Name: 시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 배우세요 시아노박테리아의 글리코겐 함량 측정법을 효소 기반 선택적 가수분해를 이용하여 분석하는 방법입니다. 이 기술은 생리학, 분자유전학, 대사공학 연구에 활용되며 높은 민감도와 특이성을 제공합니다.

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저자는 노르딕 에너지 리서치 (AquaFEED, 프로젝트 번호 24), 덴마크 Innovationfonden Denmark (프로젝트 번호 12-131844), Villum Fonden (프로젝트 번호 13363)

1. 준비 <ol><li> 시아 노 박테리아 배양 <ol><li> 성장 Synechocystis sp. 1 % (v / v) CO 2가 보충 된 일정한 공기 공급으로 30 ℃에서 액체 BG11 배지 8 에서 PCC 6803. 50 μmol photon / m 2 / s의 광합성 광자 자속 밀도에서 빛으로 문화를 지속적으로 조명하십시오. </li><li> 성장하는 Synechococcus sp. PCA 7002는 1 % (v / v) CO 2가 보충 된 일정량의 공기가 공급되는 액체 A + 배지 23 (BG11 배지도 사용 가능). 온도는 37 ° C이어야합니다. 150 μmol photon / m 2 / s의 광합성 광자 자속 밀도에서 빛으로 문화를 지속적으로 조명하십시오. </li><li> 1cm의 빛 경로와 함께 큐벳을 사용하여 730 nm에서 문화의 광학 밀도 (OD)를 측정합니다. OD 값이 0.8 이상이면 적절한 희석을하여 th에 비례하는 OD 측정 값을 얻으십시오e 세포 농도. 참고 : 아래 제시된 프로토콜은 액체 배양에 적합하며 OD 730nm 값이 2 이상인 세포 밀도가 있습니다. 전형적으로 1보다 작은 OD 730nm 값을 갖는 지수 성장 단계의 배양 물을 원심 분리 및 완충액 또는 배지에서 재현 탁하여 OD 730nm 값이 2 이상이 되도록 세포 밀도를 농축시킨다. </li></ol></li><li> 완충액 및 시약 <ol><li> pH 8에서 50 mM Tris-HCl 완충액을 만든다. </li><li> pH 5에서 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액을 만든다. </li><li> 50 MM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5)에 8 U / mL amyloglucosidase의 저장 용액을 만든다. </li><li> 50 MM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5)에 2 U / mL의 α- 아밀라아제의 저장 용액을 만든다. </li><li> 증류수를 사용하여 0 ~ 100 μg / mL 농도의 메이크 루카스 표준 용액을 만듭니다. </li><li> D- 포도당 분석 키트 (GODPOD 형식)에서 GOD-POD 시약 준비, f제조업체의 지시를 따르십시오. </li></ol></li></ol> 2. 세포 건조 중량의 결정 (선택 사항) <ol><li> 배양액 또는 세포 재 현탁액 2 mL (1.1 단계 참조)를 2.0 mL 튜브에 옮기고 6,000 xg 및 4 ° C에서 5 분간 원심 분리한다. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 물 1 ML에 펠렛을 Resuspend 및 5 분 6,000 XG 및 4 ° C에서 원심 분리기. 뜨는을 버리고 물 0.5 ML에 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 현가 장치를 미리 무게를 측정 한 알루미늄 트레이에 옮깁니다. 하룻밤 건조 (약 18 시간)하기 위해 트레이를 105 ℃의 건조 오븐으로 옮긴다. 중요 : 손가락에서 재료가 전달되지 않도록 트레이를 집게로 다루는 것이 중요합니다. 동일한 조건에서 비어있는 사전 무게가있는 알루미늄 트레이를 건조시켜 건조 중에 용지함의 중량 손실을 확인합니다. </li><li> 건조 후 오븐에서 트레이를 꺼내어 주변 온도에서 평형을 유지하게하십시오5 분간 정치 한 후 0.0001 g의 정확도로 계량하십시오. 참고 :이 값은 셀 건조 중량 기준으로 글리코겐 함량을 표준화하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 시아 노 박테리아 세포의 용해 <ol><li> 배양 물 또는 세포 재 현탁액 (1 단계 참조) 1 mL를 1.5 mL 튜브에 옮기고 6,000 xg 및 4 ° C에서 10 분간 원심 분리한다. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 50mM Tris-HCl, pH 8 1 ML에 펠렛을 Resuspend하고 10 분 동안 6,000 XG와 4 ° C에서 원심 분리기. 상층 액을 버리고 Tris-HCl 완충액 1 mL에 세포 펠렛을 재현 탁한다. 과정을 반복하십시오. </li><li> 철저히 50 MM 트리스 - HCl 버퍼, 산도 8 500 μL에 펠렛을 resuspend. 중요 : 효율적인 세포 용해를 위해 펠렛을 잘 부유시킵니다. 얼음에 resuspension을 보관하십시오. </li><li> 4에서 resuspended 세포를 lyse ° C ultrasonication의 30주기를 수행하여, 각주기는 최대 진폭과 20 kHz의 주파수에서 30 초 구성된,없이 90 초. 참고 :이 방법은 Synechococcus sp.를 효율적으로 용해 할 수 있습니다. PCC 7002. <ol><li> 또는 세포 resuspension을 나사 캡 튜브로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 튜브에 지르코늄 산화물 비즈를 추가하십시오. 조직 homogenizer에 튜브를 설정하고 4에서 세포를 해동 ° C의 두주기를 실행하여 각주기는 5의 주파수 설정에서 5 분으로 구성된 각주기. 참고 :이 방법은 효율적으로 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002. </li></ol></li><li> 6,000 xg 및 4 ° C에서 10 분 동안 용 해물이 담긴 튜브를 원심 분리하십시오. 참고 : 펠렛은 주로 큰 세포 파편으로 구성되어야합니다. 상당한 수의 끊어지지 않은 셀이 있으면 3.4 단계를 반복하십시오. 얼음에 뜨는 것을 유지하십시오. </li><li> 상용 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오. 참고 :이 값은 글리코겐 함량을 표준화하는 데 사용할 수 있습니다단백질 함량 기준. </li></ol> 4. 글리코겐 침강 <ol><li> 96 % (V / V) 에탄올과 1.5 ML 스크류 캡 튜브에서 단계 3.5에서 뜨는의 100 μL의 900 μL를 혼합하여 세포 lysate에서 엽록소 a 를 제거합니다. 뚜껑을 닫은 후 표준 실험실 가열 블록을 사용하여 90 ° C에서 10 분간 가열합니다. </li><li> 30 분 동안 얼음에 튜브를 품어. </li><li> 튜브를 20,000 xg 및 4 ° C에서 30 분간 원심 분리하고 조심스럽게 상등액을 제거합니다. 펠렛은 글리코겐을 함유하고있다. 과량의 에탄올을 제거하기 위해 펠렛을 가볍게 건조시킵니다. 중요 : 펠릿의 과도한 건조는 피해야하며, 그렇지 않으면 단계 5.1에서 용해시키기가 어려워진다. </li><li> 선택적 : 엽록소에게 콘텐츠를 결정하기 위해 664 nm에서의 단계 4.3에서 얻어진 상청액의 흡광도를 측정한다. 84.6 L / g / cm 24 의 흡수 계수를 사용하십시오. 참고 :이 값은 normalize에 사용될 수 있습니다.e 글리코겐 함량. </li></ol> 5. 효소 가수 분해 및 글리코겐 결정 <ol><li> 단계 4.3에서 얻은 펠렛을 50 MM 나트륨 아세테이트 (pH 5) 100 μL에서 용해시키고 8 U / mL 아밀로 글루코시다 아제 50 μL와 2 U / mL α- 아밀라아제 50 μL를 첨가한다. 소용돌이를 사용하여 이러한 물질을 잘 혼합하십시오. 참고 : 글리코겐 펠렛이 점성을 띄기 때문에 피펫 팅을 통한 혼합은 권장하지 않습니다. </li><li> 글루코오스 분자로 glycogen의 소화를 가능하게하기 위해 2 시간 가열 블록에 60 ° C에서 혼합물을 품어. </li><li> 샘플을 10,000 xg에서 5 분간 원심 분리하고 상층 액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다. </li></ol> 6. GOD-POD 시약을 사용하여 총 포도당 함량 측정 <ol><li> GOD-POD 시약을 사용하여 단계 5.3에서 얻은 상청액의 포도당 농도를 측정합니다. 단계 5.3의 상층 액 100 μL를 96- 웰 플레이트의 웰에 옮긴다. 부정적인 통제로서,50 mM sodium acetate (pH 5) 100 μL를 사용하십시오. 검량선을 생성하려면 혈당 표준 용액도 측정하십시오. </li><li> 각 샘플에 GOD-POD 시약 150 μL를 넣고 pipetting으로 신속하게 혼합하십시오. </li><li> 플레이트를 25 ° C에서 30 분 동안 정치한다. 플레이트 판독기를 사용하여 510 nm에서 흡광도 값을 기록하십시오. </li><li> 포도당 표준에서 얻은 검량선을 사용하여 포도당의 농도를 계산하십시오. 참고 : 세포 용 해물의 글리코겐 농도는 글루코스 농도 (μg / mL)로 표시됩니다. </li></ol>

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프로토콜 내에서 중요한 단계는 글리코겐 침전 및 재 부유입니다. 에탄올 침전 후 원심 분리 후, 글리코겐은 미세 원심 분리 튜브의 벽에 느슨하게 부착되는 반투명 펠렛을 형성한다. 따라서 상등액을 제거 할 때 pellet을 제거하지 않도록 특별한주의가 필요합니다. 글리코겐 펠렛은 끈적 거리며, 건조되면 가용화가 어려울 수 있습니다. 글리코겐 펠렛의 완전한 가용화는 중요하지 않은데, 이는 불완전한 가용화로 인해 비효율적 인 효소 분해가 유발 될 것이고, 따라서 기술 복제간에 큰 차이가 발생할 수 있기 때문이다. 볼 텍싱에 의한 가용화 전에 초음파 처리를 적용하면 공정을 촉진시킬 수있다. 표준화 방법의 선택과 관련하여 셀 건조 중량은 널리 사용되는 참고 자료입니다. 단백질과 엽록소의 측정보다 더 힘들고 더 많은 세포 바이오 매스가 필요하다.a . 전체 단백질 함량은 세포 바이오 매스에 대한 대안적인 참조를 제공하며, 본 프로토콜에 기술 된 바와 같이 소규모로 결정될...

남조류는 광합성 광 고정 CO 2에서 탄소의 주요 탄수화물 저장소로서 글리코겐을 축적. 글리코겐은 α-1,6- 연결 글루코 실 결합에 의해 생성 된 가지를 갖는 선형 α-1,4- 결합 글루칸으로 구성된 글리 칸이다. 시아 노 박테리아에서의 글리코겐 생합성은 포스 포 글루코 튜 타제와 ADP- 글루코스 피로 인산화 효소의 순차적 작용을 통해 글루코오스 -6- 인산을 ADP- 글루코스로 전환시키는 것으로 시작한다. ADP- 포도당의 글루코오스 잔기는 하나 이상의 글리코겐 합성 효소 (GlgA)에 의해 글리코겐의 α-1,4- 글루칸 백본의 비 환원 말단으로 전달된다. 이어서, 분지 효소가 α-1,6- 결합 된 글루코 실 결합을 도입하고, 글리코겐 입자를 생성하도록 추가 확장시킨다. 어둠 속에서 글리코겐은 글리코겐 포스 포 릴라 제, 글리코겐 탈 분기 효소, α- 글루 카노 트랜스퍼 라제 및 말토 덱스트린 포스 포 릴라 제에 의해 인산화 된 글루코오스와 유리 글루코스로 분해됩니다. 이러한 피드 int산화성 오탄당 인산 경로, Embden-Meyerhof-Parnas 경로 (glycolysis), Entner-Doudoroff 경로 1 , 2 , 3 , 4를 포함한 이화 경로. 시아 노 박테리아의 글리코겐 대사는 시아 노 박테리아가 햇빛에 의해 화학 물질과 연료를 생산하는 미생물 세포 공장으로 발전 할 가능성이 있기 때문에 최근 몇 년 동안 관심이 증가하고 있습니다. 글리코겐은이 박테리아에서 가장 큰 유연한 탄소 저장고이기 때문에 글리코겐 대사가 생성물의 수율을 높이기 위해 변형 될 수 있습니다. 예는 cyanobacterium Synechococcus sp. 만니톨을 생산하기 위해 유 전적으로 조작 된 PCC 7002; 글리코겐 합성의 유전 파괴는 만니톨 수율 3 ~ 5 배 증가한다. 또 다른 예는 글리코겐이 함유 된 야생에서 바이오 에탄올을 생산하는 것입니다ype Synechococcus sp. PCC 7002 6 . 야생형 세포 글리코겐 함량은 질소 기아 동안 세포의 건조 중량의 60 %까지 될 수 있습니다 6 . 최근 글리코겐 대사와 조절에 대한 우리의 이해 또한 넓어졌습니다. 글리코겐은 빛에 축적되어 어둠 속에서 대사되는 것으로 알려져 있지만, 딜주기 동안의 글리코겐 대사의 상세한 동역학은 최근 Synechocystis sp.에서 드러났다. PCC 6803 7 . 또한, 글리코겐의 축적에 영향을 미치는 몇 가지 유전자가 확인되었습니다. 주목할만한 예는 추정 히스티딘 키나아제 PmgA와 비 암호화 RNA PmgR1이 조절 캐스케이드를 형성하고 글리코겐의 축적을 제어한다는 발견이다. 흥미롭게도, pmgA 및 pmgR1 결실 돌연변이 체는 Synechocystis sp.의 야생형 균주의 2 배의 글리코겐을 축적한다. PCC 68038 , 9 . 기타 규제 요소는 대체 시그마 인자 E와 전사 인자 CyAbrB2 (10), (11)을 포함하여 글리코겐의 축적에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 글리코겐 조절 및 신진 대사에 대한 관심이 증가함에 따라 글리코겐 함량의 결정을 설명하는 상세한 프로토콜이 보증됩니다. 여러 가지 방법이 문헌에서 사용된다. 산에 의한 가수 분해와 펄스에 의한 암페어 검출기 또는 산과 페놀로 처리 한 분광 측정으로 결합 된 고압 음이온 교환 액체 크로마토 그래피를 통한 모노 사카 라이드 함량 측정은 글리코겐 함량 9 , 10 , 12 , 13 을 근사하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 그러나, 고압 음이온 교환 액체 크로마토 그래프c기구는 매우 고가이며 일부 시아 노 박테리아 종에 축적되는 것으로 알려진 수크로오스 14 , 글루코 실 글리세롤 15 및 셀룰로오스 16 , 17 , 18 과 같은 다른 글루코오스 - 함유 글리코 콘쥬 게이트로부터 유도 된 것에서 글리코겐 유래의 글루코 구별하지 않는다. 산 - 페놀 방법은 표준 실험실 장비를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 그러나, 그것은 매우 독성 시약을 사용하고 다른 glycoconjugates에서 파생 된 포도당을 구별하지 않으며, 당분자, lipopolysaccharides 및 세포 외 매트릭스 12 같은 세포 물질을 구성하는 다른 monosaccharides에서 포도당을 구분하지 않습니다. 특히, 고온 산 - 페놀 분석은 포도당 함량의 특정 측정보다는 총 탄수화물 함량의 측정에 종종 사용됩니다 12 . 효소 적알파 - 아밀로 글루코시다 아제에 의한 글리코겐의 글루코오스로의 효소 - 결합 분석을 통한 글루코스 검출은 글리코겐으로부터 유도 된 글루코스에 매우 민감하고 특이적인 비색계 판독 값을 생성한다. 에탄올 5 , 8 , 19에 의한 세포 용 해물로부터의 글리코겐의 특이 적 침전으로 특이성을 더욱 향상시킬 수있다. 여기에서 가장 널리 연구 된 시아 노 박테리아 종인 Synechocystis sp.에서 글리코겐 함량의 효소 기반 분석을위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002, 야생형 및 돌연변이 균주에서. 효율적인 가수 분해를 보장하기 위해 α- 아밀라아제와 α- 아밀로 글루코시다 아제의 칵테일을 사용합니다 8 . Endo-acting α- 아밀라아제는 다양한 글루칸의 α-1,4- 결합을 덱스트린으로 가수 분해하여 더 가수 분해됩니다엑소 아밀 글루코시다 제 20 을 엑소 - 작용하여 포도당을 생성한다. 이러한 효소의 상승 효과는 잘 알려져 있으며 식물 바이오 매스 21 의 셀룰로오스와 같은 다른 당 결합제에 영향을 미치지 않으면 서 글리코겐과 같은 α 결합 글루칸 인 전분의 선택적 가수 분해에 일상적으로 사용됩니다. 방출 된 포도당은 과산화수소에서 산소의 환원과 포도당의 락톤으로의 산화를 촉진하는 포도당 산화 효소와 과산화수소로부터 핑크색 퀴 노니 민 염료를 생성하는 과산화 효소로 구성된 효소 결합 분석법에 따라 정량적으로 검출됩니다. 페놀 화합물, 4- 아미노 안티피린 22 .

<table><tbody><tr><td>QSonica Sonicators Q700</td><td>Qsonica, LLC</td><td>NA</td><td>QSonica</td></tr><tr><td>SpectraMax 190 마이크로플레이트 리더&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Eliza 플레이트 리더</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M-CE</td><td>비즈 비터</td></tr><tr><td>Ultrospec 3100 pro UV/Visible 분광광도계</td><td>Amersham Biosciences</td><td>NA</td><td>분광광도계</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>완충액</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1-00317</td><td>pH 조절</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>나트륨 Sigma-Aldrich</td><td>32319</td><td>완충액</td></tr><tr><td>Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)</td><td>글리코겐 해체를 위한</td> <td>Megazyme</td><td>E-AMGPU</td> 효소</tr><tr><td>&알파;-아밀라제, 열안정성 (Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3176</td><td>글리코겐 해체화를 위한</td></tr><tr><td>효소 D-Glucose</td><td>Merch</td><td>8337</td><td>포도당 분석 표준</td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>23225</td><td>단백질 농도 측정용</td></tr><tr><td>알루미늄 건조 트레이, 일회용</td><td>VWR</td><td>611-1362</td><td>세포 건조 중량 측정용</td></tr><tr><td>D-Glucose assay kit(GODPOD 형식)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td>포도당 농도 측정용</td></tr><tr><td>산화지르코늄 빵, 0.15mm</td><td>Next Advance</td><td>ZrOB015</td><td>세포 용해용 비드 Bullet Blendar Storm</td></tr><tr><td>RINO 튜브</td><td>Next Advance</td><td>NA</td><td>튜브: Bullet Blendar Storm의 세포 용해를 위한</td> 튜브</tr></tbody></table>

시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

시아 노 박테리아는 글리코겐을 광합성 과정에서 주요 세포 내 탄소와 에너지 저장 물질로 축적합니다. 최근의 연구 결과는 생합성 및 이화 과정의 산화 환원 조절, 산화 환원 조절 및 비 암호화 RNA의 관련을 포함한 글리코겐 대사의 복잡한 기전을 강조했다. 동시에, 생산량을 향상시키기 위해 글리코겐의 탄소를 유 전적으로 생산 된 시아 노 박테리아의 바람직한 제품으로 방향을 바꾸려는 노력이 이루어지고 있습니다. 여러 방법이 다양한 정확도와 기술적 복잡성을 지닌 시아 노 박테리아의 글리코겐 함량을 결정하는 데 사용됩니다. 여기, 표준 생명 과학 실험실에서 수행 할 수있는 시아 노 박테리아의 글리코겐 함량을 신뢰할 수있게 결정하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 세포 lysate에서 글리코겐의 선택적 석출과 글루코스 단량체를 생성하는 글리코겐의 효소 해중합을 포함하며, 이는 글루코스 옥시idase-peroxidase (GOD-POD) 효소 커플 링 분석. 이 방법은 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002, 신진 대사 공학에서 널리 사용되는 두 개의 모델 시아 노 박테리아 종. 또한,이 방법은 조절 요소 또는 글리코겐 생합성 유전자가 결핍 된 야생형과 돌연변이 체 사이에서 글리코겐 함량의 차이를 성공적으로 나타냈다.

10 mL의 야생형 Synechocystis sp. PCC 6803은 OD 730nm 값이 약 0.8에 도달 할 때까지 광 자기 영양 조건 하에서 성장시켰다. 세포를 수확하고 50 mM Tris-HCl, pH 8에 재현 탁시켰다. OD 730 nm 값을 2-3으로 조정 하였다. 상기 한 프로토콜에 따라 글리코겐 함량을 분석 하였다. OD 730nm 당 글리코겐 함량은 13 ± 1.8 μg / mL / OD 730 nm ( N = 12)이었다. 글리코겐 함량은 단백질 함량에 비례하여 0.24 ± 0.03 μg / μg ( N = 12)이었고 엽록소 a 함량에 대한 글리코겐 함량은 5.7 ± 0.6 μg / μg ( N = 12)이었다. 사용 가능한 물질의 양이 적기 때문에 셀 건조 중량의 측정이 생략되었습니다. 유...

여기, 시아 노 박테리아 세포에서 글리코겐 함량을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 쉬운 분석법을 제시합니다. 이 과정은 침전, 선택 가능한 해중합 및 포도당 잔류 물의 검출을 수반한다. 이 방법은 야생형 및 유 전적으로 변형 된 균주 모두에 적합하며 시아 노 박테리아의 대사 공학을 촉진 할 수 있습니다.

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

본 절차의 전반적인 목표는 효소 기반의 선택적 가수분해 및 분석법을 사용하여 사이아노박테리아의 글리코겐 함량을 측정하는 것입니다. 이 방법은 조사 대상인 다양한 사이아노박테리아 균주의 생리학, 분자 유전학 및 바이오엔지니어링과 같은 사이아노박테리아 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소규모 규모에 적합하고, 수행하기 쉬우며, 글리코겐에 대해 높은 민감도와 특이성을 갖는다는 점입니다.이 방법은 남조류에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, E.Coli, 효모, 미세조류 및 다양한 종속영양 및 광영양 미생물과 같이 글리코겐이나 전분을 축적하는 다른 미생물에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 남조류 배양액 준비부터 이 프로토콜을 시작하십시오. 1mL의 남조류 배양액 또는 세포 현탁액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.그 다음 6,000 ×g, 4 °C에서 10분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후 펠렛을 1 mL의 50 mM Tris-HCL pH 8에 다시 현탁합니다. 현탁된 펠렛을 이전과 동일하게 원심 분리합니다.상층액을 버리고, 세포 펠렛을 Tris-HCL 완충액에 두 번째로 재현탁합니다. 이전과 동일하게 튜브를 원심 분리하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 500 µL의 50 mM Tris-HCL 완충액(pH 8)에 펠렛을 완전히 재현탁합니다.효율적인 용해를 위해서는 펠렛이 잘 현탁되어야 합니다. 재현탁액은 얼음에 보관하십시오. 20 kHz 주파수와 최대 진폭으로 30초간 초음파 처리하고 90초간 휴지하는 과정을 30회 반복하여 4°C에서 재현탁된 세포를 용해하십시오.용해물이 들어 있는 튜브를 6,000 ×g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 펠렛은 주로 큰 세포 파편으로 구성되며, 상층액을 향후 분석에 사용합니다. 이 단계에서 단백질 정량 키트를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.1.5 milliliter 스크류 캡 튜브에 에탄올 900 microliters와 얻은 상층액 100 microliters를 혼합하여 세포 용해물에서 chlorophyll a를 제거합니다. 캡을 닫은 후, 표준 실험실 가열 블록을 사용하여 튜브를 90 degrees Celsius에서 10분 동안 가열합니다. 그런 다음, 튜브를 얼음에 30분 동안 안착시켜 배양합니다.다음으로, 튜브를 20,000 ×g, 4 °C에서 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 글리코겐 합성효소 활성을 추정하기 위한 분광광도계 분석을 설명합니다. 이 방법은 시간이 지남에 따라 NADH의 흡수율 감소에 의존하며 글리코겐 합성효소 활성을 나타냅니다.

글리코겐 합성효소 활성을 결정하기 위한 분광광도계 분석

이 비디오에서는 특성화되지 않은 구조를 가진 글리코겐 샘플의 분지 정도를 결정하기 위한 정성적 분광 광도계 분석에 대해 설명합니다. 특성화되지 않은 샘플의 흡광도 최대값을 알려진 분지형 구조를 가진 다당류의 흡광도 최대값과 비교하면 특성화되지 않은 샘플에 분지화가 존재함을 나타냅니다.

글리코겐 분지화의 정도를 측정하기 위한 글리코겐 분지화 분석

우리는 여기에서 체외에서 글리코겐의 적정에 대한 정확한 재현하고 편리한 생화학 적 방법을 설명합니다. 이 기술은 ABCAM 글리코겐 분석 키트를 사용하여 형광 적정 포도당과 포도당 글리코겐의 연속적인 가수 분해에 기초한다.

글리코겐의 생화학 적정<em&gt; 체외</em

여기, 선물이 양적 phycobiliprotein cyanobacterium Synechocystis spectrophotometric 메서드를 사용 하 여에서 콘텐츠를 결정 하는 프로토콜. 추출 프로시저 또한 성공적으로 다른 박테리아 및 조류 긴장;에 적용 했다 그러나, 안료 흡수 스펙트럼에 있는 변이 때문 그것은 각 스트레인에 대 한 spectrophotometric 방정식을 개별적으로 테스트 하는 데 필요한입니다.

Spectrophotometric Cyanobacterium Synechocystis 에서 Phycobiliprotein 콘텐츠 결정

여기서, 시안박테리아 방출 된 탄수화물 중합체의 분리 및 그들의 엑소프로테옴의 격리에 대한 프로토콜이 설명된다. 두 절차 모두 추가 분석 또는 응용 분야에 사용할 수 있는 고순도의 중합체 또는 단백질을 얻기 위한 주요 단계를 구현합니다. 또한 특정 사용자 요구에 따라 쉽게 조정할 수 있습니다.

바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리

글리코겐 대사의 주요 효소의 활성을 측정하는 기술은 가시 범위에서 작동하는 간단한 분광 광도계를 사용하여 제시됩니다.

진핵 글리코겐 대사 연구를위한 분광 광도법

최적의 슈크로스 농도는 슈크로스 밀도 구배 원심분리를 사용하여 간 글리코겐의 추출을 위해 결정하였다. 글리코겐 분해 효소를 억제하기 위해 10분 끓는 단계를 추가하면 유익한 것으로 입증되었습니다.

글리코겐 구조 측정을 위한 간 글리코겐 분자 추출

현재 프로토콜은 불연속 자당 밀도 그라데이션을 통해 원심분리에 의한 시아노박테리아로부터의 피코빌리좀의 분리를 자세히 설명합니다. 그대로 피코빌리좀의 분획은 77K 형광 스펙트럼 및 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된다. 결과 물리경분획은 TEM 및 질량 분광법 분석의 음수 염색에 적합합니다.

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

본 프로토콜에서, 형광단-보조 탄수화물 전기영동(FACE) 기술은 글리코겐의 사슬 길이 분포(CLD) 및 평균 사슬 길이(ACL)를 결정하는데 사용된다.

형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE) 방법을 이용한 글리코겐의 글루칸 사슬 길이 분포 결정

전통적인 팁 기반 연속 희석 중 플라스틱 용기에 펩타이드 흡착은 효능 결정에 상당한 영향을 미치고 약물 발견의 선도 물질 식별 및 선도 물질 최적화 단계에 사용되는 구조-활성 관계의 이해를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 샘플의 자동화된 음향 비접촉 연속 희석 방법에 대해 설명합니다.

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

배우세요 시아노박테리아의 글리코겐 함량 측정법을 효소 기반 선택적 가수분해를 이용하여 분석하는 방법입니다. 이 기술은 생리학, 분자유전학, 대사공학 연구에 활용되며 높은 민감도와 특이성을 제공합니다.

시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

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