2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

이 실험의 전반적인 목표는 신경 줄기 세포에서 뉴런 또는 신경교세포로 계통이 진행되는 동안 세포 행동을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 대칭 및 비대칭 세포 분열의 역할, 세포주기 연장 및 세포 성장 속도와 같은 신경 발달 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 장기간 세포 계통을 관찰할 수 있다는 것입니다.

이를 통해 단일 계통 내에서 신경 발생에서 신경교 발생으로의 전환을 관찰하고 sublinear neural 및 glial 전구 세포의 직접적인 comporation을 수행할 수 있습니다. 먼저 5-10개의 e14 배아에서 뇌를 저온 해부 배지로 페트리 접시에 넣습니다. 집게를 사용하여 피부와 두개골을 조심스럽게 꺼내고 뇌를 분리하십시오.

실체 현미경 아래에서 작업하는 동안 해부 겸자를 사용하여 수막을 제거합니다. 그런 다음 중간에 텔렌스팔론을 분할하여 반구를 분리합니다. 배외측 텔렌팔론(dorsolateral telencephalon)을 분리하기 위해, 배측 곡선(dorsomedial curve)과 팔리오(pallio) 및 팔리움하(subpallium) 경계를 따라 자릅니다.

모든 뇌가 해부될 때까지 배외측 뇌를 얼음 위에서 박리 매체가 있는 2mL 튜브로 옮깁니다. 배외측 뇌파를 미세 절제한 후 조직을 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 그런 다음 수집된 조직을 냉 해부 매체에서 섭씨 4도, G 340배에서 5분 동안 원심분리하여 조직을 침전시킵니다.

탈수 후 피펫으로 상층액을 제거하고 섭씨 37도 0.05%트립신-EDTA 1mL를 첨가하여 화학적 분해를 합니다. 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후 2mL의 증식 배지를 첨가하여 트립심 활성을 억제합니다.

그런 다음 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 가스 버너 또는 분젠 버너에 몇 초 동안 연마하여 조리개를 약간 좁힙니다. 피펫 끝을 코팅하기 위한 Asperate FCS. 그런 다음 기포가 생성되지 않도록 주의하면서 위아래로 피펫팅하여 화염 연마 및 FCS 코팅된 파스퇴르 피펫으로 세포를 기계적으로 해리합니다.

340 시간 G.Remove에 섭씨 4도에 5 분 동안 해리된 세포를 피펫으로 상층액을 제거하고, 그 후에 증식 매체의 1 밀리미터를 추가하고 피펫을 사용하여 세포를 refuset 세포를 refuse. Poly-D-Lysine으로 전처리된 플레이트에서 PBS를 제거합니다. 그런 다음 영점을 결정하기 위한 참조로 사용할 수 있는 플레이트 바닥에 기호를 그립니다.

증식 배지에서 세포를 두 번째로 재현탁시킨 후, 0.4% 트리판 블루 용액을 사용하여 세포 현탁액을 일대일 희석합니다. 계수 챔버 슬라이드에 로드하고 염색되지 않은 생존 가능한 세포의 수를 계수합니다. 생존 불가능한 세포는 파란색입니다.

증식 배지에서 세포를 희석하여 밀리미터당 10에서 6번째 세포를 얻습니다. 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 세포를 배양합니다. 레트로바이러스 형질도입 세포를 이미지화하려면 조직 배양판을 온도 및 이산화탄소 컨트롤러에 연결된 이미징 챔버에 배치하여 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 일정한 조건으로 유지합니다.

xy축에서 영점으로 사용할 위치를 선택하고 영점을 보정합니다. 웰당 10-15개의 위치를 선택하여 10배 배율로 이미지화할 수 있습니다. 광독성을 줄이기 위해 5분마다 위상차 이미지를, 3시간마다 형광 이미지를 요구하도록 소프트웨어를 설정합니다.

온도가 평형을 이루는 동안 변경될 수 있으므로 실험의 처음 3시간 동안 초점을 확인하고 조정하십시오. 7일 후, 획득을 중지하고 이미징 후 면역세포화학을 진행합니다. 셀 추적 소프트웨어를 시작하고 사용자 이름을 선택합니다.

사용자 이름을 선택하고 계속하십시오. tTt 작업 폴더를 찾아 선택하여 계보 트리, 통계 및 내보낸 이미지를 저장합니다. 다음으로, 분석 및 로드할 실험을 선택합니다.

이미지가 이전에 tTt 변환기에 의해 변환된 경우 로그 파일 변환기를 클릭하고 로그 파일 변환기 창에서 연속된 두 시점 사이의 시간(초)을 지정합니다. 전체 실험에 대한 로그 파일 변환을 클릭합니다. 원하는 이미지를 수동으로 선택하거나 프로그램에 표시된 옵션을 사용하여 로드하십시오.

파일, 열기, 새 식민지를 선택합니다. 추적을 클릭한 다음 추적 시작을 클릭하여 선택한 위치에서 추적을 시작합니다. 영화 창이 나타납니다.

추적 원을 사용하여 셀을 선택하고 0 키를 누릅니다. 소프트웨어는 다음 프레임으로 이동합니다. 마우스를 사용하여 추적 셀 주위에 추적 원을 계속 배치하고 각 프레임에서 0을 클릭하여 셀에 추적 표시를 추가합니다.

키 1과 3을 사용하여 이전 또는 다음 프레임으로 이동합니다. 트랙 마크를 삭제하려면 표시할 올바른 위치를 클릭하고 0을 누르기만 하면 됩니다. 세포가 분열된 경우 셀 편집기 창에서 셀 중 하나를 선택하여 추적, 중지 이유, 분할 및 하나의 딸 세포 추적을 계속한 다음 추적, 추적 시작을 선택합니다.

두 번째 딸 셀을 추적하려면 셀 편집기에서 해당 셀을 선택하고 F2 키를 누릅니다. 비디오 현미경 검사 중에 세포가 죽었다면 세포사멸(apoptosis)을 선택합니다. 세포가 관찰 영역을 벗어나거나 인접 세포와 섞여 추적을 방해하는 경우 lost를 선택합니다. 추적을 중지하고 나중에 계속하려면 인터럽트를 클릭하십시오.

셀 편집기 창에서 추적하는 동안 트리가 생성됩니다. 계보 트리를 저장하려면 셀 편집기 창에서 파일, 저장, 현재 트리를 선택합니다. 추적 데이터가 있는 동영상을 내보내려면 추적 모드를 끄고 동영상 창에서 동영상 내보내기를 선택합니다.

프레임의 형식 범위, 초당 프레임 수 및 비트 전송률을 설정합니다. 내보내기 시작을 클릭합니다. 다음 현미경 사진은 1차 대뇌 피질 세포 배양의 GFP 형광 이미지에서 위상차를 보여줍니다.

GFP 발현은 이미징 첫 몇 시간 동안에는 없습니다. GFP 발현 세포의 수는 시간이 지남에 따라 증가하고 GFP 형광의 강도는 이러한 이미지에서 노란색 화살표로 표시된 것처럼 증가합니다. 이전 이미지의 박스형 영역에서 이 고배율 이미지는 세포를 발현하는 GFP를 자세히 보여줍니다.

이러한 위상차 이미지는 세포 분열의 예를 보여줍니다. 전구 세포 라운드업(progenitors cell round up)이 여기에서 볼 수 있으며, 그 다음에는 세포막 수축(cell membrane constriction)이 나타나고 마지막으로 유사분열(mitosis)이 완료됩니다. 이것은 단일 세포 계통 트리의 예입니다.

색깔이 있는 화살표는 세포 분열의 다른 모드를 나타내고, 대칭 증식 분열은 노란색 화살표로 표시됩니다. 비대칭 분할은 파란색 화살표로 표시됩니다. 대칭 말단 분열은 빨간색 화살표로 표시되고 X는 세포 사멸을 나타냅니다.

숫자는 전구 세포의 세포주기 길이를 나타냅니다. 이 기술은 제대로 수행되면 1-2시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 줄기세포가 뉴런 또는 신경교세포로 진행되는 세포 계통 진행 중 세포 행동을 보여주는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.