Name: 2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 2D 배양 시스템을 사용하여 원발성 대뇌피질 세포의 라이브 이미징 기술로 신경줄기세포에서 뉴런 및 신경교세포로의 분화 과정을 실시간 관찰하는 방법을 익히세요.

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이 작품은 CNPq (게 나시오날 드 Desenvolvimento Científico e Tecnológico), 망 (Coordenação de Aperfeiçoamento 데 피해 드 높이 등)에 의해 지원 되었다, FAPERN (Fundação de Amparo 검색 할 리오 그란데 노르 테 할).

이 프로토콜에 설명된 살아있는 동물을 대상으로 하는 모든 실험은 국내 및 국제 법률에 따라 수행되며 라이선스 009/2014에 따라 지역 대학 동물 관리 및 사용 위원회(CEUA/UFRN)의 승인을 받았습니다. 다음 프로토콜은 무균 환경에서 수행됩니다. 기본 세포 배양에 대한 지식이 있어야 합니다.
1. 배외측 Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>해부 배지(100mL) 준비: 98.5mL Hank's Balanced Salt Solution(HBSS), 0.5mL 5M HEPES pH 7.4, 1mL 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 및 10,000 μg/mL).</li>
	<li>해부 매체를 필터 살균합니다.</li>
	<li>임신한 마우스 C57/Bl6(Mus musculus)에서 이소플루란으로 마취한 배아 14일(E14) 배아를 제거합니다. 
	참고: E0를 질 마개 감지의 날로 간주하십시오. 해부는 임신한 쥐에서 제거한 후 1시간 이내에 완료해야 합니다. 이 프로토콜은 배아 E11-E17에도 적용됩니다.</li>
	<li>무균 상태에서 자궁절제술로 배아를 제거합니다.</li>
	<li>배아를 냉박부 매체(4°C)가 있는 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>세로 균열을 따라 절단하여 두개골에서 뇌를 제거합니다. 배아의 수는 보통 5개에서 10개까지 다양하다. 각 E14 뇌는 전구 세포와 유사 분열 후 뉴런을 포함하여 약 2 x 106 세포를 생성합니다 (1 : 1 비율) 
	알림: 다음 단계를 위해 실체 현미경을 사용하십시오.</li>
	<li>해부 겸자를 사용하여 수막을 제거합니다. 반구를 분리하기 위해 중간에 텔렌스팔론을 분할합니다. 배외측 텔뇌팔론을 분리하려면 해부 겸자를 사용하여 배측 곡선과 구골-팔하경계 경계를 따라 자릅니다. 모든 뇌가 절개될 때까지 배외측 텔뇌팔론을 냉박부 매체(4°C)가 있는 2mL 튜브로 옮깁니다.</li>
</ol>
2. 세포 해리 및 도금
<ol>
	<li>증식 배지 준비(DMEM+10% FCS 50mL): 44mL Dulbecco Modified Eagle's Medium(DMEM), 5mL 태아 송아지 혈청(FCS), 0.5mL 40% 포도당, 0.5mL 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 및 10,000 μg/mL). 증식 매체를 필터 살균합니다.</li>
	<li>분화 배지 준비(DMEM 50mL+2% B27): 48mL DMEM, 1mL B27, 0.5mL 40% 포도당, 0.5mL 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 및 10,000 μg/mL). 분화 매체를 필터 멸균합니다.</li>
	<li>E14 마우스에서 배외측 텔렌스팔론을 미세 해부한 후, 수집된 조직과 냉 해부 배지가 있는 튜브를 원심분리하여(4°C에서 5분, 340 x g) 조직을 침전시킵니다.</li>
	<li>피펫으로 상등액을 제거하고 화학적 분해를 위해 예열된(37°C) 트립신-EDTA(0.05%) 1mL를 추가합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다.트립신 활성을 중지하기 위해 2mL의 증식 배지를 추가합니다.</li>
	<li>유리 파스퇴르 피펫의 끝을 가스 버너 또는 분젠 버너에 몇 초 동안 연마하여 조리개를 약간 좁힙니다. 팁을 코팅하기 위해 FCS를 흡인하여 피펫을 세척합니다. 기포를 피하고 불로 연마되고 FCS로 코팅 된 파스퇴르 피펫으로 세포를 기계적으로 해리하십시오.</li>
	<li>세포를 원심분리합니다(4°C, 340 x g에서 5분 동안). 피펫으로 상층액을 제거합니다. 1mL의 증식 배지를 추가하고 피펫을 사용하여 세포를 재현탁합니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.</li>
	<li>0.4% Trypan Blue 용액을 사용하여 세포 현탁액을 1:1 희석합니다. 생존 불가능한 세포는 파란색입니다. Neubauer 챔버를 사용하여 생존 가능한 세포(염색되지 않은)의 수를 계산합니다.</li>
	<li>증식 배지에서 세포를 희석하여 106 cells/mL를 얻습니다. 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 500μL의 세포 현탁액을 추가합니다(약 2.5 ×10 5 cells/cm2). 37 °C 및 5% CO2. 에서 세포 배양
	알림: 유리 커버 슬립은 실험 중에 움직이고 관찰 영역을 변경할 수 있으므로 사용하지 마십시오. 또는 유리 바닥 조직 배양 플레이트를 사용합니다. 
	참고: 세포 배양 처리된 다품종을 사용하지 않는 경우 37°C에서 Poly-D-Lysin(50μg/ml)으로 플레이트를 2시간 전처리하는 것이 중요합니다. PDL 처리된 플레이트는 증류수로 세척한 후 4°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>
3. 레트로바이러스 매개 형질주입(Retroviral-mediated Transfection)
참고: 이 방법은 전구 세포만 transfection하는 간단한 방법입니다. 그러나 다른 바이러스 벡터 또는 화학적/전기적 transfection을 사용하여 배양된 세포에 관심 유전자를 삽입할 수 있습니다.
<ol>
	<li>유전자 발현을 조작하고 형광 리포터 단백질로 세포를 라벨링하려면 세포 도금 2시간 후 관심 유전자를 가진 플라스미드를 운반하는 레트로바이러스를 추가합니다. 
	참고: 레트로바이러스 벡터는 분열하는 세포의 게놈에만 통합됩니다. 따라서 증식이 높을 때 세포를 감염시키는 것이 중요합니다. 
	참고: 베타-액틴/CMV 융합 서열(CAG)과 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는 플라스미드를 사용한 후 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 암호화 서열(pCAG-IRES-GFP44)을 사용했습니다. CAG promoter와 IRES sequence37 사이에서 관심 유전자를 복제할 수 있습니다.</li>
	<li>레트로바이러스를 분화 배지에서 희석하여 mL당 원하는 입자 수를 얻습니다. 각 웰에 레트로바이러스가 포함된 분화 배지 500μL를 추가합니다. 
	참고: 사용되는 레트로바이러스의 양은 역가에 따라 다르며 웰당 50-100개의 감염된 세포를 얻을 수 있도록 계산해야 합니다. 이 역가는 분리된 GFP 발현 클론을 식별할 수 있게 하며, 그 관계는 위상 대비 이미지를 추적하여 추가로 확인할 수 있습니다(섹션 6 참조). 레트로바이러스의 적정은 동일한 세포 population45를 사용하여 수행해야 합니다.</li>
</ol>
4. 타임랩스 비디오 현미경 검사
참고: 이 단계에는 배양 챔버가 있는 도립 형광 현미경이 필요합니다(재료 표 참조).
<ol>
	<li>레트로바이러스 감염 후 조직 배양 플레이트를 온도 및 CO2 컨트롤러에 연결된 인큐베이터에 넣습니다. 
	참고: 이미징을 시작하기 3시간 전에 챔버를 예열하면 획득 중 드리프트 및 아웃포커스를 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 
	참고: 챔버는 37°C 및 5% CO2의 일정한 조건에서 셀을 유지해야 합니다.</li>
	<li>XY축에서 0점(XY = 0)으로 사용할 위치를 선택합니다. 이를 통해 참조는 예를 들어 이미징 후 면역세포화학(섹션 5 참조) 후에 나중에 위치를 다시 찾을 수 있습니다. 
	알림: 영점을 결정하기 위한 참조로 사용할 수 있는 기호를 플레이트에 그리는 것이 좋습니다.</li>
	<li>10X 배율로 이미징할 위치를 선택합니다. 
	참고: 웰당 10-15개의 위치를 선택하여 레트로바이러스 형질 주입된 세포를 관찰할 가능성을 높입니다. 
	참고: 장거리 고배율 대물렌즈(20X 또는 40X)를 사용하여 고해상도 이미지를 얻을 수 있습니다. 대물렌즈의 작동 거리에 따라 유리 바닥 플레이트가 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>5분마다 위상차 이미지를 획득하고 3시간마다 형광 이미지를 획득하여 광독성을 줄입니다. 온도가 평형을 이루는 동안 변경될 수 있으므로 실험의 처음 3시간 동안 초점을 확인하고 조정하십시오. 매일 초점을 확인하고 조정하십시오. 
	참고: 처음 24시간 후에 초점이 안정되는 것을 관찰합니다. 그러나 초점을 모니터링하는 것이 좋습니다.또는 소프트웨어 기반 자동 초점 시스템을 사용하십시오.</li>
	<li>7일 후, 획득을 중지하고 이미징 후 면역세포화학을 진행합니다(섹션 5 참조).</li>
	<li>면역세포화학(immunocytochemistry) 후 현미경 인큐베이터의 플레이트를 교체하고, 영점을 찾고, XYZ = 0을 재설정하고, 저장된 위치로 실험을 다시 로드합니다. 적절한 형광 필터를 사용하여 각 위치의 형광 이미지를 획득합니다.</li>
</ol>
5. 이미징 후 면역세포화학
<ol>
	<li>배양 7일 후 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA) 고정액으로 세포 배양을 고정합니다. 
	주의 : PFA는 독성이 있으므로 화학 흄 후드에서 취급해야 합니다.</li>
	<li>0.5mL PBS 0.1M로 5분 동안 헹굽니다. 3회 반복합니다.</li>
	<li>4°C에서 0.5% 트리톤과 10%의 PBS 0.1 M. 에서 일반 염소 혈청을 하룻밤 동안 1차 항체에서 배양합니다.
	참고: 항 미세소관 관련 단백질 2(MAP2) 항체를 사용하여 신경 표현형(마우스 IgG1, 1:1,000)을 확인하고 항 GFP를 사용하여 형질도입된 세포(닭 항체, 1:500)를 표시합니다. 다른 항체를 사용하여 전구 세포 또는 신경교세포를 검출할 수 있습니다.</li>
	<li>0.5mL PBS 0.1M로 5분 동안 헹굽니다. 3회 반복합니다.</li>
	<li>PBS 0.1M에 0.5% 트리톤과 10%의 일반 염소 혈청에 2차 항체를 희석하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 권장 희석량: 1:1,000.</li>
	<li>0.5mL PBS 0.1M로 5분 동안 헹굽니다. 3회 반복합니다.</li>
	<li>핵 염색의 경우 PBS 0.1M에서 0.1μg/mL 4'6'-디아미노-2-페닐린돈(DAPI)으로 5분 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>0.5mL PBS 0.1M로 5분 동안 헹굽니다. 3회 반복합니다.</li>
	<li>세포를 PBS 0.1M로 유지하고 빛으로부터 보호하십시오(예: 호일로 플레이트 포장).</li>
</ol>
6. 세포 추적
참고: 여기에서는 재료 표에 제공된 링크에서 사용할 수 있는 tTt(The Tracking Tool) 소프트웨어를 사용하여 타임랩스 비디오 현미경 데이터를 분석하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다.
참고: 다른 소프트웨어로 이미지 획득을 수행하는 경우 tTt 설치 프로그램에서 사용할 수 있는 tTt Converter를 사용하여 이미지 데이터를 가져옵니다(자료 표에 제공된 링크). png, tif 또는 jpg 이미지 형식만 허용됩니다. tTt 변환기를 시작한 후 그림 1 A - B에 표시된 단계를 따릅니다.
<ol>
	<li>소프트웨어 tTt를 시작하고 사용자 이름을 선택합니다. "사용자 추가" 및 "계속" 버튼을 클릭합니다(그림 2A). "TTTWorkFolder"(그림 2B)를 찾아 선택합니다. 계보, 나무, 통계 및 내보낸 이미지가 이 폴더에 저장됩니다. 다음으로, 분석할 실험을 선택하고 로드합니다(그림 2B).</li>
	<li>이미지가 이전에 tTt Converter에 의해 변환된 경우 "LogFileConverter"(그림 3A)를 클릭하고 LogFileConverter 창에서 연속된 두 시점 사이의 시간(초)을 지정합니다. "Convert log files for whole experiment"(그림 1C)를 클릭합니다.</li>
	<li>tTt 창에 나타나는 이미지 목록에서 수동으로로드하거나 프로그램에 표시된 옵션을 사용하여 원하는 이미지를 선택하십시오. 이미지를 로드합니다(그림 3).</li>
	<li>파일 > 새 콜로니 열기> 선택합니다. "추적"을 클릭한 다음 "추적 시작"을 클릭하여 선택한 위치에서 추적을 시작합니다.</li>
	<li>동영상 창이 나타납니다(그림 4). 추적 원을 사용하여 셀을 선택하고 키 0을 누릅니다. 소프트웨어는 다음 프레임으로 이동합니다. 마우스를 사용하여 추적된 셀 주위에 추적 원을 계속 배치하고 각 프레임에서 0을 클릭하여 셀에 추적 표시를 추가합니다.</li>
	<li>키 1과 3을 사용하여 각각 이전 또는 다음 프레임으로 이동합니다. 트랙 마크를 삭제하려면 표시할 올바른 위치를 클릭하고 0을 누르기만 하면 됩니다.</li>
	<li>셀이 분할된 경우 "분할" 버튼을 선택합니다(그림 4). Shift+D를 눌러 하나의 딸 셀을 계속 추적합니다. 두 번째 딸 셀을 추적하려면 셀 편집기에서 해당 셀을 선택하고 F2 키를 누릅니다.</li>
	<li>비디오 현미경 검사 중에 세포가 사멸한 경우 "apoptosis"(그림 4)에서 파란색 사각형)을 선택합니다. 
	참고: 소프트웨어에서는 이 사건을 "세포사멸(apoptosis)"이라고 표시하지만, 다른 메커니즘이 세포 사멸의 원인이 될 수 있습니다.</li>
	<li>세포가 관찰 영역을 벗어나거나 인접 세포와 섞여 추적을 방해하는 경우 "lost"(그림 4)를 선택합니다.</li>
	<li>추적을 중지하고 나중에 계속하려면 "인터럽트"(그림 4). 를 클릭합니다.
	참고: 셀 편집기 창에서 추적하는 동안 트리가 생성됩니다. 계보 트리를 저장하려면 파일 > 현재 트리> 저장(셀 편집기 창)을 선택합니다.</li>
	<li>다른 셀 추적을 시작하려면 마우스 오른쪽 버튼을 사용하여 셀을 클릭하거나 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 셀을 선택하고 추적 > 추적 시작을 클릭합니다.</li>
	<li>추적 데이터가 있는 동영상을 내보내려면 소프트웨어가 "추적 모드"에 있지 않아야 합니다. 추적 모드를 끄려면 6.10단계를 실행합니다. 영화 창에서 > 동영상 내보내기를 선택합니다. 형식, 프레임 범위, 초당 프레임 수 및 비트 전송률을 설정합니다. "내보내기 시작"을 클릭합니다.</li>
</ol>
7. 수량화
참고: 비디오 현미경 data46을 사용하여 여러 측정을 수행할 수 있습니다. 여기에서는 나중에 "대표적인 결과" 섹션에서 예시되는 세 가지 가능성에 대해 설명합니다.
<ol>
	<li>서로 다른 시점에 살아 있는 세포의 수를 개별 클론 내에서 이러한 시점에 도달하기 전에 생성된 총 세포 수로 나누어 각 세포 계통에 대한 세포 생존을 정량화합니다.37.</li>
	<li>대칭 전구 세포(SP, 두 딸 세포가 모두 증식하는 경우), 비대칭(A, 한 딸 세포는 계속 증식하고 다른 하나는 유사분열 후가 됨) 또는 대칭 말단(ST, 두 딸 세포가 모두 유사분열 후 전환)의 비율을 정량화합니다.15,38.</li>
	<li>세포의 생성과 분열 사이의 증식 세포의 시간 범위를 계산하여 세포주기의 길이를 측정합니다15.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

실시간으로 관찰 기본 대뇌 피 질 세포의 세포 증식의 분석, 세포 분열, 세포 주기 길이, 세포 분화 및 세포 생존3,14,,1537의 모드 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 신경3NSCs에서 진행 하는 동안 제정 중간 단계의 식별으로 이어지는 단일 세포 계보의 연구 허용. 마지막으로, 공학 도구를 조작 유전자 발현이 문화 시스템의 조합 선택된 대상5셀 자치 효과 연구에 강력한 기술입니다. 여기 설명 하는 방법은 공부 NSCs 다른 소스38,42에서 고립 뿐 아니라 다른 발달 단계<sup class='xre...

신경 줄기 세포 (NSC)는 대뇌 피 질 개발 중 신경 및 macroglial 셀을 생성합니다. 초기-corticogenesis, NSCs 대칭 세포 분열의 여러 라운드를 받 다 고 뿌리 풀 확장. 다음, NSCs 나누기 비대칭 중간체1를 통해 직접 또는 간접적으로 뉴런을 생성 합니다. 에 중반-에 늦은-corticogenesis, 창시자 이다 및 oligodendrocytes2,,34생성 하 전환 합니다. 그러나, 운명 제한 창시자 독특한 종류의 신경 또는 macroglial 세포의 생성에 기여 뿐만 아니라 세포 증식 및 분화, 제어 하는 완전 한 메커니즘 강렬한 토론4,,56의 문제가 남아 있습니다. 광범위 하 게 공부 생체 외에서 그리고 vivo에서 와 같은 수많은 기법을 사용 하 여 신경, 이다 oligodendrocytes를 생성 하기 위해 개별 외피 NSCs의 잠재력 되었습니다: 단일 셀 문화7,8,9,10,11,,1213; 이미징 라이브 고밀도 문화 문화3,,1415; 이미징 라이브 라이브 이미징 슬라이스 문화16,,1718; 바이러스 성 벡터 중재 유전 라벨 고밀도 문화14,15,19,,2021;를 사용 하 여 클론 분석 클론 분석에 비보에 레트로 바이러스22,23,,2425,26,27,28,29,30,31,32,33;를 사용 하 여 그리고 클론 분석에 vivo에서 유전자 변형 동물34를 사용 하 여.
이러한 기술을 각각 장점과 단점을 제공합니다. 예를 들어, 혈통 추적 vivo에서 총괄 한 그리고 분할 오류3, 개별 외피 창시자의 잠재력에 대 한 상반 된 결론을 이끌어을 받기 쉽습니다. 또한, 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문 초기 시간 포인트에서 조상 세포의 라벨에 따라 그리고 후부 분석 세포 계보의 혈통-진행35동안 세포 죽음의 들 키 지 않고 발생에 의해 영향을 수 있습니다. 따라서, 단일 NSCs의 잠재력 분석 하기 적합 한 시스템 생성 하는 모든 셀의 식별 뿐만 아니라 혈통 내에서 세포 운명의 적절 한 묘사를 허용 해야 합니다. 1 차 세포 배양 및 라이브 이미징의 조합에는이 설정을 제공합니다. 단일 세포 배양 및 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여, 사원 외. 스위치에에서 나타났습니다 gliogenesis11성체에서 개별 대뇌 피 질 창시자의 계보. 나중에, 그들은 뉴런의 종류는 단일 외피 조상12에서 생성 됩니다 보여 동일한 시스템을 사용. 그러나,이 시스템 중요 한 경고 표시: 4 이상의 자손9의 클론을 생성 하는 이른 corticogenesis에서 절연 외피 창시자의 1%만. FGF2 추가 후 4 명 이상 세포 생성 세포의 주파수 8-109증가 합니다. 그럼에도 불구 하 고,이 숫자는 너무 작은이 단계에서 거의 모든 대뇌 피 질의 창시자는 증식을 고려. 또한, 운명 사양에 FGF2의 잠재적인 효과36배제할 수 없다. 고밀도 세포 배양 (Pax6 표현) 심 실 둘 다의 확산을 지 원하는 사용이 한계를 우회 하 고 subventricular (Tbr2 표현) 대뇌 피 질의 창시자15. 또한, 이러한 문화의 실시간 관찰 NSC 혈통 진행의 여러 가지 기능 세포 분열, 세포 주기 길어, 잠재력 단일 셀의 신경 및 명과, 다른 사람의 사이에서 생성 하는 모드 등이 조건 하에서3,15재현은 보이고 있다. 최근에, 우리는 또한 사용이 시스템 그 쥐37에서 미 성숙한 대뇌 피 질 뉴런의 세포 생존에 영향을 미치는 CREB 신호 보여. 따라서, 우리가 믿는 그 시간 경과 비디오 현미경 기본 murine 대뇌 피 질의 고밀도에 성장 하는 세포는 세포 주기 진행의 세포 및 분자 메커니즘, 세포 분열, 세포 생존 및 세포 운명 명세 모드를 공부 하는 강력 하 고 액세스할 수 도구. 후자는 수행할 수 있습니다 실시간38,,3940 에 특정 세포 운명의 식별 또는 immunocytochemistry3,38,,4142후 이미징의 사용을 허용 하는 유전자 변형 동물을 사용 하 여.
여기, 우리는 기본 대뇌 피 질 세포 배양 지원 NSCs의 확산 및 신경 및 macroglial 세포의 다음 세대를 준비 하는 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 우리는 또한 식별 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여 단일 셀 수준에서 추적 될 수 있는 개별 세포의 유전자 발현 조작 transfection retroviral 중재의 사용 설명. 설치류에 corticogenesis의 끝에 처음부터 격리 기본 대뇌 피 질 세포를 공부 하이 프로토콜을 사용할 수 있지만 몇 가지 조정 단계14에 따라 필요할 수 있습니다. 다른 소스에서 분리 하는 NSCs 또한 공부 될 수 있다 2D 문화의 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여 하지만 적절 한 자란 시스템 셀 동작 생체 외에서 그리고 vivo에서38,43를 비교 하 여 결정 되어야 한다.

<table><tbody><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>14175129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td>: <td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>B27</td>, <td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.05%)</td><td>, Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td>, <td>시그마</td><td>16005</td><td></td></tr>, <tr><td>염소 혈청</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>69023</td><td></td></tr>, <tr><td>트리톤 X-100</td>, <td>VWR International Ltd.</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>시그마</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>안티 MAP2, 마우스</td><td>시그마</td><td>M4403</td><td></td></tr><tr><td>안티 GFP 치킨</td><td>Aves</td><td>0511FP12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 알렉사 594</td><td>인비트로젠</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 닭 알렉사 488</td><td>인비트로젠</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tTt</td><td>ETH 취리히</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 관찰자 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>추적 도구(tTt) 소프트웨어</td><td></td><td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td><td>다운로드 링크</td></tr></tbody></table>

2d 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

대뇌 피 질 개발, 조상 세포 새로운 창시자 또는 postmitotic 신경 생성 하 대칭 및 비대칭 세포 분열의 여러 라운드를 받 다. 나중에, 일부 창시자 gliogenic 운명에 사이토와 oligodendrocyte 인구에 추가 전환 합니다. 기본 대뇌 피 질 세포 배양의 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여, 세포 분열의 모드와 조상 세포의 세포 주기 매개 변수 제어 세포 및 분자 메커니즘 연구 가능 하다. 마찬가지로, postmitotic 세포의 운명은 셀 전용 형광 기자 단백질을 사용 하 여 또는 포스트 immunocytochemistry 이미징 시험 될 수 있다. 더 중요 한 것은, 이러한 기능을 모든 종류의 특정 세포 생성 하기 위해 노력 하는 창시자의 식별 수 있도록 단일 세포 수준에서 분석할 수 있습니다. 유전자 발현의 조작 또한 바이러스 중재 transfection, 세포 자치 및 셀을 자치 현상의 연구를 수를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 퓨전 형광 단백질의 사용 부문 및 딸 세포 운명과 상관 하는 동안 선택 된 단백질의 대칭 및 비대칭 분포의 연구를 수 있습니다. 여기, 우리는 며칠에 대 한 기본 대뇌 피 질 murine 셀을 이미지 하 여 세포 분열, 세포 주기 길이 및 새로 생성 된 셀의 운명의 모드 분석 시간 경과 비디오 현미경 방법 설명. 우리는 또한 transfect 조상 세포의 유전자를 조작 하거나 단순히 기자 단백질 셀 라벨에 적용할 수 있는 간단한 방법을 설명 합니다.

E14 배아에서 분리한 대뇌 피질 세포의 일차 배양물에는 전구 세포와 신경 세포가 모두 포함되어 있습니다. 이미징 기간 동안 전구 세포는 여러 차례의 세포 분열을 거치며 세포 수를 증가시킵니다(그림 5 및 비디오 그림 1).
소수의 전구 세포에 레트로바이러스 매개 형질전환을 수행하면 세포 클론의 식별이 용이해집니다(그림 6). GFP 발현은 24시간 후에 검출 가능하다는 점에 유의하십시오. 이 시점에서 위상차 이미지 내의 GFP 발현 세포를 식별하고, 이를 역추적하여 계보를 완성할 수 있습니다. 여기에 포함된 GFP 이미지는 다음과 같은 이유로 대비가 낮습니다: 1) 레트로바이러스 도입 며칠 후 내인성 GFP 발현이 관찰되었습니...

라이브 영상 실시간에 세포 행동을 공부 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 시간 경과 비디오-현미경 기본 대뇌 피 질 세포의 차별화 된 뉴런을 명과 기본 신경 줄기 세포에서 혈통 진행 동안 제정 단계의 상세한 검사를 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다.

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

본 실험의 전반적인 목표는 신경줄기세포에서 뉴런 또는 글리아세포로 이어지는 계보 진행 과정 동안의 세포 행동을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 대칭 및 비대칭 세포 분열의 역할, 세포 주기 연장 및 세포 성장률과 같은 신경발달 분야의 의문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 장기간에 걸쳐 세포 계보를 관찰할 수 있다는 점입니다.이를 통해 단일 계보 내에서 신경발생에서 글리아발생으로의 전환을 관찰하고, 하위 계층의 신경 및 글리아 전구세포를 직접 비교할 수 있습니다. 우선 차가운 해부 배지가 담긴 페트리 접시에서 e14 배아 5~10개로부터 뇌를 적출하는 것으로 시작합니다. 핀셋을 사용하여 피부와 두개골을 조심스럽게 제거하고 뇌를 분리하십시오.실체 현미경 하에서 해부용 핀셋을 사용하여 뇌막을 제거합니다. 그다음, 말단뇌의 중앙을 나누어 양쪽 대뇌 반구를 분리합니다. 배외측 말단뇌를 분리하려면 배내측 곡선과 외투막 및 하외투막 경계를 따라 절개하십시오.모든 뇌의 박리가 완료될 때까지 배측 외측 종말뇌(dorsolateral telencephalons)를 박리 배지가 담긴 얼음 위의 2mL 튜브로 옮깁니다. 배측 외측 종말뇌의 미세 박리 후, 조직을 15mL 원추형 튜브에 넣습니다. 그다음, 수집된 조직이 담긴 차가운 박리 배지 튜브를 4°C에서 340 ×g로 5분 동안 원심 분리하여 조직을 침전시킵니다.원심분리 후, 피펫을 사용하여 상청액을 제거하고 화학적 소화를 위해 37°C의 0.05% Trypsin-EDTA 1mL를 첨가합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, Trypsin 활성을 억제하기 위해 증식 배지 2mL를 첨가합니다.다음으로, 가스 버너나 분젠 버너 위에서 유리 파스퇴르 피펫의 끝부분을 몇 초 동안 가열하여 구멍을 약간 좁게 만듭니다. 피펫 끝을 코팅하기 위해 FCS를 흡입합니다. 그런 다음, 기포가 생기지 않도록 주의하며 화염 연마 및 FCS 코팅이 된 파스퇴르 피펫으로 피펫팅을 반복하여 세포를 기계적으로 분리합니다.분리된 세포를 4°C에서 340 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 피펫으로 상층액을 제거한 후, 증식 배지 1 mL를 첨가하고 피펫을 사용하여 세포를 재현탁합니다. Poly-D-Lysine으로 전처리된 플레이트에서 PBS를 제거합니다. 그다음, 영점을 결정하는 기준점으로 사용할 수 있도록 플레이트 바닥에 표시를 합니다.세포를 증식 배지로 두 번째 재현탁한 후, 0.4% trypan blue 용액을 사용하여 세포 현탁액을 1:1로 희석해 준비합니다. 이를 계수 챔버 슬라이드에 로딩하고 염색되지 않은 생존 세포의 수를 측정합니다. 생존하지 않은 세포는 파랗게 염색됩니다.증식 배지에서 세포를 희석하여 mm³당 10⁶개의 세포가 되도록 합니다. 24-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 500 µL를 넣고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. 레트로바이러스가 도입된 세포를 이미징하려면, 세포를 37 °C, 5% CO₂의 일정 조건으로 유지할 수 있도록 온도 및 이산화탄소 조절기가 연결된 이미징 챔버에 조직 배양 플레이트를 넣습니다.xy축에서 기준점으로 사용할 위치를 선택하고 영점을 보정합니다. 웰당 10배 배율로 촬영할 10~15개의 위치를 선택합니다. 광독성을 줄이기 위해 위상차 이미지는 5분마다, 형광 이미지는 3시간마다 획득하도록 소프트웨어를 설정합니다.온도가 평형에 도달하는 동안 초점이 변할 수 있으므로, 실험 시작 후 첫 3시간 동안 초점을 확인하고 조정하십시오. 7일 후, 획득을 중단하고 이미징 후 면역세포화학 염색으로 진행하십시오. 세포 추적 소프트웨어를 실행하고 사용자 이름을 선택하십시오.사용자 이름을 선택하고 계속 버튼을 클릭하십시오. 계통수, 통계 및 내보낸 이미지를 저장할 tTt 작업 폴더를 찾아 선택하십시오. 다음으로, 분석 및 로드할 실험을 선택하십시오.이미지가 이전에 tTt 컨버터로 변환되었다면, log file converter를 클릭하고 log file converter 창에서 두 연속 시간 지점 사이의 초 단위를 지정하십시오. 전체 실험에 대해 convert log files를 클릭하십시오. 원하는 이미지를 수동으로 선택하여 로드하거나 프로그램에 표시된 옵션을 사용하여 로드하십시오.파일을 선택하고 열어 새로운 콜로니를 지정합니다. 트래킹(tracking)을 클릭한 다음, 트래킹 시작(start tracking)을 클릭하여 선택한 위치에서 트래킹을 시작합니다. 그러면 동영상 창이 나타납니다.추적 원을 사용하여 세포를 선택하고 0 키를 누르십시오. 소프트웨어가 다음 프레임으로 이동합니다. 마우스를 사용하여 추적 원을 추적할 세포 주변에 계속 배치하고, 각 프레임에서 0을 클릭하여 세포에 추적 표시를 추가하십시오.1번과 3번 키를 사용하여 이전 또는 다음 프레임으로 이동하십시오. 트랙 마크를 삭제하려면 표시할 정확한 위치를 클릭하고 0번을 누르십시오. 세포가 분열한 경우, [Tracking] - [Stop Reason] - [Division]을 선택한 다음, 세포 편집기 창에서 딸세포 중 하나를 선택하여 해당 세포의 추적을 계속하고, [Tracking] - [Start Tracking]을 선택하십시오.두 번째 딸세포를 추적하려면, 세포 편집기에서 해당 세포를 선택하고 F2를 누르십시오. 비디오 현미경 관찰 중 세포가 사멸한 경우 apoptosis를 선택하십시오. 세포가 관찰 영역을 벗어나거나 인접한 세포들과 섞여 추적이 불가능한 경우 lost를 선택하십시오. 추적을 중단하고 나중에 계속하려면 interrupt를 클릭하십시오.셀 에디터 창에서는 추적 중에 계통도가 생성됩니다. 계통도를 저장하려면 셀 에디터 창에서 파일, 저장, 현재 계통도를 선택하십시오. 추적 데이터가 포함된 동영상을 내보내려면 추적 모드를 끄고, 동영상 창에서 동영상 내보내기를 선택하십시오.프레임 범위의 포맷, 초당 프레임 수 및 비트 전송률을 설정하십시오. 내보내기 시작을 클릭하십시오. 다음 광미세구조 사진은 일차 대뇌 피질 세포 배양의 GFP 형광 이미지 내 위상차를 보여줍니다.이미징 시작 후 처음 몇 시간 동안은 GFP 발현이 나타나지 않습니다. 시간이 지남에 따라 GFP 발현 세포의 수가 증가하며, 이 이미지들의 노란색 화살표가 나타내는 바와 같이 GFP 형광 강도가 증가합니다. 이전 이미지의 상자 영역을 확대한 이 고배율 이미지는 GFP 발현 세포를 상세히 보여줍니다.이 위상차 현미경 이미지들은 세포 분열의 한 예를 보여줍니다. 여기에서는 전구세포가 둥글게 변하는 모습이 관찰되며, 이어서 세포막 수축이 일어나고 마지막으로 체세포 분열이 완료됩니다. 이것은 단일 세포 계보 트리의 한 예입니다.색깔 화살표는 서로 다른 세포 분열 모드를 나타내며, 노란색 화살표는 대칭적 증식 분열을 나타냅니다. 파란색 화살표는 비대칭 분열을 나타냅니다. 빨간색 화살표는 대칭적 종말 분열을 나타내며, X는 세포 사멸을 나타냅니다.숫자는 전구 세포의 세포 주기 길이를 나타냅니다. 이 기술은 적절하게 수행될 경우 1~2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 줄기세포에서 뉴런 또는 글리아 세포로 이어지는 세포 계보 진행 과정 중의 세포 행동을 보여주는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

여기서 우리는 glial 피더 층의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 프로토콜을 제공합니다. 교양 뉴런은 극성을 설정하고 시냅스를 만들고, 이러한 전기 생리학, 칼슘 이미징, 세포 생존 assays, immunocytochemistry, 그리고 RNA / DNA / 단백질 분리 등 다양한 어플 리케이션에 사용하기 위해 glia에서 분리 수 있습니다.

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

실시간 이미징 배아 조직은 오랜 기간 동안 도전합니다. 여기에서 우리는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 오랜 기간 동안 여자가 척수의 세포와 하위 세포 변화를 감시하기위한 분석을 제시. 이 기술은 신경계와 개발 배아의 다른 지역에 맞게 조정 할 수 있습니다.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

이 비디오는 마우스 배아의 배측 뇌파에서 1차 대뇌 피질 세포를 분리하고 배양하는 프로토콜을 보여줍니다.

Isolation and Culturing of Cells from Mouse Embryo Dorsolateral Telencephalons(쥐 배아에서 세포 분리 및 배양)

출처: Gómez-Villafuertes, R., et. al., 세포 생물학 및 여러 신경 집단의 계통 진행을 모니터링하기 위한 실시간 이미징 후 단일 세포 추적.J. Vis. Exp. (2017) 비디오는 분열 및 분화를 포함한 세포 행동을 연구하기 위해 실시간으로 성체 신경 줄기 세포를 준비, 이미징 및 추적하는 과정을 보여줍니다.

 성체 신경 줄기 세포의 신경 계통을 모니터링하기 위한 라이브 이미징 및 단일 세포 추적

출처: Landeira, B. S.,et al., 2D 배양 시스템을 사용한 1차 대뇌 피질 세포의 라이브 이미징. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 타임랩스 이미징을 사용하여 형광 표지된 피질 전구 세포를 추적하고, 분열 및 분화를 모니터링하고, 1차 대뇌 피질 세포의 계통 발달을 연구하는 방법을...

형질주입된 1차 마우스 대뇌 피질 세포의 저속 촬영 이미징

암 세포와 뇌의 Organotypic 슬라이스 공 배양은 뇌 조직의 암 세포 침략의 과정에서 형광뿐만 아니라 시야 (비디오) 현미경으로 형태 학적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 전지 교환 및 보충 접근이 가능하며 조작 및 분석의 다양한 제공합니다.

뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

뒤에 소프트웨어 기반 후 처리 시간 경과 비디오 현미경에 의해 신경 인구를 모니터링 하는 강력한 프로토콜 설명 되어 있습니다. 이 메서드는 선택 된 인구 라이브 이미징 실험 동안에 생물 학적 이벤트를 식별 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

영상 모니터 세포 생물학과 여러 신경 인구의 계보 진행을 추적 하는 단일 셀 다음 라이브

제시 여기 경작 하는 수정 된 롤러 튜브 방법 이며 photoetched coverslips에 정확한 위치와 많은 주 동안 설치류 두뇌의 간헐적인 고해상도 이미징 조각. 신경 생존 및 슬라이스 형태로 잘 유지 됩니다. 셀 형 특정 식에 대 한 바이러스를 사용 하 여이 완전히 동봉 된 시스템의 응용 프로그램에 제공 됩니다.

정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

이 프로토콜 thalamocortical 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 organotypic cocultures에서 시상과 대뇌 피 질의 동시 이미징 하는 방법을 설명합니다. 개별 thalamocortical 축 삭 및 그들의 연 접 맨끝 DsRed와 GFP 태그 synaptophysin 단일 셀 electroporation 기법으로 시각화 됩니다.

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

배우세요 2D 배양 시스템을 사용하여 원발성 대뇌피질 세포의 라이브 이미징 기술로 신경줄기세포에서 뉴런 및 신경교세포로의 분화 과정을 실시간 관찰하는 방법을 익히세요.

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

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