Name: 질소 현상과 차등 원심 분리 배양된 세포의 주변 막 단백질의 분포를 모니터링 가능 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 배우세요 질소 현상을 이용한 세포 균질화법으로 막 주변 단백질을 정확하게 분석하는 방법을. HGK293 세포에서 세제 없이 세포질과 막 단백질을 분리하여 내인성 단백질 분포를 재현성 있게 검출할 수 있습니다.

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이 작업은 GM055279, CA116034 및 CA163489에 의해 투자 되었다.

1. 버퍼 및 장비 준비 <ol><li>4 45 셀 중단 폭탄, 15 mL 튜브, 및 ultracentrifugation 튜브를 진정 ° c.</li>
	<li>준비 25 mL 당 4 ° C. 추가 한 protease 억제제 태블릿 사용 직전에 2 x 10 7 셀 균질 버퍼의 진정 하 고. 
	참고: 더 나은 NaCl 반영 세포내 소금 성분 보다는 오히려 균질 버퍼는 일반적으로 KCl를 포함. PH 7.4, 10mm KCl와 1.5 m m MgCl 2 (이 하 소형 균질 버퍼 라고도 함)에서 10 mM HEPES이이 프로토콜에 사용 되는 균질 버퍼에 의하여 이루어져 있다. 대부분 버퍼 질소 현상에 대 한 적용할 수 있습니다 (내용 참조).</li>
	<li>준비 6 mL 당 4 ° C. 추가 protease 억제제 정제 사용 하기 전에 신선한에 샘플 Phosphate-Buffered 염 분 (PBS) 버퍼 x 1의 진정 하 고. 
	참고:이 프로토콜에 사용 되는 PBS 버퍼 pH 7.4, 1.8 m m KH 2 포 4, 137 mM NaCl, KCl 2.7 mM에서 10 mM 나 2 HPO 4 이루어져 있다.</li>
	<li>준비 4 ° C. 추가 한 protease 억제제 태블릿 사용 직전에 샘플 당 가용 화 버퍼의 4 mL를 진정 하 고. 
	참고:이 프로토콜에 사용 되는 가용 화 버퍼는 1 x Radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1 %SDS, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 및 1%에서 25 mM Tris 이루어져 있는 NP-40. 4.6를 참조 하십시오.</li>
</ol> 2. 수확을 셀 셀 형식에 대 한 <ol>10 9 조직 문화 셀 권장된 x <li>성장 2 x 10 7-10 문화 미디어. 일반적으로, 한 15 cm 접시 수익률 2 x 10 7 HEK 293 세포 90 %confluency ( 그림 1)에서 DMEM에 교양.</li>
	<li>진공에 의해 성장 매체를 제거.</li>
	<li>부착 셀 문화 요리에 얼음, 냉장된 균질 버퍼 두 번 (15 cm 접시 세척 당 당 10 mL 버퍼)으로 부드럽게 문화 요리에 직접 세포를 씻어 놓고 셀의 적절 한 볼륨에 큰 셀 스 크레이 퍼와 수확 균질 버퍼; 현 탁 액 셀에 대 한 수집 및 냉장된 균질 버퍼에 두 번 (10 mL 버퍼 세척 당 50 mL 문화 당) 5 분, 4 ° C에서 500 x g 스핀과 셀 펠 릿을 세척 하 고 얼음에 균질 버퍼의 적절 한 볼륨에 씻어 셀 펠 릿 resuspend. 참고: 볼륨 셀 중단 폭탄에 허용 최소/최대 볼륨으로 의도 된 실험에서 단백질 농도 대 한 요구 사항에 기반 해야 합니다. 일반적인 지침 2-10 배 10 7 셀/mL, 또는 세포의 약 10 볼륨 작은. 이 프로토콜은 균질 버퍼의 2 ml에서 HEK 293 세포의 3-15cm 요리에 대 한 최적화.</li>
</ol> 3. 질소 공동 현상은 <ol><li>전송 셀 서 스 펜 션 파문에 얼음 목욕에서 깨끗 하 고 냉장 폭탄 접시. 
	주의: 폭탄은 높은 압력, 낮은 온도, 질소 가스 &#8211; 착용 적절 한 개인 보호 .</li>
	<li>마이크로 자기 볶음 바 폭탄 안에 놓고 정지 동질성을 유지 하기 위해 저 어 접시에 설정.</li>
	<li>하나 protease 억제제 태블릿 정지를 추가 하 고 제조 업체 당 폭탄을 닫습니다 &#39; s 지시.</li>
	<li>점차 압력 제조 업체 당 질소 가스 탱크와 폭탄 &#39; 폭탄 압력 게이지까지 s 명령 300 ~ 600 psi를 읽습니다. 모든 밸브를 닫고 질소 탱크 분리. 
	참고: 필요한 압력 셀 유형으로 달라질 수 있습니다. 여기 우리는 HEK 293, NIH-3T3과 Jurkat 세포에 대 한 350 ~ 400 psi에서 현상 수행.</li>
	<li>질소 분해 하 여 셀 내에서 평형에 도달 수 있도록 20 분 기다립니다.</li>
	<li>피복 수건을 사용 하 여 배출 밸브 주위 초과 물을 제거 합니다. Homogenate의 dropwise 릴리스를 달성 하 고 미리 냉장된 15 mL 튜브에 수집을 부드럽게 배출 밸브를 엽니다. 
	참고: 컬렉션의 끝에 근처 거기 homogenate의 분출 되며 가스 쉿 소리와 함께 나타날 것입니다. 가스 하지 않습니다 있는지 확인 이전 수집 원인은 튜브 촬영 cavitate (따라서 15 mL를 사용 하 여 튜브 1.5 mL 튜브 대신). 일단은 기 시작, 배출 밸브 닫고 갑자기 하 폭탄 depressurize 폭탄에 나머지 셀의 현상 질소 유입 밸브를 엽니다. 오픈에 대 한 폭탄 cavitate 복구 및 철저 한 청소. 
	참고: 마지막 cavitate 거품과 밀키 모양 위에 있어야 한다. 원심 분리 전에 가시고 거품 수 있도록 피 펫 팁으로 부드럽게 저 어. 
	참고: 단계 대조 현미경 검사 법 균질 효율을 결정 하 여는 cavitate를 검사 합니다. 15 µ L 드롭 추가 cavitate 현미경 슬라이드와 커버는 coverslip의 표면에. 반복 단계 3.4-3.6 너무 많은 경우에 손상 되지 않은 세포는 20 X 목표 발견. 
	참고: 균질 버퍼는 EDTA 또는 EGTA를 포함 하지 않으면, 그것에 추가 수집 된 후 5 분 이내 1 m m의 최종 농도에 cavitate.</li>
</ol> 4. Cytosolic와 막 분수 분리 손상 되지 않은 세포와 핵 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 <ol><li>분리기 500 x cavitate g. 
	참고: 없음 보이는 펠 릿 생산 원심 분리 단계를 반복 하 고 위에 떠 있는 거품을 피하 면 서 포스트 핵 표면에 뜨는 (PNS)를 수집 합니다. 필요한 경우 추가 수집 PNS, 결합 하는 거품을 다시 원심 ( 그림 1).</li>
	<li>관심의 분수를 원하는 대로 PNS를 처리 합니다. Cytosolic 분리 하 고 막 분수, 목적 ultracentrifuge 튜브에 PNS를 전송 하 고 원하는 대로 ultracentrifugation를 수행 합니다. 이 프로토콜에 대 한 최적화는 &#60; 3.5 mL 샘플 폴 리카 보 네이트 ultracentrifuge 튜브에서 및 ultracentrifugation 350000 x g 1 h 4에 대 한에 대 한 ° C.</li>
	<li>상쾌한 (S 분수) 1 mL 피 펫을 사용 하 여 수집.</li>
	<li>신중 하 게 그것을 방해 하지 않고 차가운 PBS의 3 mL와 펠 릿을 씻어. 진공으로 PBS를 제거. 
	참고: cytosolic 단백질에 의해 막 분수의 오염 샘플의 손실 보다 더 큰 관심사 인 경우에, 3 ml PBS 춥고 단계 4.2에서 다시 ultracentrifuge의 펠 릿을 resuspend. 진공으로 PBS를 제거.</li>
	<li>선택의 가용 화 버퍼 세제를 포함 하는 적절 한 볼륨에는 펠 릿을 완벽 하 게 resuspend. 셀 등가 달성 하기 위해 사용 하 여 가용 화 버퍼의 동일한 볼륨 cytosolic 분수. 
	참고: 효율적인 막 단백질 추출에 대 한 가용 화 버퍼 1 x RIPA 버퍼를 사용 하 여 것이 좋습니다. 없음 다운스트림 분석 결과 막 일부분에 대 한 필요한 경우, 1 x laemmli 샘플 버퍼를 사용 하 여 최대한 막 단백질 추출에 대 한. 
	참고: 좋습니다 dislodging 하 고 최대한 막 단백질 추출에 대 한 4 ° C에서 튜브 회전자에 깨끗 한 튜브를 가용 화 버퍼에 펠 릿을 전송. 
	참고: 펠 릿은 너무 끈 적 (너무 많은 지질) 일에서 효율적으로 제거 하는 경우가용 화 버퍼에서 e ultracentrifuge 튜브, 좋습니다 스냅 액체 질소에는 펠 릿을 동결 하 고 펠 릿 녹아서 전에 미니 금속 주걱으로 신속 하 게 ultracentrifuge 튜브에서 펠 릿을 dislodging. 
	참고: 또는, 막 펠 릿 그냥 resuspended 고 막 소포 서 스 펜 션, 어떤 경우는 원심 4.6 단계 필요 하지 않습니다 P 일부 생산 세제 포함 된 버퍼에 solubilized 하지. 이러한 P 분수는 막 협회에 의존 하는 효소 활동 등의 기능을 조사 하는 경우에 유용.</li>
	<li>4 시 10 분에 대 한 탁상 원심 분리기에 20000 x g에서 4.5 단계에서 완전히 solubilized 펠 릿 정지 원심 ° C. 상쾌한 1 mL 피 펫 (P 분수)를 사용 하 여 수집 하 고 펠 릿 (불용 성 지질) 삭제.</li>
	<li>Cytosolic 또는 막 분수와 서 부 럽 등 원하는 분석을 수행 하거나 나중에 사용-80 ° C에 저장.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

기계 장애의 다른 방법을 통해 질소 현상의 장점은 매니폴드입니다. 아마도 가장 중요 한 장점은 부드럽게 아직 효율적으로 균질 표본 하는 기능입니다. 생성 지역 난방 손상 대신 압축 냉각 샘플의 원리는 초음파 좋아하고 기술을 기반으로 마찰/전단. 공동 현상 또한 원형질 막 방해에 매우 효과적입니다. 질소 거품 감압, 현상 프로세스에 따라 각 개별 셀 내에서 생성 되는 제한 때문에 셀 크기에 의해 더 적은 크기 샘플 또는 샘플 농도. 따라서 정리 기반 Dounce 또는 바늘 통과 균질 추가적인 이점을 제공합니다. 질소 공동 현상은 또한 샘플에 걸쳐 균일 하 게 적용 되는 동일한 파괴적인 힘은 동일한 압력으로 재생 될 수 있다로 더 일관 된 결과 제공 합니다. 또한, 각 셀만 중단 프로세스 1 시간에 대 한 경험과 subcellular 구성 요소, 따라서, 아니라 끊임없이 노출 변수 파괴 세력. 이 세포의 artefactual 조각화를 제한합니다. 중단으로 인 한 불안정 세포 구성 성분의 산화에 대 한 우려 또한 완화, 질소 포화 세...

세포질 단백질 2 개의 종류로 분할 될 수 있다: 막과 하지 않은 그와 관련 된 그. 비 막 관련된 단백질 cytosol, nucleoplasm 및 바인딩과 그물 (ER) 같은 세포의 루미나에서 발견 된다. 두 가지 수준의 막 관련 단백질, 정수 및 주변을 확인 하 고 있습니다. Polypeptide 체인의 하나 이상의 세그먼트 걸쳐 멤브레인, 소수 성 아미노산의 구성 하는 α-나선으로 일반적으로 있기 때문에 완전 한 막 단백질은 막 횡단 단백질 라고도. 막 횡단 단백질 co-translationally 그들의 생 합성 과정에서 세포 막에 삽입 되 고 그래서 구성 된 catabolized는 그들이 때까지 남아. 주변 막 단백질 이차 세포 막 지질 같은 소수 성 분자와 포스트 번역 상 수정 때문에 일반적으로 구동 됩니다. 달리 완전 한 막 단백질, 세포 막의 주변 막 단백질 연관 가역 이며 통제 될 수 있다. 신호 경로, 그리고 멤브레인과 규제 협회에 많은 주변 막 단백질 기능 활성화 하거나 억제 하는 통로 대 한 메커니즘 중 하나입니다. 주변 막 단백질은 신호 분자의 한 예로 작은 GTPase RAS입니다. 포스트 번역 상 수정 수정 farnesyl 지질을 포함 하는 시리즈, 후 성숙한 RAS 단백질의 수정된 C-말단 세포 막의 세포질 전단지에 삽입 합니다. 특히, 플라즈마 멤브레인 RAS의 다운스트림 이펙터 RAF1를 종사 하는 곳입니다. 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK) 통로의 구성 적인 활성화를 방지 하기 위해 여러 수준의 RAS의 제어 장소에 있습니다. GDP를 GTP를 hydrolyzing에 의해 RAS 비활성 렌더링, 게다가 활성 RAS 또한 수 나올 원형질 막에서 수정 또는 solubilizing 신호를 억제 하는 요소와의 상호 작용. 막 협회의 평가 하는 중요 한 필요 남아 있지만 형광 라이브 영상 극 세포 생물학 형광 단백질 태그 주변 막 단백질1의 subcellular 지 방화를 관찰할 수 있는 기회, 간단한 생 화 확 적인 접근으로 세미 양적 생 단백질입니다.
단백질 막과 수용 성 분수 사이 분할의 적절 한 생 화 학적 평가 비판적으로 두 가지 요소에 따라: 세포 균질 및 효율적인 분리 막과 수용 성 분수. 가장 널리 상용화 키트를 포함 하 여 일부 프로토콜 세제 기반 셀 균질에 있지만, 이러한 메서드는 분석 난독 하 처리할 용 해 단계2로 막 단백질을 추출 하 여 수 있습니다. 따라서, 세포 파쇄의 세제 비 기반으로, 기계적 방법 청소기 결과 제공합니다. 셀 문화에서 성장 또는 혈액 이나 장기에서 수확의 기계적 장애의 여러 가지 방법이 있다. Dounce 균질, 정밀한 바늘, 볼 베어링 균질, 쥡니다 있으며 질소 현상 포함 됩니다. 여기 우리가 질소 현상 평가 하 고 다른 방법에 그것을 비교. 질소 공동 현상은 높은 압력 하에서 세포의 세포질에 녹아 있는 질소에 의존 합니다. 평형, 후 세포 현 탁 액 질소 거품 때문에 그들의 비등 셀 열고 눈물 세포질에 형성 되는 등 갑자기 대기압에 노출 됩니다. 압력이 충분히 높은 경우 질소 비등 수 핵3 고 막 바인딩된 세포 리소좀4처럼 됩니다. 그러나, 압력은 충분히 낮게 유지 되는 경우 감압 원형질 막 및 응급실만 하지 다른 organelles, 그로 인하여 cavitate5지정 된 homogenate에 cytosol와 그대로 세포질 세포를 흘리 고 중단 됩니다. 이러한 이유로, 질소 현상 리소좀과 미토 콘 드리 아와 같은 세포를 고립 시키기를 위한 선택의 방법입니다.
그러나, 막과 수용 성 부분으로 쉽게 분리 될 수 있다 homogenate를 준비 하는 훌륭한 방법 이기도 합니다. 탱크 그리고 가변 배출 밸브와 출구 포트에서 질소 가스의 배달에 대 한 입구와 높은 압력을 견딜 수 있는 두꺼운 스테인리스 케이싱 압력 용기 (이제부터 "폭탄"에 게 불리는) 공동 현상 동안에 사용에 의하여 이루어져 있다.
질소 공동 현상은 1960 년대6이후 셀 균질에 대 한 사용 되었습니다. 1961 년, 사냥꾼 및 Commerfold7 포유류 조직 장애에 대 한 실행 가능한 옵션으로 질소 공동 현상은 설립. 그 이후, 연구원은 다양 한 세포와 성공, 조직에 기술을 적응 및 질소 현상 막 준비8,9, 핵과 세포 기관이 포함 하 여 여러 응용 프로그램에서 고정 되고있다 준비10,11, 그리고 불안정 생화학 추출. 현재, 세포 생물학 더 자주 다른 방법을 채택 셀 균질 질소 균질의 장점을 널리 광고 되지 있다, 질소 폭탄 비싼 이며 셀의 비교적 큰 숫자는 오해 때문에 필수. 그대로 핵과 세포-무료 homogenates를 달성 하기 위해 질소 현상에 대 한 프로토콜 게시 되지 않은, 그리고 가장 게시 된 평가에서 볼륨 세포 현 탁 액의 20 mL의 사용 되었다. 이 고전적인 기법 소규모 샘플 작업의 현재 요구 사항에 맞게 적응 하 선물이 질소 공동 현상은 특별히 배양된 세포의 수정 된 프로토콜. 질소 공동 현상은, 후는 homogenate로 분리 된다 성 (S)와 막 (P) 분수 차등 원심 분리에 의해 먼저 핵 및 손상 되지 않은 세포를 제거 하는 저속 회전 급강하 그리고 고속 스핀 (&#62; 100000 x g) 분리 녹는 분수에서 막입니다. 우리 immunoblots는 분리의 효율을 분석 하 고 다른 기계적 장애 기술로 질소 현상 비교. 우리는 또한 질소 현상 중 균질 버퍼의 삼 투 효과 조사.

<table><tbody><tr><td>세포 파괴 용기 (45 mL)</td><td>Parr Instrument</td><td>4639</td><td>질소 캐비테이션 폭탄</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (2 mL)</td><td>Kontes</td><td>885300-0002</td><td>Dounce 유봉 및 튜브</td></tr><tr><td>U-100 인슐린 주사기 28G&frac12;</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td>Needle</td></tr><tr><td>Atg12 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>271688</td><td>Mouse 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>&beta;-actin 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>47778</td><td>마우스 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>&beta;-tubulin 항체</td><td>DSHB</td><td>E7-s</td><td>마우스 항체, 1:5000 희석</td></tr><tr><td>Calnexin 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>23954에서 사용</td><td>마우스 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>Calregulin 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>373863</td><td>마우스 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>Catalase 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>271803</td><td>마우스 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>CIMPR 항체</td><td>Abcam</td><td>124767</td><td>Rabbit 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>EEA1 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>137130</td> <td>사용마우스 항체, 1:1000 희석에서 사용</td></tr><tr><td>EGFR 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>373746</td><td>마우스 항체, 1:1000 희석에서 사용</td></tr><tr><td>F0-ATPase 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>514419</td><td>마우스 항체, 1:1000 희석에서 사용</td></tr><tr><td>F1-ATPase 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>55597</td><td>마우스 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>Fibrillarin 항체</td><td>에서 사용Santa Cruz</td><td>374022</td><td>마우스 항체, 1:200 희석</td></tr><tr><td>Golgin 97 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>59820</td><td>마우스 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>HDAC1 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>81598</td><td>마우스 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>Hexokinase 1 항체</td><td>사용 Cell Signaling Technology</td><td>2024S</td><td>토끼 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>Lamin A/C 항체</td> <td>사용Santa Cruz</td><td>376248</td><td>Mouse 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>LAMP1 항체</td><td>DSHB</td><td>H4A3-c</td><td>Mouse 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>Na+/K+ ATPase 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>48345</td><td>Mouse 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>Rab7 항체</td><td>Abcam</td><td>137029</td><td>Rabbit 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>Rab9 항체</td><td>Thermo</td><td>MA3-067</td><td>마우스 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>RCAS1 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>398052</td><td>마우스 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>RhoGDI 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>360</td><td>Rabbit 항체, 1:3000 희석</td></tr><tr><td>Ribosomal protein S6 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>74459</td><td>마우스 항체, 1:1000 희석</td></tr><tr><td>Sec61a 항체</td> 사용<td>Santa Cruz</td><td>12322</td><td>Goat 항체, 1:1000 희석에서 사용</td></tr><tr><td>Thickwall 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>초원심분리용 시료</td></tr>관 <tr><td>TLK-100.3 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>초</td><td>원심분리용 349481 로터</td></tr><tr><td>Optima MAX 대용량 개인용 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>364300</td><td>초원심분리기</td></tr><tr><td>cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>25cm 손잡이 및 3.0cm 블레이드가 있는 세포 스크레이퍼</td><td>Corning</td><td>353089</td><td>대형 세포 스크레이퍼</td></tr><tr><td>마그네틱 스티어 바</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57SIX</td><td>마이크로 교반 바</td></tr><tr><td>세라믹 탑 마그네틱 교반기</td><td>Fisher Scientific</td><td>S504501AS</td><td>마그네틱 교반기</td></tr></tbody></table>

질소 현상과 차등 원심 분리 배양된 세포의 주변 막 단백질의 분포를 모니터링 가능

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

배양된 세포는 주변 막 단백질을 포함 한 단백질의 subcellular 분포를 공부 하는 데 유용. 유전자 붙일 인코딩 태그 단백질 subcellular 단백질 분포의 연구를 혁명 있다. 그러나, 특히 단백질 부분적으로 cytosolic 때 형광 현미경 검사 법, 함께 분포를 계량 하기가 어렵습니다. 또한, 그것은 종종 내 생 단백질을 공부 하는 것이 중요입니다. 생화학 분석기 immunoblots 단백질 subcellular 분류 후 배포의 정량화에 대 한 황금 표준 남아 같은 분석 실험. Cytosolic 또는 특정 막 분수를 분리 하는 것을 목표로 상업 키트는,이 키트의 대부분 주변 막 단백질 세포 막에서 쉽게 추출 되는 공부에 적합 수 있는 세제와 추출 기반. 여기 우리 ultracentrifugation에 의해 질소 현상과 cytosolic와 막-바인딩 단백질의 후속 분리에 의해 세포 균질에 대 한 세제 무료 프로토콜 제시. 우리 다른 세포 유형, 전체에 녹는 subcellular 세포의 분리 및 펠 릿 분수를 확인 하 고 몇 가지 일반적인 세제 기반이 아닌 기계적 균질 방법 중에서 단백질 추출 비교. 질소의 여러 장점 가운데 현상 섬세 한 세포에 최소한의 물리적, 화학적 손상 세포 장애의 뛰어난 효율성입니다. Ultracentrifugation와 결합, 질소 현상입니다 cytosolic 사이 주변 막 단백질의 변화를 검사 하는 훌륭한 방법 막 분수.

그림 2 는 녹는 cytosolic 분수 (S) 또는 막 펠 릿 분수 (P) PNS에서 세포질 단백질의 분할을 보여 줍니다. 우리는 다른 종류에서 3 개의 대표적인 셀 라인 검사: HEK 293 (상피), NIH-3T3 (fibroblast) 및 Jurkat (림프 구). 로 구 아닌 분리 억제 물 (RhoGDI) 및 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CIMPR)에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용 되었다 cytosolic 막 분수, 각각. 우리에서 질소 현상 후 cytosol 그리고 막의 효율적인 분리 확인 ~ ultracentrifugation 350000 x g h 1에 이어서 소형 버퍼에서 350 psi. 발견 한 총 단백질 S 및 P 분수 다음 응급실, endosomes 리소좀, 미토 콘 드리 아, 골, 그리고 다른 세포에 대 한 마커를 분석 했다. 모든 막 횡단 단백질은 막 분수에 독점적으로, N...

여기 선물이 세제 무료 균질 ultracentrifugation에 의해 질소 현상과 cytosolic와 막-바인딩 단백질의 후속 분리에 따라 경작된 한 포유류 세포에 대 한 프로토콜. 이 방법은 주변 막 단백질 수용 성 사이 분할 모니터링을 위한 이상적인 막 분수.

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 배양된 세포를 최적으로 균질화하고, 세포 단백질이 막 분획과 수용성 분획 사이에서 어떻게 분배되는지 분석하는 것입니다. 이 방법은 세포 생물학의 핵심 과제 중 하나인 막 주변부 단백질의 세포 내 구획화를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세제(detergent)를 사용하지 않고도 고체 및 막 분획 내 내인성 단백질의 분배를 매우 정확하고 재현성 있게 검출할 수 있다는 점입니다.먼저, HGK293 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 DMEM에서 배양하여 15 cm 디쉬당 약 2 x 10⁷ cells의 수득률을 갖도록 90% 합생도(confluency)까지 배양합니다. 그 다음, 진공 흡입기로 배양액을 제거합니다. 이어서 배양 디쉬를 얼음 위에 놓고, 디쉬당 10 mL의 차가운 균질화 완충액(homogenization buffer)으로 세포를 가볍게 2회 세척합니다.세척 후, 적절한 부피의 균질화 완충액을 사용하여 대형 세포 스크래퍼로 세포를 회수합니다. 그다음, 교반기 위의 얼음조에 놓인 깨끗하고 미리 냉각된 세포 파쇄기(self destruction bomb)로 세포 현탁액을 옮깁니다. 현탁액의 균질성을 유지하기 위해 파쇄기 내부에 마이크로 자성 교반자를 넣고 교반기를 작동시킵니다.그 후, 현탁액에 프로테아제 억제제 정제 1정을 첨가하고 제조사의 지침에 따라 봄브(bomb)를 닫습니다. 이때 봄브가 제대로 닫히도록 O링을 위로 밀어 올리는 중요한 단계를 반드시 수행해야 합니다. 완료되면 제조사의 지침에 따라 질소 가스 탱크를 이용해 압력계의 수치가 300에서 600 PSI 사이가 될 때까지 봄브의 압력을 점진적으로 높입니다. 원하는 압력에 도달하면 모든 밸브를 잠그고 질소 탱크를 분리합니다.질소가 세포 내로 용해되어 평형 상태에 도달할 때까지 20분 동안 유지합니다. 다음으로, 일회용 와이프를 사용하여 배출 밸브 주변의 과도한 물기를 제거하고, 밸브를 천천히 열어 균질액이 한 방울씩 배출되도록 하여 미리 냉각시킨 15 milliliter 튜브에 수집합니다. 공동 현상으로 인해 상단에 거품이 있고 우윳빛을 띠는 외관을 확인합니다.가압 과정 중에는 충분한 수용 용량을 가진 수집 튜브에 밸브를 통해 천천히 배출하여 수집함으로써 단순 손실을 방지하는 것이 중요하며, 이때 튜브는 수집 종료 시점에 발생할 수 있는 갑작스러운 배출에 대비하여 최적의 위치에 배치

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 동영상은 세포 내 뉴클레오티드 2차 메신저 결합 단백질의 체계적인 고처리량 스크리닝 기술인 리간드 분석의 차등 방사형 모세관 작용을 보여줍니다. 이 기술은 세포 용해물에서 과발현된 표적 단백질에 메신저를 직접 결합할 수 있게 하여 단백질 정제의 필요성을 우회할 수 있습니다.

리간드 분석의 차등 방사형 모세관 작용: 박테리아 뉴클레오티드 2차 메신저 결합 세포 내 단백질을 식별하기 위한 고처리량 기술

여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

여기에서는 단백질의 형광 강도를 적절한 내부 표준물질의 농도로 정규화하여 중심체에서 단백질의 수준 변화를 측정하기 위해 새로운 정량적 형광 분석법이 개발되었습니다.

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

여기, 선물이 원형질 막, 세포질 및 고속 원심 분리의 사용 없이 U937 세포의 미토 콘 드리 아를 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 정화 subcellular 분수 immunoblotting 통해 단백질 지역화의 후속 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

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이 분획 프로토콜을 통해 연구자들은 포유류 세포에서 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막 단백질을 분리 할 수 있습니다. 후자의 2 개의 세포 내 분획은 isopycnic 밀도 구배를 통해 추가로 정제됩니다.

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고세포 밀도 생물반응기를 이용한 실시간 정량적 세포내 NMR에 의한 인간 세포에서의 단백질-리간드 상호작용 모니터링

이 논문은 지질 막의 중성자 스핀 에코 (NSE) 연구에서 샘플 준비, 데이터 감소 및 데이터 분석을위한 프로토콜을 설명합니다. 지질의 현명한 중테리움 라벨링은 중요한 생물학적 과정이 발생하는 중전 길이와 시간 척도에 대한 다양한 막 역학에 접근할 수 있게 합니다.

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비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

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