Name: Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 학습하세요 생쥐 대동맥 형태발생을 연구하는 in vivo 클론 분석 및 운명 매핑 기법을 활용하여 혈관 질환의 병인을 규명하는 방법을. 이 기술은 혈관 질환 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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우리 감사 딘 리 대동맥 SMC 격리에 대 한 그의 실험실의 프로토콜을 공유. 미국 심장 협회는 건강의 국가 학회 (R21NS088854, R01HL125815, 및 D.M.G R01HL133016)에 의해 제공 된 지원 자금 (D.M.G.에 특정 14GRNT19990019), 예일 대학 (브라운-기술혁신 화목 오전 및 시작 D.M.G.에 기금)입니다.

모든 마우스 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 예일 대학에 의해 승인 됩니다.
 1. Vivo에서 배아 운명 매핑 및 클론 분석 참고: 우리는 이러한 접근 널리 평가 하 사용 셀과 그들의 클론 아키텍처 개발 및 질병 모델에서의 유래 7 , 8 , 9 , 10. <ol><li>는 크리스챤와 쥐와 쥐 Cre 기자와 사이 짝짓기 설정. 
	참고:는 있다 SMC 표시; 사용 됩니다. Myh11-CreERT2 또는 Acta2 CreERT2 마우스 11 , 12 주로이 목적을 위해 사용 됩니다. 우리는 광범위 하 게 배아 조직 표시 ROSA26R CreERT2 마우스 13를 이용 했다.
	<ol><li>클론 분석에 대 한 멀티 컬러 Cre 기자 (예를 들어, 색종이 또는 무지개 [Rb] 쥐) 8 , , 14 15를 사용 하 여 운명 매핑의 사용 하는 단색 Cre 기자 (예를 들어, ROSA26R-YFP 마우스 16) 또는 두 배 색깔 Cre 기자 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17. 
		참고:이 번 식 체계를 사용 하 여 성인 쥐를 2-6 개월 (일반적으로 30 ~ g)는 크리스챤과 Cre 기자 배아를 생성 합니다.</li>
	</ol></li> <li>금속을 사용 하 여 아침에 질 플러그 프로브 및 배아 일 (E) 0.5로 플러그 감지 당일 정오 고려 검사.</li>
	<li>플러그 감지 되 면 남성에서 여성을 분리.</li>
	<li>준비 4-오-tamoxifen 고 tamoxifen 작업 솔루션.
	<ol><li>4-오-타 목 시 펜에 대 한 100% 에탄올, 소용돌이 2 분의 50 µ L에 5 mg을 녹이 고 옥수수 기름의 450 µ L를 추가 합니다. 얼음, 샘플 냉각 될 때까지 주기 사이 휴식 10 s 사이클에 대 한 출력 레벨 2에서 sonicate. 샘플은 완전히 용 해 후 (보통 ~ 쥡니다의 4-5 주기), sonicated 솔루션의 200 µ L 고 1800 µ L의 최종 작업 솔루션 (4-오-tamoxifen, 1 mg/mL) 옥수수 기름에 용 해.</li>
		<li>그것 해산 때까지 tamoxifen에 대 한 100% 에탄올과 소용돌이에 50 mg/mL로 희석. 최종 작업 솔루션 (tamoxifen, 10 mg/mL)을 그것 완전히 용 해 되도록 45 ° C에서 저를 옥수수 기름에 희석.</li>
	</ol></li> <li>초기 배아 유도 주입 4-오-tamoxifen intraperitoneally 임신 댐.
	<ol><li>4-오-tamoxifen 주사 (임신 마우스, 또는 대략 5 mg/kg 체중 당 최대 ~ 150 µ g)를 사용 하 여 E5.5 및 이후 그들은 항복 가능한 댐, 배아, 그리고 새끼.</li>
		<li>0.5-1.5 m g (또는 17-50 mg/kg) 댐에서 태아와 임신에 대 한 복용량에서 사용 tamoxifen ~ E9 이후. 30g 바늘을 사용 하 여 모든 주사. 
		참고: 0.22 μ m 필터를 통해 여과 주입 전에 모든 혼합물을 소독을 일반적으로 사용 된다. </li></ol></li> <li>클론 분석을 위한 사용 4-오-tamoxifen (예를 들어, 5 mg/kg) 또는 (예를 들어, 50 mg/kg) 여러 셀을 표시 하려면 tamoxifen의 고용량의 복 주사.
	<ol><li>개별 셀, 같은 (즉, 대동맥)의 조직에서 거의 모든 배아 (아래와 같이이 섹션의 끝에) 분석 없음 표시 하는 셀 또는 셀만 4 오 타 목 시 펜 이나 tamoxifen 복용 아래로 적정 하 단일 색상; 이것은 임계값 복용량.</li>
	</ol></li> <li>중앙 늦게 임신 기간에 셀을 표시 하 고 추적 그들의 운명 또는 출생 후 마우스에서 clonality를 주입 호르몬 임신 댐의 복 강에 수반 1:2 (황 체 호르몬: tamoxifen) tamoxifen을 복용량 비율. 
	참고: 타 목 시 펜 복용은 17-50 mg/kg 및 황 체 호르몬 투여는 8.5-25 mg/kg (즉, tamoxifen 복용량의 절반). 황 체 호르몬 주사는 1 ~ 2 일에 의해 노동 지연 될 수 있습니다.</li>
	<li>Euthanize 댐 댐 솜 또는 거 즈를 포함 하는 소켓에 배치 됩니다 오픈 놓기 방법을 사용 하 여 원하는 나이의 태아와 임신 undiluted isoflurane와 젖 었. 흉 강 매를 유도 하 여, 중요 한 장기를 제거 하 여 또는 자 궁 경부 전위를 수행 하 여 죽음을 확인 하십시오.</li>
	<li>정화 70% 에탄올과 복 부. 가 위를 사용 하 여 자르면 복 부와 자 궁 밖으로 해 부. 자 궁에서 태아를 제거 하 고 신중 하 게 태 반 및 노른자위 sac 집게를 사용 하 여에서 배아를 분리.</li>
	<li>E15 이상 배아를 자 궁 경관 탈 구 또는 잘린 수술가 위 또는 날카로운 칼 날을 수행 하 여 안락사. 
	참고: 배아 E15 보다 빠르게 죽는 어머니의 안락사 또는 어머니에서 배아의 제거 다음.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 PBS에 배아를 놓고 있다 고 Cre 기자에 대 한 유전자 형을가 위를 사용 하 여 꼬리의 작은 조각을 잘라.</li>
	<li>PBS에 세 번 배아 2 h. 워시 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 배아를 수정 하 고 15 mL 튜브에, 그들은 싱크대까지 기다리고 이틀까지 걸릴 수 있습니다는 PBS에서 30% 자당에 태아를 품 어.</li>
	<li>채우기 플라스틱 동결 최적의 절삭 온도 (10 월) 복합 최대 레벨의 2/3를 주조한 다. 형, 상 온 (RT) 거품을 최소화 하기 위해 10 분 동안 10 월 품에 완전히 빠져들에 각 배아를 세로로 배치.</li>
	<li>조직 블록을 드라이 아이스, 70% 에탄올 목욕 동결에 똑바로 고정 하는 장소. -80에서 블록 저장 ° c.</li>
	<li>는 Cryostat 온도-22 ° C를 설정 하 고 전체 대동맥, 10-20 µ m 두께 통해 가로 섹션을 생성 하는 블록을 잘라. -80에서 그들을 저장 하기 전에 30 분 동안 RT에서 슬라이드 건조 ° c.</li>
	<li>녹여 fluorophores의 표백 피하기 위해 빛에서 보호 하는 RT에 슬라이드. 워시와 PBS Tween20 슬라이드 0.1%.
	<ol><li>클론 분석, 핵 (DAPI, 5 mg/mL)에 대 한 슬라이드를 얼룩 및 직접 레인 보우 Cre 기자에 다른 fluorophores 이미지 (하늘색: 433-nm 여기 최대, 475 nm 방출 최대; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
		<ol><li>Fluorophores 직 립 형광 현미경으로 감지에 대 한 다음 필터 사용: DAPI (여기 맥스/대역폭 350/50 nm, 방출 최대/대역폭 460/50 nm), 리안 (여기 436/20 nm, 방출 480/40 nm), 텍사스 레드 (여기 560 / 40 nm, 방출 630/75 nm) 및 mOrange (여기 577/10 nm, 방출 630/50 nm)에서 mCherry를 별도의 사용자 지정 필터.</li>
		</ol></li> <li>MTmG Cre 기자와 운명 매핑, GFP를 감지 (484 nm, 510 nm), 직접 이미징 하거나 immunostaining를 사용 하 여. (여기 470/40 nm, 방출 525/50 nm) GFP 필터를 사용 하는 직 립 형광 현미경으로 이미징.</li>
		<li>Immunostaining에 대 한 섹션 4 ° C에서 하룻밤 1 차 항 체를 품 어 0.1% 트라이 톤 X-100 PBS에 세척 하 고 다음 1 h. 안티 CD31 사용에 대 한 2 차 항 체로 품 어 (최종 농도 0.0016 mg/mL), 안티-GFP (0.006 mg/mL)와 Cy3-직접 활용된 안티-SMA (최종 희석 1: 500) 주 항 체 및 사용 보조 antibodie직접 fluorophores (최종 희석 1: 500) (테이블의 자료를 참조)를 활용 하는 s.</li>
	</ol></li> <li>직 립 형광 현미경으로 슬라이드 이미지 (확대: X-20 X 4) 또는 confocal 현미경 (10 X-63 X). 높은 확대에 대 한 사용 하 여 오일 목표 x confocal 영상 63 1.4-0.6의 숫자 조리개와 1024 x 1024 픽셀의 프레임 크기.</li>
</ol> 2. 배아 대동맥 문화 explant 참고:이 접근은 이전 integrin beta3 explanted는의 협에서의 역할을 평가 하는 데 사용 됩니다 Eln (-/-) 배아 대동맥 9 , 18. <ol><li>위의 단계 1.8에 의하여 초과 isoflurane 흡입에 의해 E15.5에 초과 임신 댐 안락사.</li>
	<li>수확 및 위에 1.9-1.10, 단계에 따라 배아를 안락사.</li>
	<li>태아 supinely 놓고 해 부 보드 확장된 사지를 고정 합니다. 해 부 stereoscope와 시각화 및 위 가슴에 흉 골을 통해 복 부 로부터 수직 절 개를 잘라가 위를 사용 하 여 있습니다. Thymus, 멀리 해 부 기관지, 폐, 식도, 간, 그리고 대 장.</li>
	<li>부드럽게 ventrally 집게를 사용 하 여 심장 내과 흉부 및 복 부 구멍의 지 측면에서 대동맥 해 부를 위를 사용 하 여. 대동맥을 출시, 근 위 루트와 원심 복 부 위치에서 잘라.</li>
	<li>셀 문화 후드에 얼음 처럼 차가운 살 균 PBS에 대동맥을 놓습니다. 24-잘 접시에 대동맥을 전송 하 고 0.5 %DMEM 문화 FBS 37에서 최대 24 h에 대 한 ° C. 
	참고: 문화 매체는 차단 항 체 (0.02 mg/mL 9 예를 들어, 안티 integrin αvβ3 항 체, 참조 테이블의 재료) 또는 약리 에이전트와 함께 보완 될 수 있습니다.</li>
	<li>대동맥 PBS로 두번 세척 하 고 20 분에 대 한 4 %paraformaldehyde 수정</li>
	<li>세척 3 회 PBS 및 대동맥 30 %1.5 mL 튜브에 PBS에 자당. 대동맥 싱크 후 만들고 냉동된 조직 블록, 컷된 섹션, immunostain, 위에 1.13-1.15, 단계에서 설명한 대로.</li>
</ol> 3. Perinatal 대동맥에서 SMC 격리 참고:이 방법은 현재 사용 되 고 Eln (-/-)와 wildtype perinatal 쥐에서 분리 대동맥 SMCs의 생물학 비교.
<ol><li>는 murine pup 출생 후 하루 (P)에 0.5, 자 궁 경관 탈 구 또는 수술가 위로 잘린 또는 1.10, 단계에서 설명한 대로 날카로운 칼 날 위에 Euthanize.</li>
	<li>는 2.3 단계를 수행 하 고, 흉부와 복 부를 연 후 23 G 바늘 왼쪽된 심 실 펑크. PBS는 중력에 의해 좌 심 실으로 흐르고 그렇게 PBS 포함 된 무 균 주사기 바늘 연결을 사용 하 여 플라스틱 튜브 높은 위치에서 수직으로 개최. 간 blanches 때까지 좌 심 실에 살 균 PBS의 주입을 허용 합니다.
	<ol><li>집게를 사용 하 여 대동맥의 외부에 adventitial 조직을 제거 하 여 2.4 단계에서 설명한 대로 대동맥 해 부.</li>
	</ol></li> <li>DMEM의 단일 솔루션에 대동맥을 소화 (500 µ L) 보충 225 U/mL 콜라, 2.25 U/mL elastase, 및 1 x 37 ° C. 수동으로 쉐이크에서 45 분에 대 한 항생제 antimycotic 튜브 5-10 분 마다</li>
	<li>멸 균 셀 문화 후드, titurate 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 200 µ L 피 펫으로 아래로 pipetting으로 소화 조직. 단일 세포 현 탁 액 15 mL 튜브에 전송 DMEM의 2 개 mL를 추가 하 고 25에서 5 분 동안 920 x g에서 원심 ° c.</li>
	<li>폐기는 상쾌한. SMC 문화 매체 (DMEM 10% FBS 1 µ g/mL rhFGF, 10 µ g/mL rhEGF, 100 U/mL 페니실린/스와 2.5 µ g/mL 암포 B 보완 포함) 3 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 35 m m 문화 접시에 전송. 
	참고: 초기 격리 시 ~ 400000 셀에서에서 얻을 수 있습니다 단일 P0.5 wildtype 대동맥; ~ 이러한 세포의 300000은 SMCs.</li>
	<li>37 ° C에서 세포를 배양 하 고 신선한 SMC 문화 매체 3 일 마다 변경 합니다. 트립 신으로 표준 기술을 사용 하 여, 셀 때 confluent 통로. 실험, 구절 3-7에서에서 셀 사용.</li>
</ol> 4. 피하 임신 (또는 비 임신)에 삼 투 미니 펌프 배치 마우스 참고:이 접근은 이전 약리 에이전트 (예: integrin β3 및 β5 억제제를 지속적으로 제공 하는 데 사용 됩니다 cilengitide) 배아 utero에서 9. 펌프 E13.5에서 임신 댐에 삽입 하 고 출산 때까지 유지 되었다.
<ol><li>Anesthetize 유도 및 유지 보수에 대 한 1-3% 산소 (1 L/min의 유량)에 2-5 %isoflurane 쥐. 발가락-핀치 반사를 사용 하 여 마 취의 수준을 모니터링 하 고 필요에 따라 마 취 에이전트를 조정 합니다. 무 통을 위한 피하 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg) 관리.</li>
	<li>는 클리퍼 스와 함께 허리를 면도. 무 균 커튼, 장갑, 그리고 악기를 사용 하 고 수술 하는 동안 난방 외과 접시에 쥐 유지.</li>
	<li>경향이 위치에 각 마우스를 배치 하 고 뒷면 betadine 이소프로필 알콜 다음 스크럽. Rostral 허리에서 꼬리의 기초에 대략 3-5 cm 가로 피부 절 개를 0.5-1.0 c m 기본 근육 부상 없이 길이 메스를 사용 하 여.</li>
	<li>Hemostat 턱을 개폐 하 여 펌프 주입에 대 한 rostrally 피하 주머니 만들고 절 개 한 hemostat 삽입.</li>
	<li>채우기 선택, 제조자에 의하여의 에이전트와 함께 삼 투 미니 펌프 &#39; s 지침 (재료의 표 참조). 주머니에 가득된 펌프를 삽입 하 고 클립 또는 6-0 비 흡수 봉합 절 개를 닫습니다. 총 수술 시간은 10 분 미만 인지 확인</li>
	<li>는 post-operatively, 그들 sternal recumbency에서 복구 될 때까지 15 분 마다 마우스를 모니터링 합니다. 48 h에 대 한 모든 6-12 h 피하 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg)를 관리 합니다. 쥐 완전히 전신 마 취에서 회복 때 그들을 매일 모니터링 합니다. 클립을 제거 하거나 봉합 수술 후 7-10 일.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Murine 대동맥과 동맥 경화 증의 모델 등의 성인 병 적인 조건에 그것의 주요 분 지의 광범위 한 조사와 달리 덜는 morphogenesis와 배아와 perinatal 대동맥의 병 인에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리 배아 perinatal 대동맥, 특히 SMCs에 집중 하 고 제공 하는 프로토콜을 vivo에서, 조직 explant 통해 대동맥 공부와 SMC 격리 접근. 이러한 무료 방법 제공 배아 perinatal 대동맥 공부를 다양 한 방법으로 조사 합니다.
클론 분석은 개별 셀의 동작을 조사할 수 있도록 하는 매우 강력한 방법입니다. 최근 폐 맥 관 구조10전문된 SMCs를 식별 하는 데이 방법을 사용 했습니다. 그것은, 멀티 컬러 Cre 기자를 들고는 개별 마우스에는 같은 색의 세포 수 이상의 재조합 이벤트에서 파생 되는 기회를 인식 하는 중요 한. 따라서, 멀티 컬러 기자와 클론 분석 수많은 쥐의 평가 필요...

세포에 영양분과 산소를 제공 하는 다세포 생물 기능의 순환 시스템에 있으며 하지 외부 환경 접촉이 세포에서 폐기물 및 이산화탄소 제거 하. 척추 동물, 심장, 혈관의 시리즈를 통해 혈액을 펌프 기본 순환 시스템에 의하여 이루어져 있다. 동맥과 정 맥, 같은 큰 혈관의 벽 3 계층 구성: 나) intima, 또는 내부 층의 내 피 세포; 2) 미디어, 또는 원주 교류의 중간 층 길쭉한 SMCs 부드러운 근육 세포 및 탄성 lamellae; 그리고 iii) adventitia, 또는 결합 조직과 섬유 아 세포의 바깥 레이어. 혈관 생물학에서 연구의 대부분 신생 통해 새로운 내 피 세포 늘어선 관의 형성을 조사 하 고, 내 피 세포에 초점. 비교에서는, SMCs 상대적으로 작은 관심을 받을. 그러나, SMCs는 정상적인 동맥 벽의 건축에서 및 혈관 병 리에 중요 한 세포 유형입니다.
대동맥에서 심장의 좌 심 실 심장 출력을 받는 본문에 큰 구경 동맥입니다. 그것은 아 테 롬, 동맥, 및 해 부를 포함 하 여 다양 한 인간 질병에 의해 시달리 다. 성인 유기 체, 대동맥 및 그 주요 분 지는 심각 하 게 공부 하지 혈관 질환의 모델. 예를 들어, 인코딩 apolipoprotein E, 또는 저밀도 지 단백질 수용 체 유전자에 대 한 null이 쥐를 먹이 하는 고 지방 규정식 아 테 롬, 개발 하 고 최근 운명 매핑 연구 나타냅니다 기존의 SMCs에 여러 세포 유형을 일으키는 동맥 경 화성 플 라크1. 대동맥 동맥 류, 병 적인 변경 SMC apoptosis와 세포 외 매트릭스2,3개조를 포함.
실질적으로 더 적은 배아 및 perinatal 기간 동안 SMC morphogenesis 및 병 인에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리는 배아 및 perinatal 대동맥 SMCs에 vivo에서, 고립 된 세포와 조직 explants에서 공부에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 예를 들어, 프로토콜의 첫 번째 섹션 구분 운명 매핑 및 미 발달 쥐에 클론 분석. 특정 셀의 표시 및 그들의 자손4,,56; Cre recombinase 셀 전용 모터의 제어 아래 표현 용이 그러나, 휴대 전용 라벨의 일시적인 제어에 쥐에 배아 개발 하는 동안 전하실 수 있습니다. 이러한 맥락에서 SMCs (e.g.,Myh11 또는 Acta2)와 Cre 기자 활성 발기인에서 조건부 있다 표현 하는 배아 우리 tamoxifen 또는 그 활성 대사 산물 4-오-tamoxifen 임신 댐에서 주입 방법 제공 태아 나 산 후 자손에 레이블이 지정 된 셀을 분석을 위한. 또한, 운명 매핑 연구, 어느 주로 단일 기자 fluorophore1,7Cre 기자 활용, 달리 클론 분석은 실질적으로 향상 된 멀티 컬러 Cre 기자.
프로토콜의 두 번째 및 세 번째 섹션 분리 하 고 배양 배아 대동맥 explants 및 신생아에서 대동맥 SMCs 각각에 대 한 방법을 설명 합니다. 이러한 접근 허용 신호 경로, 특히 대동맥 explants 또는, SMCs의 조작에 대 한 분석을 위한 약리학 대리인의 직접 효과. 따라서, 관심의 조직에 있는 특정 한 유전자의 역할 쥐에서 전통적인 유전자 조작을 통해 보다 훨씬 더 빠른 방식에서 상영 될 수 있습니다. 또한, 고립 된 SMC 연구 세포 이동의 분석을 촉진 하 고 기술적으로 접착 제한 에 비보.
마지막으로, 네 번째 프로토콜 섹션 구분 (또는 비 임신) 임신한 쥐에 약리 에이전트와 함께 로드 피하 삼 투 미니 펌프의 배치. 이 방법은 빠른 대사 때문에 지속적인 주입을 요구 하는 에이전트에 의해 발생 하는 배아 발달에 미치는 영향의 분석을 촉진 한다. 잦은 주사의 대안 많은 에이전트에 대 한 실용적 이며 피해 야 한다, 그것은 임신 댐에서 상당한 불편을 발생할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>타목시펜</td><td>시그마</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>옥수수 기름</td><td>시그마</td><td>C-8267</td><td>타목시펜</td></tr><tr><td>4-OH-타목</td>시<td>펜 시그마</td><td>H7904</td> 타목시펜 프로게스테론<td>의 활성 대사 산물</td></tr><tr><td></td><td>시그마</td><td>P8783-5G</td> 타목시펜 OCT 화합물 사쿠라 조직 tek 4583<td>의 절반 농도에서 사용</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>cryoblocks 만들기 위해</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Polysciences inc</td><td>18986</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>핵의 IHC 염색, 최종 농도 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Cy3 직접 접합 항-SMA 항체</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>IHC 염색, 최종 희석 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD31 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>GFP의 IHC 염색, 최종 농도 0.006 mg/mL</td></tr><tr><td>CD31의 Anti-GFP 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11121</td><td>IHC 염색, 최종 농도 0.0016 mg/mL</td></tr><tr><td>2차 항체 염소 항토끼, Alexa 647</td><td>Life Technologies</td><td>a21244</td><td>IHC 염색, 최종 농도 0.004 mg/mL</td></tr><tr><td>2차 항체 염소 항토끼, Alexa 488</td><td>Life Technologies</td><td>a11008</td><td>IHC 염색, 최종 농도 0.004 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>안티 인테그린 베타3 차단 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>553343</td><td>Clone 2C9. G2, 최종 농도 0.02 mg/mL</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>44H14977A</td><td>대동맥 소화용</td></tr><tr><td>엘라스타제</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>34K15139</td><td>대동맥 소화용</td></tr><tr><td>항생제-항진균제(100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF</td><td>Promega</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>재조합 human EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>Alzet 삼투압 미니 펌프</td><td>Durect Corporation</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE 80i Upright 형광 현미경</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; TCS&nbsp; SP5</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson Sonifier 450</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myh11-CreERT2 마우스</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>19079</td><td></td></tr><tr><td>Acta2-CreERT2 마우스</td><td></td><td></td><td>Pierre Chambon 박사와 Daniel Metzger</td></tr><tr><td>ROSA26R-CreERT2 마우스</td> 실험실에서 획득 <td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>8463</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(mTmG/mTmG) 생쥐</td><td>잭슨 연구소&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>026862</tr><tr><td>ROSA26R(EYFP/EYFP) 마우스</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>&nbsp; 006148&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(색종이/색종이) 마우스</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>13731</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(Rb/Rb)</td><td>Irv Weissman</td><td></td> 박사 생쥐 연구실 <td>Irv Weissman 박사 연구실에서 입수</td></tr></tbody></table>

morphogenesis 배아 및 perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 vivo에서 , 조직 및 세포 explant 접근을 사용 하 여

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

대동맥은 신체에서 가장 큰 동맥 이다. 대동맥 벽 내 피 세포의 내부 계층, 탄성 lamellae 그리고 부드러운 근육 세포 (SMCs)의 중간 층 및 외부 층의 섬유 아 세포와 세포 외 매트릭스의 구성 됩니다. 성인 대동맥에 병 적인 모델 (예: 동맥 경화 증)의 광범위 한 연구와 달리 훨씬 덜 배아 및 perinatal 대동맥에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리가 초점을 SMCs는 morphogenesis의 분석 및 배아와 perinatal 대동맥 SMCs 정상적인 개발 및 질병의 병 인에 대 한 프로토콜을 제공. 특히, 포함 하는 4 개의 프로토콜은: 나) 배아 운명 매핑 vivo에서 및 클론 분석; ii) explant 배아 대동맥 문화; iii) SMC 별개로 perinatal 대동맥; 그리고 iv) 임신 (비 임신) 쥐에 피하 삼 투 미니 펌프 배치. 따라서, 이러한 접근 origin(s), 운명, 그리고 대동맥 vivo에서 SMCs의 클론 아키텍처의 조사를 촉진 한다. 약리학 대리인에 지속적인 노출에 의해 배아 대동맥 morphogenesis에서 utero에서 변조에 대 한 수 있습니다. 또한, 고립 된 대동맥 조직 explants 또는 대동맥 SMCs muscularization, 확산, 마이그레이션 등 기본적인 프로세스 동안 특정 유전자 목표의 역할에 통찰력을 얻을 하는 데 사용 될 수 있습니다. 격리 된 SMCs explanted 대동맥에 이러한 가설 생성 실험 다음 약리 및 유전 접근을 통해 생체 내에 컨텍스트에서 평가 수 있습니다.

대표 클론 분석에서 SMCs의 Eln (세포 외 기질 단백질 엘라 스 틴을 인코딩 하는 유전자)에 돌연변이 체 배아에에서, Eln(+), Acta2-크리스챤T2 쥐 Eln(+) 쥐도 들고 성관계 했다는 멀티 컬러 ROSA26R(Rb/Rb) 기자. 1 단계에서 설명한 대로 플러그 했다 확인 하 고 임신 댐 했다 E12.5에 단일 tamoxifen 주입 (1.5 mg)으로 유도 한 그들은 E18.5에 희생 했다. 배아는 수확, 고정, 고정 및 genotyped 했다. 하강 대동맥 cryosections 가로 절단 했다. Eln(+), Acta2-있다T2에서 섹션 ROSA26R(Rb / +) 배아 나타냅니다 초과 내부 레이어 SMCs는 Eln</em...

배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

이 절차들의 전반적인 목표는 정상적인 발달 과정 중 배아 및 출생 전후 대동맥벽의 형성과 질병 발생 시 이 과정에서 나타나는 교란을 연구하는 것입니다. 이 방법은 배아 및 출생 전후 혈관 중층(vascular medium)에 기여하는 세포의 기원이 무엇인지와 같이 혈관 발달 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 배아 및 출생 전후 발달 단계에서 발생하는 평활근의 병인 및 형태 형성을 평가할 수 있다는 점입니다.이러한 기술의 함의는 과도한 평활근 세포 생성을 유발하는 주기적 질환인 대동맥판상 협착증과 같은 혈관 질환의 치료로 이어집니다. 미니 펌프 삽입 절차는 예일 대학교의 미세수술 코어를 총괄하는 연구 과학자인 Jiasheng Zhang 박사에 의해 수행됩니다. 우선 Cre ER 마우스와 cre 리포터 마우스 중 생후 2~6개월 된 개체들 간의 교배 쌍을 설정하는 것으로 시작하십시오.매일 아침 금속 프로브를 사용하여 질전(vaginal plug) 형성 여부를 확인하고, 질전이 발견되면 암컷을 수컷과 분리합니다. 초기 배아 유도를 위해서는 임신한 암컷 쥐의 복강 내에 tamoxifen을 주사합니다. 임신 중기에서 후기 사이에 세포를 표지하고 출생 후 마우스에서 해당 세포의 운명이나 클론성을 추적하려면, tamoxifen과 1:2의 용량 비율로 progesterone을 임신한 암컷 쥐의 복강 내에 함께 주사합니다.적절한 배아 발달 단계의 배아를 수확하려면, 임신한 암컷의 복부를 70% ethanol로 소독한 후 가위로 복부를 절개하여 자궁을 적출합니다. 실체 현미경과 핀셋을 사용하여 배아를 자궁에서 수집하고, 태반 및 난황낭으로부터 조심스럽게 분리합니다. 수집한 배아를 4% paraformaldehyde에 넣고 4°C에서 2시간 동안 고정합니다.그 다음, 과잉 고정액을 제거하기 위해 PBS로 3회 세척합니다. 세 번째 세척 후, 배아가 가라앉을 때까지 개별 15 milliliter 튜브에 담긴 PBS 내 30% sucrose에서 배아를 배양합니다. 이어서, 플라스틱 동결 몰드에 OCT compound를 최대 부피의 3분의 2까지 채우고, 각 몰드에 배아를 하나씩 수직으로 배치합니다.실온에서 10분 후, 조직을 70% ethanol 드라이아이스 배스에 세운 상태로 동결시키고 크라이오스탯(cryostat) 온도를 22 °C로 설정합니다. 조직 블록을 절편하여 각 대동맥 전체에 걸쳐 10~20 µm 두께의 횡단 조직 절편을 생성하고, 얻어진 각 절편을 유리 현미경 슬라이드에 수집합니다. 모든 샘플을 확보한 후, 슬라이드를 실온에서 30분 동안 건조시킨 다음 80 °C에서 보관합니다.조직 샘플을 염색하려면, 슬라이드를 실온에서 해동하고 형광체 퇴색을 방지하기 위해 빛으로부터 보호한 후 0.1%PBS twin 20으로 세척하십시오. 클론 분석의 경우, 적절한 핵 염색약으로 조직을 염색하고 형광 현미경으로 rainbow cre reporter의 다른 형광체들을 직접 이미징하십시오. 운명 지도 작성(fate mapping)의 경우, mTmG cre reporter를 사용하여 면역 염색 여부와 관계없이 직접 이미징을 통해 GFP 발현을 시각화하십시오.배아 대동맥을 배양하고 적출하려면, 실체 현미경 하에서 배아를 똑바로 눕힌 자세로 놓고 뻗은 사지를 해부판에 고정하십시오. 가위를 사용하여 복부에서 흉골을 지나 상부 흉강까지 수직으로 절개합니다. 가느다란 기관지 폐, 식도, 간 및 장을 절개하여 제거하십시오.포셉을 사용하여 심장을 조심스럽게 복측으로 당기고, 가위로 흉강과 복강의 배측으로부터 대동맥을 박리합니다. 대동맥의 근위부 뿌리와 원위부 복부 위치를 절단하여 분리한 후, 수확한 대동맥을 세포 배양 후드 내의 멸균된 얼음처럼 차가운 PBS에 넣습니다. 짧게 세척한 후, 대동맥을 0.5% PBS가 첨가된 DMEM 배지가 들어 있는 24웰 플레이트의 한 웰로 옮기고, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 최대 24시간 동안 보관합니다.배양 종료 후, 대동맥을 PBS로 2회 세척하고 4% paraformaldehyde에서 20분 동안 조직을 고정합니다. PBS로 3회 더 세척한 후, 조직이 가라앉을 때까지 30% sucrosine PBS가 담긴 1.5 milliliter 튜브로 대동맥을 옮깁니다. 주생기 대동맥 평활근 세포 분리를 위해, 23 gauge 바늘을 사용하여 생후 0.5일 된 마우스의 좌심실을 천자하고, 플라스틱 튜브를 사용하여 바늘과 멸균 PBS가 담긴 주사기를 연결합니다. 이때 주사기를 높은 위치에 수직으로 유지하여 PBS가 중력에 의해 좌심실로 흐르게 합니다.간이 창백해지면, 포셉을 사용하여 대동맥 외측의 외막 조직을 제거하고 앞서 시연한 대로 대동맥을 적출하십시오. 500 µL의 소화액에 대동맥 조직을 넣고 5~10분마다 수동으로 흔들어 분리합니다. 45분 후, 튜브를 멸균 세포 배양 후드로 옮기고 200 µL 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액이 얻어질 때까지 조직 슬러리를 파이펫팅(trituration)하십시오.세포를 15 milliliter 원심분리관으로 옮긴 후, DMEM 2 milliliter를 첨가하고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 펠렛을 평활근 세포 배양액 3 milliliter에 재현탁하고, 세포를 35 millimeter 배양 플레이트에 분주합니다. 그 다음, 플레이트를 37 degree celsius 배양기에 넣고 3일마다 세포 배양액을 교체해 줍니다.피하 삼투압 미니 펌프를 삽입하려면, 먼저 마취된 마우스의 하부 등 부분을 클리퍼로 제모한 후, 가열된 수술용 플레이트 위에 마우스를 엎드린 자세로 놓습니다. 베타딘과 이소프로필 알코올로 등 부위를 소독하고 마우스를 실체 현미경 아래에 배치합니다. 그런 다음, 메스를 사용하여 꼬리 기저부에서 약 3~5 cm 앞쪽(rostral) 지점에 하부 근육이 손상되지 않도록 0.5~1 cm 길이의 수평 피부 절개를 실시합니다.절개 부위에 지혈 집게(hemostat)를 삽입하고, 집게의 조(jaw)를 열고 닫아 피하 포켓을 생성합니다. 관심 약물이 충전된 삼투압 미니 펌프를 포켓 안에 삽입하고, 6-0 비흡수성 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다. 그 후, 마우스가 흉골 복위(sternal recumbency) 상태가 될 때까지 모니터링하며 회복하도록 둡니다.세포외 기질 단백질인 elastin을 인코딩하는 유전자에 돌연변이가 있는 배아는 배아기 15.5일 이후부터 대동맥 내층에 과도한 평활근 세포가 축적됩니다. 이 과정 동안 다색 cre 리포터를 이용한 평활근 세포의 클론 분석 결과, 세포들이 여러 가지 색을 띠고 있어 다클론성임을 알 수 있습니다. 적출한 대동맥 절편의 면역염색 결과, elastin 돌연변이 배아기 15.5일 대동맥은 배양 후 18시간 이내에 근육 과다 증식 및 협착이 발생하며, 이러한 과정은 anti integrin beta three 차단 항체를 첨가함으로써 완화됩니다.생후 0.5일 된 야생형 마우스의 대동맥에서 분리된 평활근 세포는 평활근 세포 마커를 발현하지만 CD31은 발현하지 않습니다. 배아 13.5일부터 임신한 어미 쥐에게 인테그린 베타 3 억제제를 지속적으로 주입하면, 세포외 기질 단백질인 elastin 돌연변이 마우스에서 나타나는 대동맥 협착 및 과도한 근육화가 유의하게 완화됩니다. 그러나 야생형 마우스의 대동맥에는 영향을 미치지 않습니다.삼투압 미니 펌프 삽입 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 10분 이내에 완료할 수 있습니다. 이러한 절차를 따르면, 위 접근법을 위장관 조직이나 폐 부위와 같은 비혈관성 평활근 조직 연구에도 응용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 생체 내 배아 적합성 매핑 및 클론 분석 수행 방법, 적출된 배아 대동맥 및 주산기 대동맥 평활근 세포 배양 방법, 그리고 피하 삼투압 미니 펌프 적출 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.마우스, 타모キシ펜 및 고정 리듀서(fixed reducer)를 사용하는 작업은 위험할 수 있으므로, 이러한 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑과 실험복을 착용하고 각별한 주의를 기울이는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

using-vivo-tissue-cell-explant-approaches-to-study-morphogenesis

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 전체 마운트 immunohistochemistry를 소개하고 레이저 마우스 배아 사지 피부에 복잡한 혈관 네트워크 형성을 분석하는 데 여러 상표와 공촛점 현미경을 검사합니다.

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

우리는 (E) 9.5 및 이후 단계 배아 일에 마우스 배아 내의 배아 또는 다 능성 세포로부터 유래 된 내인성 및 그래프트 세포의 세포 운명 및 표현형 모두를 모니터하기 위해, 염료를 주입하는 DNA 벡터, 바이러스, 세포를 일련의 방법을 설명 개발.

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

대동맥의 병리학은 심각한 이환율과 사망률을 유발할 수 있으므로 질병 진행 및 잠재적 치료법에 대한 연구가 필요합니다. 여기에서는 심혈관 질환에 대한 연구자의 연구를 돕기 위해 쥐 대동맥을 분리하고 절제하는 프로토콜을 제시합니다.

분리 및 설치류 대동맥 절제; 심혈관 질환의 연구에 다목적 기술

이 원고는 발달 중인 혈관 구조를 시각화하는 기술을 설명합니다. 여기에서는 자궁 내 심장 내 FITC 표지 토마토 렉틴 미세주입을 마우스 배아에 활용했습니다. 이 기술을 사용하여 배아 신장 전체에 걸쳐 관류된 혈관과 관류되지 않은 혈관을 설명합니다.

마우스 배아의 자궁 내 인트라 심장 토마토 렉틴 주사에서 신장 혈류를 측정하기 위해

처음으로 우리는 발달 중인 심장 ex ovo에서 혈역학을 변경하기 위한 재현 가능한 밴딩 절차를 제시합니다. 이것은 유출로(OFT)를 부분적으로 수축시킴으로써 달성됩니다.

소설<em&gt; 예 비켜</em&gt; 밴딩 기법 닭 배아 시스템에서 심장 내 혈류를 변경할

우리는 광 클리어런스 및 초점 현미경이어서 표준 면역 염색 방법을 이용하여, E15.5까지 온 뮤린 배아 하트 관상 혈관의 분석 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 직렬 섹션 시간 소모 분석 할 필요없이 전체에 걸쳐 심장 혈관의 시각화를 가능하게한다.

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

이 프로토콜은 vasculature를 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하기위한 형광 기반의 방법을 보여 줍니다 . 혈관은 생체 내에서 심혈관 질환 발달을 연구하기 위해 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작 후 배아의 박동 심장에 형광 염료를 주입 한 후 수분 내에 영상화 될 수있다.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

이 방법에서는, 배아 심장 조직 microdissected, 해리, 붙일 레이블 및 호스트 배아 조직으로 이식 수술이 있습니다. 이 개인 또는 조직 수준 발달 조직 아래 소성 hemodynamic 조건 및/또는 변경된 paracrine/juxtacrine 환경 공부를 위한 플랫폼을 제공 합니다.

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

고전적으로, 마우스 배아 판막 원초의 심내막은 횡단, 관상 또는 시상 절편을 사용하여 분석되었습니다. 판막 형성 영역에서 심내막의 2차원 이미징에 대한 우리의 새로운 접근 방식은 판막 발달 중 심내막의 평면 극성 및 세포 재배열 분석을 가능하게 합니다.

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

학습하세요 생쥐 대동맥 형태발생을 연구하는 in vivo 클론 분석 및 운명 매핑 기법을 활용하여 혈관 질환의 병인을 규명하는 방법을. 이 기술은 혈관 질환 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

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