Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

이 절차의 전반적인 목표는 정상적인 발달 과정에서 배아 및 주산기 대동맥 벽의 형성과 질병 중 이 과정의 섭동을 연구하는 것입니다. 이 방법은 배아 및 주산기 혈관 배지에 기여하는 세포의 출처가 무엇인지와 같은 혈관 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 발달의 배아 및 주산기 단계에서 발생하는 평활근 발병 기전 및 형태 형성을 평가할 수 있다는 것입니다.

이러한 기술의 의미는 과도한 스모 세포 생산을 유발하는 주기성 질환의 판막상 대동맥 협착증과 같은 혈관 질환의 치료로 향합니다. 미니 펌프 배치 절차는 예일 대학교의 미세 수술 핵심을 지휘하는 연구 과학자인 Dr.Jiasheng Zhang이 수행합니다. Cre ER이 있는 2개월에서 6개월 된 마우스와 Cre 리포터가 있는 마우스 사이의 짝짓기 쌍을 설정하는 것으로 시작합니다.

금속 프로브를 사용하여 매일 아침 질 마개가 있는지 확인하고 마개가 감지되면 암컷과 수컷을 분리합니다. 초기 배아 유도를 위해 타목시펜을 임산부의 습기에 복강내 주사합니다. 임신 기간 중반에서 후반의 세포를 표시하고 출생 후 쥐에서 세포의 운명 또는 클론성을 추적하기 위해 프로게스테론을 무력하게 임신한 축축한 사람의 복강내강에 타목시펜을 1-2회 투여 비율로 주입합니다.

적절한 배아 날짜에 배아를 채취하려면 70% 에탄올로 임산부의 복부를 청소하고 가위를 사용하여 복부를 열어 자궁을 제거합니다. 겸자와 실체 현미경을 사용하여 자궁에서 배아를 채취하여 태반과 난황낭에서 조심스럽게 분리합니다. 배아를 4%파라포름알데히드에 넣고 섭씨 4도에서 2시간 동안 고정합니다.

그런 다음 PBS를 세 번 세척하여 과도한 고정액을 제거합니다. 세 번째 세척 후, 배아가 가라앉을 때까지 PBS의 30% 자당에서 개별 15ml 튜브에서 배아를 배양합니다. 다음으로, 플라스틱 냉동 금형에 최적의 절단 온도 화합물을 최대 부피의 2/3까지 채우고 각 금형에 하나의 배아를 수직으로 놓습니다.

실온에서 10분 후 드라이아이스 70% 에탄올 수조에서 조직을 똑바로 얼리고 저온 유지 온도를 섭씨 22도로 설정합니다. 조직 블록을 절단하여 각 대동맥 전체를 통해 10-20마이크로미터 두께의 가로 조직 절편을 생성하고, 얻어진 대로 유리 현미경 슬라이드에 각 절편을 캡처합니다. 모든 샘플이 획득되면 섭씨 80도 보관 전에 30분 동안 실온에서 슬라이드를 건조시킵니다.

조직 표본을 염색하기 위하여는, 실내 온도에 활주를 녹이고, 형광단 표백을 피하기 위하여 빛에서 보호하고 0.1%PBS 쌍둥이 20에 있는 활주를 세척하십시오. 클론 분석을 위해 적절한 핵 염료로 조직을 염색하고 형광 현미경에서 rainbow cre reporter의 다른 flurophoores를 직접 이미지화합니다. 운명 매핑의 경우, mTmG cre reporter를 사용하여 면역염색 유무에 관계없이 직접 이미징을 통해 GFP 발현을 시각화합니다.

배아 대동맥을 배양하고 이식하려면 배아를 누운 자세로 놓고 확장된 팔다리를 실체 현미경으로 해부판에 고정합니다. 가위를 사용하여 복부에서 흉골을 거쳐 위쪽 흉부까지 수직으로 절개합니다. 가장 미세한 기관, 폐, 식도, 간 및 장을 해부합니다.

집게를 사용하여 심장을 배쪽으로 부드럽게 당기고, 가위를 사용하여 대동맥을 흉강과 복강의 등쪽 쪽에서 멀리 해부합니다. 근위부와 원위 복부 위치에서 대동맥을 절단하여 방출하고 적출된 대동맥을 세포 배양 후드의 멸균된 얼음처럼 차가운 PBS에 넣습니다. 간단한 세척 후 대동맥을 0.5%PBS가 보충된 DMEM 배지가 포함된 24웰 플레이트의 한 웰로 옮기고 플레이트를 최대 24시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.

배양이 끝나면 PBS로 대동맥을 두 번 세척하고 4% 파라포름알데히드에 조직을 20분 동안 고정합니다. PBS를 세 번 더 세척한 후 조직이 가라앉을 때까지 30% 수크로신 PBS가 함유된 1.5ml 튜브로 대동맥을 옮깁니다. 주산기 대동맥 평활근 세포를 분리하기 위해 23 게이지 바늘을 사용하여 출생 후 0.5 마우스의 좌심실을 뚫고 플라스틱 튜브를 사용하여 바늘을 주사기가 들어 있는 멸균 PBS에 연결하고 높은 위치에서 수직으로 유지하여 PBS가 중력에 의해 좌심실로 흐르도록 합니다.

간이 희어지면 집게를 사용하여 대동맥 바깥쪽의 외래 조직을 제거하고 방금 설명한 대로 대동맥을 채취합니다. 500마이크로리터의 소화 용액에서 대동맥 조직을 5-10분마다 수동 흔들어 해리합니다. 45분 후 튜브를 멸균 세포 배양 후드로 옮기고 200마이크로리터 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액이 얻어질 때까지 조직 슬러리를 분쇄합니다.

세포를 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 2 밀리리터의 DMEM을 넣고 원심 분리로 세포를 수집합니다. 펠릿을 3밀리리터의 평활근 세포 배양 배지에 재현탁시키고 세포를 35mm 배양 플레이트에 파종합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 3일마다 세포 배양 배지를 새로 고칩니다.

피하 삼투압 미니 펌프를 배치하려면 먼저 마취된 마우스의 허리를 이발기로 면도하고 가열된 수술 플레이트에 엎드린 자세로 마우스를 놓습니다. 베타딘과 이소프로필 알코올로 뒷면을 문지르고 마우스를 실체 현미경 아래에 놓습니다. 그런 다음 메스를 사용하여 밑아래 근육을 다치지 않고 꼬리 밑부분까지 약 3-5cm 높이의 수평 피부 절개를 만듭니다.

절개 부위에 지혈제를 삽입하고 지혈 턱을 개폐하여 피하 주머니를 만듭니다. 관심 물질로 채워진 삼투압 미니 펌프를 주머니에 삽입하고 6o 비흡수성 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다. 그런 다음 흉골 누운기가 달성될 때까지 모니터링을 통해 마우스가 회복되도록 합니다.

세포외 기질 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 배아 돌연변이인 엘라스틴은 배아 15.5일 이후부터 대동맥 내층에 과도한 평활근 세포를 축적합니다. 이 과정에서 multicolor cre reporter를 사용한 평활근 세포의 클론 분석은 세포가 여러 색상이므로 다클론성임을 나타냅니다. 이식된 대동맥 절편을 면역염색하면 엘라스틴 돌연변이 배아 15.5일차 대동맥이 배양 후 18시간 이내에 초근육 및 협착 상태가 되며, 이 과정은 항 안테그린 베타 3 차단 항체의 추가에 의해 약화됩니다.

야생형 마우스의 대동맥에서 분리된 평활근 세포는 출생일 0.5일 이후 평활근 세포 마커를 발현하지만 CD31은 발현하지 않습니다. 배아 13.5일째부터 임산부에 인테그린 베타 3 억제제를 지속적으로 주입하면 세포외 기질 단백질인 엘라스틴에 대한 돌연변이 생쥐의 대동맥 협착증과 과근육화가 크게 약화됩니다. 그러나 야생형 마우스의 대동맥을 변경하지 마십시오.

일단 숙달되면 삼투압 미니 펌프 배치 기술을 적절하게 수행하면 10분 이내에 완료할 수 있습니다. 이러한 절차에 따라 이러한 접근 방식은 위장관 조직 또는 폐 영역과 같은 평활근 코딩, 비혈관 근육을 연구하기 위해 외삽할 수도 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 생체 내 배아 맞춤 매핑 및 클론 분석을 수행하고, 배아 대동맥, 주산기 대동맥 평활근 세포를 배양하고, 피하 삼투압 미니 펌프를 이식하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

생쥐, 타목시펜 및 고정 감속기로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이러한 절차를 수행하는 동안 장갑과 실험실 가운을 착용하고 각별한 주의를 기울여야 하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.