로써 Xenopus 원시 생식세포를 이식하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

blastula 또는 gastrula 단계에서 이식의 대상이 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 단계별 가이드.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

Zebrafish 세포 이식은 조직 특정 chimeras를 생성하는 유전 발생학의 조합이 가능합니다. 이 비디오는 gastrula 우리 연구실은 forebrain의 접합면의 형성 중에 astroglial 인구와 구체적인지도 단서의 역할을 조사하기 위해 허용해야 세포 transplantations를 개최 보여줍니다.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

Xenopus의 사이에 얼굴 조직을 "극단적 인 전방 도메인"이식에 대한 기술은 배아가 개발 한 laevis의. 조직은 두개 안면 개발 및 얼굴 영역 사이의 상호 작용을 신호에 대한 지역의 요구 사항의 연구를 허용, 또 다른 한개로 1 유전자 발현 배경에서 이동할 수 있습니다.

의 얼굴 이식<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 태아

우리는 배양된 세포를 초기 마우스 배아의 정의된 부위에 이식하여 생체 내 잠재력을 결정하는 방법을 보여줍니다. 또한 알려진 직경의 유리 모세혈관을 사용하는 최적화된 전기천공법(electroporation method)을 도입하여 배아의 몇 개의 세포에 외인성 DNA를 정확하게 전달할 수 있습니다.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

제노푸스 배아에서 배반구의 지붕에 있는 세포는 만능이며 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 양서류 배반구 지붕 외식을 분석 시스템으로 사용하여 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 체외 기능을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

이 프로토콜의 목적은 배아 조직 이식 기술을 사용하여 Cas9 돌연변이 공여자 조직에서 유래한 haploid 앞다리를 가진 키메라 액록톨을 생산하는 것입니다.

배아 이식을 통해 돌연변이 Haploid 사지를 가진 키메라 색소꽃의 생성

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

이 문서는 반 복제 배아의 건설을 위한 정액을 대신하기 위하여 parthenogenetic haploid 배아 줄기 세포의 사용을 입증하는 것을 작정입니다.

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

세포의 해출 및 이식과 같은 배아 조작은 초기 발달을 연구하기 위한 중요한 도구입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 이러한 조작을 수행하기 위해 간단하고 효과적인 이식 장치를 설명합니다.

Zebrafish 배아를 위한 간단하고 효과적인 이식 장치

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

여기에서는 배아 줄기 세포를 사용하여 유전자 변형 마우스 모델, 특히 대형 DNA 녹인 (KI)을 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 조정되어 기존의 상동 재조합 매개 선형화된 DNA 표적화 방법에 비해 KI 효율이 크게 향상되었습니다.

유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

배우세요 Xenopus 원시 생식 세포 이식을 활용한 CRISPR/Cas9 기반 leapfrogging 기법으로 필수 유전자 돌연변이 계통을 효율적으로 생성하는 방법을. 이 기술은 F1 세대에서 동형 결합성 널 돌연변이체를 얻어 배아 발생에서 치명성을 극복합니다.

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

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