Name: Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 배우세요 생쥐 이차 구개 융합의 공초점 현미경 라이브 이미징 방법을 통해 두개안면 발달 중 세포 역학을 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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2 차 구개 영상에 관한 초기 대화에 M. Douglas Benson에게 감사드립니다. 공 촛점 현미경 검사에서 이미징 조건을 조정하는 데 도움을 준 David Castaneda-Castellanos (Leica)와 Chris Rieken (Zeiss)도 인정합니다. 우리는 Lynsey Hamilton (Bitplane)에게 Imaris 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지 분석을위한 유용한 제안을 해주었습니다. 이 작품은 NIH / NIDCR R01 DE025887에 의해 재정 지원을 받았다.

모든 동물 실험은 San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee의 University of California의 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 1. 라이브 영상 미디어 준비 <ol><li> 액체 배양 배지의 제조 <ol><li> 20 % FBS (fetal bovine serum), 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙토 마이신, 200 μg / mL L- 아스 코르 빈산, 15 mM HEPES를 더베 페코 수정 이글 배지 (DMEM) / F12 미디어. 참고 : 라이브 이미징 미디어는 이미지 작성 직전에 새로 제작되었습니다. 이 매체에는 페놀 레드가 포함되어있어 오랜 시간 동안 라이브 이미지를 촬영할 때 광독성을 유발할 수 있습니다. 페놀 레드가없는 용지를 대체하면 장기 이미징을 향상시킬 수 있습니다. </li></ol></li><li> 저 융점 아가 로스 용액의 제조 <ol><li> 저 융점 아가 로스 350 mg을 오토 클레이 빙 된 증류수 10 mL에 녹여 3.5 % 저장 용액으로 만든다. </li><li> 아가로 오스 용액을 잘 섞고 70 ° C에서 항온 배양 한 후 아가로 오스를 완전히 녹입니다. </li><li> 라이브 이미징 미디어에 추가하기 전에 37 ° C 수조에서 아가로 오스 솔루션을 식히십시오. </li><li> 최종 농도 (0.6 %)를 만들기 위해 액체 라이브 이미지 미디어 5 ML에 아가로 오스 주식 솔루션 1 ML을 추가합니다. </li><li> 조기 응고를 방지하기 위해 37 ° C 수조에서 아가로 오스로 미디어를 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 라이브 영상을위한 Palate Explant 문화의 준비 <ol><li> 최근 부착 된 E14.5 보조 구개 선반의 해부 참고 : 우리의 경험에서 이미징 융합은 약간 접착 된 구개 선반으로 시작해야합니다. 이 순응은 영상화 중에 융합이 일어나지 못하게하는 체외 이식 운동을 방지합니다. <ol><li> 1x 인산 버퍼 식염수 (PBS)에 E14.5 무대 배아를 해부하고 녹색 형광 단백질 (GFP) - 표현을 선택 (에서K14-cre; ROSA26-mTmG flox ) 또는 (적색 형광 단백질) 형광 램프가 장착 된 해부 현미경을 사용하여 ( Lifeact-mRFPruby ) 양성 배아를 발현하는 RFP. 아가로 오스가없는 예열 된 라이브 이미징 배양 배지로 조직을 옮깁니다. </li><li> 배아 머리를 잘라 두 괜찮아요 5 번 집게 ( 그림 1A - C )를 사용하여 상단 뇌 영역을 제거합니다. 5 번 집게를 사용하여 배아를 잡고 다른 5 번 집게는 구개 선반 밖에서 여분의 조직을 잘라냅니다. 참고 : 미세 가위는 하나의 5 번 집게 대신에 배아 머리 (첫 번째 단계)를자를 수 있습니다. 그러나 2 번 5 번 미세 포셉은 정밀 절단을보다 잘 제어 할 수 있습니다. </li><li> 그림 1D 와 1E 와 같이 구개 선반에 손상을주지 않고 신중하게 하악을 제거하십시오. 구개를 손상시킬 가능성을 줄이려면 하악의 절개를 통해 혀를 지키십시오. f혀를 조심스럽게 제거한 후. </li><li> 하악과 혀를 제거한 후, 2 차 구개의 구강 쪽을 형광 현미경으로 검사하여 MES에서 강력한 리포터 신호를 확인합니다 ( 그림 1 M ). </li><li> 하악과 혀를 제거한 후 후뇌와 뇌간을 포함한 후부를 해부합니다 ( 그림 1F ). </li><li> 부착 된 구개 선반이있는 상악을 모두 제거하십시오 ( 그림 1 G ). </li><li> 1 차 및 2 차 구개를 손상시키지 않고 앞쪽에 윗턱 조직을 자릅니다 ( 그림 1 H 및 I ). </li><li> MES를 노출 explant의 비강 측면에 비강 격막을 제거합니다. 참고 : 이러한 해부 단계는 두 개의 2 차 구개 선반 사이의 접촉을 방해하지 않도록 세심한주의가 필요합니다. 비강 중격의 제거는다른 영역에서 백그라운드 신호를 줄이고 수직 조직 운동을 감소시켜 안정적인 이미징을 가능하게합니다 ( 그림 1 J-L ). </li><li> 구개 선반을 절개 후, 중간 선 리포터 신호를 다시 조사하여 조직 사이의 상피 층에 손상이 없는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> 라이브 이미지 미디어로 문화 요리에서 입천장 explants 설정 <ol><li> 라이브 이미지 미디어를 35mm 유리 바닥 접시에 넣으십시오. </li><li> 거꾸로 공 촛점 현미경 ( 그림 1 N )과 이미징을 위해 가능한 유리 바닥에 가까운 해부 구개 선반 구강 측면을 내려 놓으십시오. </li><li> 빠른 속도로 온도를 낮추어 아가로 오스 응고를 촉진 시키거나 4 ° C에서 배양 접시를 넣으려면 배양 접시 근처의 전도성 표면에 드라이 아이스 펠렛을 놓습니다. 파라핀 삽입에 사용되는 것과 같은 차가운 판도이 단계에서 사용할 수 있습니다.tage. 참고 : 드라이 아이스를 사용할 경우 아가로 오스 배지를주의 깊게 모니터링하여 얼지 않는 매체를 방지해야합니다. </li></ol></li></ol> 3. 구개 제거술의 공 촛점 저속 영상 <ol><li> 이미징 및 데이터 수집 <ol><li> 아가로 오스가 반고체화된 후 37 ° C 배양 챔버가 장착 된 거꾸로 공 초점 현미경에 문화 요리를 탑재. 백색광 공 촛점 현미경과 셀 관찰자 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하십시오. NOTE : 우리는 CO 2 가스가없는 15 mM HEPES를 함유하는 수정 된 배지를 사용했다. </li><li> 문화 접시와 코팅 사이에 석유 젤리를 넣어 주사기를 사용하여 미디어 ( 그림 1 N )의 증발을 방지합니다. 참고 : 밤 (O / N) 배양 후 배양 접시 덮개 상단에 약간의 응축이 생기지 만 배지의 양은 바뀌지 않으므로 석유 젤리가 배지가 증발하는 것을 방지합니다. </li><li> 저배율 대물 렌즈 (10 배)로 관심 부위를 찾고 저속 라이브 영상을 위해 고배율 대물 렌즈 (3 배 디지털 줌 또는 40 배 대물 렌즈)를 사용하십시오. 참고 : 해부 된 2 차 구개 선반은 평평하지 않습니다. 2 차 미각은 구부러진 구조이기 때문에 동일한 평면에서 전체 MES를 이미지화하는 것을 어렵게 만듭니다. 저배율 (10x) 영상은 전체 구개 영상을 허용 할 수 있지만 40x 대물 렌즈는 더 깊은 영상 자세를 제공하여 더 깊은 Z 위치의 상세한 세포 움직임을 검사합니다. 가운데 구개 영역에서 곡률이 높습니다. 앞뒤 구개는 중간 구개에 비해 상대적으로 평평합니다. 가장 큰 곡률의 영역을 피하기 위해 종종 2 차 구개의 중간 전방을 향해 이미지를 만듭니다. </li><li> 적절한 레이저 여기 (GFP의 경우 488 nm 및 RFP의 경우 532/561 nm)를 사용하여 16-24 h 동안 5 μm의 각 단계로 여러 Z 스택을 스캔합니다 ( 그림 2 ). 참고 : 잠재적 인 광독성을 줄이려면 최소한의 레이저 출력과 노출 시간을 사용하십시오. 이것은 특히 멀티 컬러 이미징의 경우에 중요합니다. membraneTomato (mT)에는 552 nm 레이저 파워의 22 %, membraneGFP (mG)에는 495 nm 레이저 파워의 30 %, membraneRFP는 561 nm 레이저 파워의 25 %를 사용하십시오. 평균 노출 시간은 550ms입니다. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포 추적 및 정량 분석을 수행하십시오. </li></ol></li></ol> 4. 데이터 이미지 분석 참고 : 여기, Imaris가 사용되었습니다. ImageJ 또는 Volocity 소프트웨어 패키지를 사용하여 유사한 데이터 분석을 수행 할 수도 있습니다. <ol><li> 이미지 시퀀스에서 3 차원 (3D) 서페이스를 렌더링합니다. 참고 :이 섹션에서는 멤브레인 GFP 신호로 생성 된 동영상에서 서페이스를 생성 할 수 있습니다. <ol><li> 편집 | 디스플레이 조정을 표시 하고 히스토그램 슬라이더를 사용하여 멤브레인 신호가 투명하게되도록 신호 강도를 조정합니다영화의 길이를 밖으로 (그림 3 A). </li><li> 이미지를 사용하여 표백 한 신호를 수정하십시오. 가공 | 감쇠 보정 . Intensity Front 및 Intensity Back 값을 조정하여 멤브레인 신호가 영화 전체 길이에 걸쳐 선명하게 표시되도록합니다. 이 값을 설정할 때 약간의 시행 착오가 필요할 수 있습니다. 참고 : Intensity Back (Deeper Z 위치) 값은 제한된 레이저 침투로 인해 Intensity Front (표면 Z 위치) 값보다 작습니다. 따라서이 값을 변경하여 Z 시리즈에서 신호 강도를 표준화 할 수도 있습니다. 표백 보정을 달성하기 위해 두 값을 모두 조정할 수 있습니다. 감쇠 보정도 발광 감쇄 보정 (19)라고한다. </li><li> 멤브레인 신호에서 서페이스를 생성하려면 Surpass | 표면 , 소스 채널 및 임계 값 유형 (절대 강도)을 선택하고 알고리즘 설정에서강의하다 관심 영역 만 분할 마지막으로 전체 이미지를 처리 한 다음 앞으로 화살표를 클릭합니다. 생성 된 표면이 형광 신호를 반영하는지 확인하면서 앞으로 화살표를 계속 누르고 (기본 설정을 사용하거나 표면적 세부 수준 및 임계 값 방법을 시행 착오로 지정). 관심 영역을 지정하려면 X, Y, Z 위치를 자르기하여 렌더링 할 영역과 시간을 선택하십시오. 참고 : 선택 최종적으로 전체 이미지 를 조정하여 조정 및 임계 값이 전체 영화에 적용됩니다. </li><li> 앞으로 화살표 버튼을 다시 클릭하여 서페이스를 생성합니다. 멤브레인 신호에 해당하는 Filters 의 히스토그램을 변경하여 임계 값을 조정하십시오. </li><li> 서페이스가 생성 된 후 서페이스 / 설정에서 서페이스를 선택하여 서페이스 신호를 시각화하고 double forw를 밀고 서페이스 생성 프로세스를 마칩니다.ARD 화살표 버튼 (도 3 B). </li><li> 표면으로 이동 | 편집 을 클릭하고 마스크 속성 에서 모두 마스크를 클릭하여 마스크 된 채널 이미지를 생성합니다. </li><li> 확인을 클릭하면 마스크 채널 창이 자동으로 열립니다. GFP 채널을 선택하고 서페이스 외부의 보셀을 최대 신호 강도 값 ( 편집 | 디스플레이 조정에 있음 )으로 설정하고 표면 안의 보셀을 최소 GFP 강도 값 ( 편집 | 디스플레이 조정 ) 마스크 설정 에서 멤브레인 신호의 마스크를 생성합니다. </li><li> 멤브레인 신호의 마스크가 볼륨 보기에 표시되므로 이미지 처리 | 대비 변경 | 반전 ( 그림 3 C ). </li></ol></li><li> 거꾸로 된 표면 이미지에서 스폿 감지. 참고 :이 섹션에서는 각 셀의 가운데가고유 한 지점으로 표시되고 시공간을 추적합니다. <ol><li> 능가 장면 선택 | 명소 | 만들기 ; 알고리즘 설정 에서 관심 영역 만 세그먼트로 구분하고 전체 이미지 처리를 마침내 하고 시간 경과에 따라 추적 점을 선택하십시오 . </li><li> 앞으로 화살표를 클릭하고 관심 지역을 지정하십시오; 지역 및 시간을 선택하여 관광 명소를 추적하십시오. 앞으로 화살표를 계속 누르고 소스 채널로 마스킹 된 채널을 선택하고 스폿의 추정 된 XY 지름을 결정합니다. </li><li> 앞으로 화살표 버튼을 클릭하면 필터 창이 자동으로 열립니다. 히스토그램의 값을 변경하여 각 셀의 중앙에 단일 스폿을 생성함으로써 스폿 감지 임계 값을 조정하십시오 ( 그림 3 D ). </li><li> 앞으로 화살표 버튼을 다시 클릭하면 알고리즘 창이 열리 며, 자동 회귀 모션 추적 모델 20을 선택하고 최대 추적 di를 지정하십시오.자세 및 짧은 간격으로 불연속이되는 트랙을 연결하는 데 필요한 최대 간격 크기입니다. </li><li> 앞으로 화살표 버튼을 다시 클릭하면 필터 창이 열리므로 모든 셀이 추적되도록 히스토그램을 조정하여 트랙 지속 시간 임계 값을 설정하십시오. 이중 앞으로 화살표 버튼을 클릭하면 스폿 감지가 완료됩니다. </li><li> 조직 표류를 수정하려면 Spot | Track Editor 를 선택하고 Correct Drift를 선택 하십시오 . 알고리즘 창이 자동으로 열립니다. Translational drift, 전체 결과 포함 및 오브젝트 위치 정정을 선택하십시오 . </li></ol></li><li> 정량 분석을위한 유리한 플롯 생성. 참고 :이 프로그램의 분산 형 (Scatterplot)은 여러 객체로 구성된 다차원 (X, Y, Z, 색상 및 크기) 그래프를 생성하는 도구입니다. 이 플롯은 시간이 지남에 따라 많은 셀 이동의 경향을 보는 데 유용합니다. <ol><li> 셀 추적 데이터의 2D 또는 3D 플롯 만들기Vantage-New Vantage 플롯 메뉴를 추가 합니다 ( 그림 3 E 및 3F ). </li><li> 볼륨 또는 스폿 선택 및 생성 / 카테고리 및 플롯 유형 선택 </li><li> 다른 Vantage 그래프를 생성하려면 Plot Values 를 조정하십시오. </li><li> 스냅 샷 기능을 사용하여 그래프를 내 보냅니다 . 참고 : 통계 데이터는 Plot Numbers Area |를 클릭하여 추가 정량 분석을위한 스프레드 시트로 내보낼 수도 있습니다. 저장하십시오 . </li></ol></li></ol>

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3D 장기 explant 문화와 조직 morphogenesis의 라이브 이미징 고정 조직 섹션의 기존 얼룩 분석에 표시 할 수없는 세포 프로세스에 관한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다. 생쥐의 배아 이차 배뇨의 생체 외편 배양 배지를 사용하여 우리는 상피 융합과 세포 압출을 포함하는 구개 융합의 새로운 메커니즘을 제안하기 위해 몇 가지 흥미로운 세포 행동을 관찰했다. 이러한 유형의 연구에서 공통적으로 직면하는 문제 중 하나는 오랜 시간 동안 지속적으로 레이저를 여기시켜 광 표백을하는 것입니다. 우리의 연구에서 백색광 공 촛점 및 회전 디스크 공 촛점 현미경이 사용되었습니다. 시간 경과에 따른 신호 강도의 감소는 이미징 소프트웨어 (LAS-AF)에서 표백 보정을 통해 교정 할 수 있습니다 (프로토콜 4.1). 표백 보정은 제한적이므로 각 이미징 시스템에서 레이저 출력과 노출 시간을 신중하게 최적화하는 것이 중요합니다. 우리는 또한 확인했다.그 구개 융합 3 ...

조직 융합은 여러 장기의 발달에 중요한 단계입니다. 갈라진 입술과 입천장, 척추이 분증과 심장 기형과 같은 주요 인간의 선천적 결손은 조직 융합의 결함으로 생길 수 있습니다 1 . 마우스 2 차 구개 융합은 개발 2 , 3 , 4 에서 조직 융합을 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 확인하기 위해 광범위하게 연구되었습니다. 마우스에서 2 차 구개 발달은 E11.5에서 시작하여 양측 상악골의 각 단계에서 2 차 구개 선반이 형성됩니다. 구개 선반의 초기 성장은 대략 E14.0까지 혀를 따라 수직적으로 발생하며, 이때 구개 선반은 혀 위에서 수평으로 상승합니다. medially-directed growth는 정중선 epitheli를 형성하면서, 두 개의 구개 선반의 apposing epithelia 사이의 물리적 접촉을 가져온다E14.5에서 MES (al seam). 중간 엽 합병과 E15.5에 의한 완전히 융합 된 2 차 구개의 발생을 허용하기 위해 중간 구개 선반 사이에서 중간 MES를 제거해야합니다 3 . 공유 상피 MES 세포층이 2 개의 분리 된 구개 선반 사이에 형성되고,이어서 중간 엽의 confluency를 달성하기 위해 제거되는 방법은 구개 발달에서 중심적인 문제였다. 마우스 histological 및 전자 현미경 (EM) 연구, explant 문화 연구 및 기능 마우스 유전학 실험을 바탕으로, 몇 가지 기본적인 세포 행동이 과정에 연루되었습니다. 각 선반 구개의 내측 가장자리 상피에서 MEE Filopodia 형 돌기는 공유 단일 MES 6,7 이러한 상피 세포의 인터이어서 초기 접촉 (5, 6)을 용이하게한다. 결과 공유 MES 제거세 가지 비 독점적 인 메커니즘으로 진행하도록 제안되었습니다. 조직 학적 관찰과 중요한 염료로 추적 체외 계보를 사용하는 초기 연구는 MES는 MES 세포의 중간 엽 전환 (EMT)로 상피에 의해 제거 될 수 있습니다 8, 9,하지만 최근, 상피 세포의 유전 적 혈통 추적이에 대한 불확실성을 제기했다고 표시 palatal shelf mesenchyme 10 , 11 , 12 에 대한 상피 세포의 장기적인 기여. 현저한 수의 세포 사멸 세포와 적절한 미각 융합을 거치지 못하는 일부 돌연변이 체에서의 세포 수 감소는 세포 사멸이 MES 용해 2 , 3 의 주요 동인이 될 수 있다는 생각으로 이어진다. 마지막으로, 점진적 시점에서 상피 표지 및 정적 관찰을 포함하는 연구에 기초하여, MES 세포구강 및 전후 치수 11 , 13 에서 이동하는 것이 제안되었지만, 이러한 동적 세포 행동은 초기에 생 구개 조직에서 관찰 할 수 없기 때문에 미확인이었다. 최근 우리는 구강 구강 선별의 공 촛점 라이브 영상과 형광 라벨링의 마우스 유전자 방법을 결합한 새로운 라이브 이미징 방법론을 개발함으로써 이러한 행동을 직접 관찰 할 수있었습니다. 첫째, 구개 융합 동안 구개 상피 세포의 동적 세포 행동을 시각화하기 위해, 우리는 Keratin14-CRE 마우스 14, 15 ROSA26 - mTmG flox 마우스를 교차하여 상피 별 기자 마우스를 생성합니다. 결과 배아의 구개 explant 문화의 공 촛점 라이브 이미징 일부 이전에 제안 된 세포 행동을 확인하고 융합 과정 6 에서 새로운 이벤트를 확인 </sup&gt;. 상피 세포 막 돌출부는 초기 세포 - 세포 접촉에 이어 세포 삽입 및 구강 세포 변위에 의한 상피 수렴이 뒤 따른다. 특히, 우리는 또한 세포 압출, 상피 항상성에 중요한 역할을하는 것으로보고 프로세스를 발견, 마우스 차 구개 융합 (6), (16)를 운전하는 주요 메커니즘이었다. 이 이미징 방법은 다른 기자 회선과 함께 사용할 수 있습니다. 우리는 융합 과정에서 액틴 세포 골격 역학을 검사하기 위해 Lifeact-mRFPruby 형질 전환 마우스 17 , 18 을 사용했습니다. 다른 기자는 또한 구개 융합의 다른 특정 측면을 관찰하는 데 사용할 수 있으며이 방법은 이미징 요구 및 현미경 가용성에 따라 공 촛점 현미경 검사 또는 회전 디스크 공 촛점 현미경 검사에 맞게 조정할 수 있습니다. 생체 영상은 발달 생물학에서 핵심적인 접근 방법이되고 있습니다. 이상적 상대cularly, craniofacial morphogenesis는 복잡하고 얼굴에 영향을 미치는 인간의 선천적 결함은 일반적입니다. 이 공 촛점 라이브 이미징 방법은 인간의 craniofacial 이상의 기원뿐만 아니라 근본적인 기본 발달 메커니즘의 향상된 이해를 활성화하는 데 도움이됩니다.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life technology</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life technology</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life technology</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic</td><td>acid Sigma</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Life technology</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>BioExpress</td><td>E-3111-125</td><td></td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Petrolieum 젤리(바셀린)</td><td>Sigma</td><td>16415-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratin14-cre</td><td></td><td>MGI: J:65294</td><td>대립유전자 = Tg(KRT14-cre)1Amc</td></tr><tr><td>ROSA26mTmG</td><td></td><td>MGI: J:124702</td><td>대립유전자 = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td></tr><tr><td>Lifeact-mRFPruby</td><td></td><td>MGI: J:164274</td><td>대립유전자 = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>White Light SP5 컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Observer 회전 디스크 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss 현미경</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mouse secondary palate fusion의 라이브 이미징

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

2 차 구개 선반이 융합되어 2 차 구개를 형성하는 것은 포유 동물의 발달 과정에서 중요한 과정이며, 그 파열로 인해 인간의 공통 선천성 기형 인 2 차 구개가 생길 수 있습니다. 이차 미각 융합은 광범위하게 연구되어이 과정을 중재 할 수있는 몇 가지 제안 된 세포 메커니즘을 유도한다. 그러나, 이러한 연구는 개발 도중 또는 고정 된 시점에서 분석 된 고정 된 체외 이식편 배양에서 진보적 인 시점에서 고정 배아 조직에서 주로 수행되었다. 정적 분석은 미각 융합과 같은 동적 인 형태 발생 과정의 분석과 어떤 유형의 동적 세포 행동이 구개 융합을 중재 하는지를 불완전하게 이해하는 데에는 한계가있다. 여기 우리는 마우스 배아에서 생체 내 2 차 구개 융합의 라이브 이미징 프로토콜을 설명합니다. 구개 융합의 세포 행동을 조사하기 위해 상피 특이 적 Keratin14 -cre를 사용하여 ROS의 구개 상피 세포를 표지 하였다A26-mTmG flox 기자 배아. 섬유질 악틴을 시각화하기 위해 Lifeact-mRFPruby 리포터 마우스를 사용했습니다. 이차 구개 융합의 라이브 영상은 배아 일 (E) 14.5 단계 배아의 최근 부착 2 차 구개 선반을 해부하고 거꾸로 공 촛점 현미경으로 이미징을 활성화하기 위해 유리 바닥 접시에 아가로 오스 함유 미디어에서 배양하여 수행되었습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 2 차 구개 융합 동안 다양한 새로운 세포 행동을 발견했습니다. 공간과 시간에 어떻게 구별되는 세포 행동이 조정되는지에 대한 감사는 이러한 동적 형태 형성 과정에 대한 우리의 이해에 크게 기여한다. 이 프로토콜은 돌연변이 마우스 라인, 또는 두 번째 구개 융합이 제어되는 방법에 대한 이해를 진전시키기 위해 약리학 적 억제제로 치료 한 배양 물에 적용 할 수 있습니다.

구개 제거 (explant) 배양의 라이브 영상으로 미각 융합을 매개하는 여러 세포 과정이 밝혀졌습니다 6 . 두 개의 상피 세포 사이의 초기 접촉은 막 돌출부에 의해 이루어진다 ( 그림 2 B-2E ). 두 개의 상피 세포가 만났을 때 상피 수렴을 통해 통합 된 단일 세포층 MES를 만들기 위해 인터 셀 레이션 (intercalation)을 거친 다중 세포층 MES를 형성한다 ( 그림 2A-2E 및 그림 2K-2O ). 더 깊은 Z 수준의 상피 세포는 점진적으로 상피 수렴 과정에 기여하는 MES의 구강 측으로 옮겨진다 ( 그림 2</stro...

여기, 우리는 공 촛점 현미경을 사용하여 마우스 보조 입천장 융합의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 형광 기자 마우스 라인과 기계적 통찰력을위한 경로 억제제와 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 발달 시스템의 라이브 이미징에 적용 할 수 있습니다.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

이 공초점 살아있는 세포 이미징 방법의 전반적인 목표는 두개 안면 발달 과정 중 구개 돌기의 2차 구개 융합과 같은 세포 프로세스를 직접 관찰하는 것입니다. 먼저 신선한 상온의 PBS가 담긴 페트리 접시에서 해부 현미경을 사용하여 배아의 머리를 몸통에서 분리하십시오. 5번 미세 핀셋 한 쌍으로 머리를 잡고, 두 번째 핀셋을 사용하여 상단 뇌를 제거하며, 구개 돌기 외의 불필요한 조직을 두 번째 핀셋으로 절제하십시오.구개돌기(palatal shelves)가 손상되지 않도록 주의하여 하악골(mandible)을 제거합니다. 하악골이 분리되면 혀를 조심스럽게 제거하고, 정중선 상피 이음매(midline epithelia seam)에서 강한 리포터 신호가 나타나는지 확인합니다. 정중선 상피 이음매를 온전하게 유지하기 위해 해부 과정 중 구개 부위가 손상되지 않도록 하는 것이 중요합니다.다음으로, 후뇌, 뇌줄기 및 구개돌기가 부착된 양측 상악골을 제거합니다. 1차 및 2차 구개판을 온전히 유지하면서 상악 전방 조직을 절제합니다. 외식편의 비강 쪽에서 비중격을 제거하여 중앙선 상피 솔기를 노출시키고, 조직 사이의 상피층이 손상되지 않고 온전한지 확인합니다.이제 35 mm 유리 바닥 디쉬에 라이브 이미징 배지를 넣고, 절제한 구개 돌기를 구강측이 아래로 향하게 하여 유리 바닥에 최대한 밀착시켜 넣습니다. 그 다음, 이미징 배지 내 아가로스의 응고를 빠르게 하기 위해 배양 디쉬 근처의 전도성 표면에 드라이아이스 펠릿을 놓습니다. 아가로스가 반고체 상태가 되면, 37 °C 인큐베이션 챔버가 장착된 도립 공초점 현미경에 배양 디쉬를 장착하고, 주사기를 사용하여 배양 디쉬와 배양 커버 사이에 바세린을 도포하여 이미징 배지의 증발을 방지합니다.저배율 대물렌즈를 선택하여 관심 영역을 찾습니다. 그 다음, 고배율 대물렌즈를 선택하고 적절한 레이저 여기를 사용하여 5 µm 간격으로 여러 z-stack을 16~24시간 동안 스캔합니다. 입천장 절편 배양의 생체 이미징을 통해 입천장 융합을 매개하는 여러 세포 과정이 드러나며, 두 상피 세포 사이의 초기 접촉은 막 돌출물에 의해 이루어집니다.두 상피층이 만나면 다세포 층의 정중선 상피 이음매(midline epithelia seam)를 형성하며, 이후 상피 수렴(epithelia convergence)을 통한 세포 간 삽입(intercalation)이 일어나 통합된 단일 세포층의 정중선 상피 이음매가 생성됩니다. 더 깊은 z축 레벨에 있는 상피 세포들 또한 점진적으로 정중선 상피 이음매의 구강 측으로 밀려나며 상피 수렴 과정에 기여합니다. 중간 입천장 정중선 상피 이음매에서는 후방 방향의 세포 이동이 관찰됩니다.구개 융합 과정에서 상피 세포의 탈출 현상이 관찰되었으며, 이는 정중선 상피 솔기의 상피 세포들이 이러한 능동적인 과정에 의해 제거될 수 있음을 시사합니다. 통합된 상피 솔기는 결과적으로 분해되어 연속성을 달성하게 됩니다. 또한, filamentis actin이 상피와 중간엽 영역 사이의 경계에 농축되어 전후축을 따라 케이블 형태의 구조를 형성합니다.실험에 사용된 리포터 신호에 따라 가장 적합한 세포 추적 방법이 달라지며, 소프트웨어를 사용하여 구개 융합 과정 중 관심 있는 특정 세포 행동을 추적할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

시간이 지남에 따라 생물을 생활에 세포 융합을 추적하는 방법을 설명합니다. 접근 이용 Cre...

세포 융합의 탐지를위한 Cre - 훈제 연어 P 재조합 접근법 VIVO에서</em

출처: Pietruczyk, E. A., et al. 마우스의 추궁 절제술 및 척수 창 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 생체 내 이미징을 위해 마취된 마우스에 척수 창을 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 붕규산 커버 유리와 3D 프린팅 백플레이트를 사용하여 노출된 척수를 안정화합니다. 이 방법을 사용하면 고해상도 2광자 현미경을 사용하여 혈액-뇌 장벽 역학 및 신경혈관 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

생체 내 이미징을 위한 마우스의 척수 창 이식

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

구개 개발의 연구는 구개열, 엄청난 의료 부담을 부과하고 외관을 손상하는 지속 남길 수 있습니다 출생 결함의 발생에 의해 좌우된다. 우리는 여기서 구개 개발 및 융합에 관련된 다른 신호 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다 배양 구개 선반 기술을 보여준다.

정적 장기 문화를 사용하여 구개 퓨전 공부의 방법

이 프로토콜은 살아있는 동물 내 생물체 검사를 사용하여 실시간으로 CCL5 매개 periosteal skeletal 줄기 세포 이동의 검출을 설명합니다.

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

우리는 2차원 (2D) 성장 및 상처 복구 분석의 시간 경과 화상 진찰을 위한 1 차적인 마우스 배아 성 구형 중간엽 세포의 격리 그리고 문화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 세포 스트림 형성 및 방향 운동성을 결정하기 위하여 시간 경과 화상 진찰 데이터의 분석을 위한 방법론을 제공합니다.

집단 운동 특성을 분석하기 위해 1차 마우스 배아 성 성 메센키메 세포의 격리 및 시간 경과 이미징

이 프로토콜은 교체 가능한 뚜껑 (R.MIW)이있는 새로운 유방 이미징 창을 설명합니다. R.MIW의 이식 후 생체 내 현미경 검사는 다른 발달 단계에서 세포 해상도로 건강하고 병든 유선의 종방향 및 다일 이미징을 허용합니다.

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Oronasal Fistula 마우스 모델 구축

면역형광 이미징은 복잡하고 시간에 따라 달라지는 생물학적 과정을 단 한 번의 스냅샷으로 관찰할 수 있는 능력에 제약을 받습니다. 이 연구는 정밀하게 절단된 쥐의 턱밑샘 절편에 대해 수행된 실시간 이미징 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 이 접근법을 통해 항상성 중 세포-세포 상호 작용과 재생 및 복구 과정을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

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생체 외 라이브 이미징은 생체 조직에서 세포 움직임과 상호 작용의 동적 과정을 연구하기 위한 강력한 기술입니다. 여기에서는 배양된 전체 성체 마우스 앞니에서 치아 상피 세포를 실시간으로 추적하기 위해 이광자 현미경을 구현하는 프로토콜을 제시합니다.

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중개 암 연구에서 생체 내 현미경 및 자기 공명 영상의 결합을 위한 Dorsal Skinfold Window Chamber 종양 마우스 모델

배우세요 생쥐 이차 구개 융합의 공초점 현미경 라이브 이미징 방법을 통해 두개안면 발달 중 세포 역학을 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 발달생물학 연구에 활용됩니다.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

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