Name: 인간 지방 조직 Microvascular 함수 Videomicroscopy를 사용 하 여 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 학습하세요 비디오현미경을 이용한 인간 지방 조직 미세혈관 기능 평가 방법을. 고립된 소동맥의 생리적 특성을 분석하여 비만 관련 혈관 기능 장애의 분자 메커니즘을 규명하고 새로운 치료 표적을 발견할 수 있습니다.

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저자는 이러한 연구와 지방 조직 생체 검사를 제공 하기 위한 보스톤 의료 센터에서 외과 직원에 그들의 참여에 대 한 자원 봉사자 감사 하 고 싶습니다. 박사 Gokce HL081587, HL114675, 및 HL126141 건강 (NIH)의 국가 학회에 의해 지원 됩니다. 박사 Farb NIH에서 지원 K23 HL135394를 부여.

프로토콜 및 여기에 설명 된 예제에서 보스톤 대학 학교의 약 기관 검토 위원회 (IRB, 프로토콜 #H-25644)를 승인 했다 고 헬싱키 선언에 따라 실시 했다. 참여 하기 전에 서 면된 동의 제공 하는 모든 과목.
 1. 솔루션의 준비 및 마이크로 유리 뉼 <ol><li>준비 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic 산 성 염 (HEPES) 솔루션. 1 L에 대 한 8.059 g, NaCl 0.298 g, KCl 0.296 g MgSO 4 분해 &#8226; 7 H 2 O, 0.235 g CaCl 2 &#8226; 2 H 2 O, 0.16 g KH 2 포 4, 950 mL에 0.01 g EDTA, 1.081 g D-포도 당, 및 2.383 g HEPES 산 이온 물입니다. 이온을 제거 된 물 1 L에 볼륨을 확인 합니다. PH를 7.4 NaOH를 사용 하 여 조정 합니다. HEPES 버퍼 7 일 4에서 저장 될 수 있다 ° c.</li>
	<li>소금 버퍼 재고 x 20을 준비합니다. 1 L에 대 한 추가 143.8 g NaCl, KCl 7.0 g, 5.9 g MgSO 4 및 7.4 g CaCl 2 &#8226; 2 H 2 O 900 mL의 증류수에. 이온을 제거 된 물 1 L에 볼륨을 확인 합니다. 4 재고 솔루션을 저장 ° c.</li>
	<li>버퍼 재고 x 20을 준비합니다. 1 L 26.8 g NaHCO 3 및 0.2 g EDTA·2H 2 O 이온된 물 900 mL에 추가 합니다. 이온을 제거 된 물 1 L에 볼륨을 확인 합니다. 4 재고 솔루션을 저장 ° c.</li>
	<li>생리 실험 동안 사용할 KREBS 솔루션을 준비 합니다. 1 L, 이온된 물 900 mL, 버퍼 재고 x 20의 50 mL, 50 mL 소금 버퍼 솔루션, 0.99 g D-포도 당 및 0.16 g KH 2 포 4 x 20의 추가. PH를 7.4 HCl을 사용 하 여 조정 합니다. 버퍼의 pH를 유지 하려면 지속적으로 저 어와 파라핀으로 또는 지속적으로 거품.
	<ol><li>확인 전화 20 분 마다 매일 KREBS 솔루션 신선한 게.</li>
	</ol></li> <li>마이크로 유리 뉼 상용 바늘/피 펫 끌어당기는 사람을 사용 하 여 40-240 µ m의 내부 직경을 확인. 유리 뉼의 크기는 고립 된 혈관 (50-350 µ m)의 내부 직경의 크기에 의해 결정 됩니다. 또는, 미리 정해진된 크기의 마이크로-유리 뉼 구입.</li>
</ol> 2. 시 약의 준비 <ol><li>준비 아 세 틸 콜린 (Ach, 10 -2 M, 재고 솔루션). 18.29 g 10 mL 이온된 물에 용 해. 1 mL aliquots-80 ° c.에 재고 솔루션 (10 -2 M)의 저장 다음 작업 농도를 연속적으로 희석 실험의 날: 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.</li>
	<li>Papaverine (2 x 10 -2 M, 재고 솔루션)를 준비합니다. 0.07517 g 10 mL 이온된 물에 용 해. 준비 재고 솔루션 및 저장소-80에 10 µ L aliquots ° C. 직렬 실험의 하루에 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 M를 희석.</li>
	<li>는 Endothelin 1 (외 1, 2 x 10 -5 M, 재고 솔루션)를 준비합니다. 1%의 1 mL에 50 µ g endothelin-1 녹 BSA/PBS. 1 mL aliquots-80 ° c.에 재고 솔루션 (2 x 10 -5 M)의 저장 실험 실험의 하루에 10 -10 M의 작업 농도를 희석의 날.</li>
	<li>시 약 중-20 ° C에 저장 또는 냉장고의 종류에 따라 사용할 수 있는, 하지만 하지 6 개월 이상-80 ° C까지.</li>
</ol> 3. 지방 조직 수집 및 선박 준비 <ol><li>모집 비만 남자와 여자 (몸 질량 색인 (BMI) &#8805; 35 k g/m ², 나이 &#8805; 18 년) 보스톤 의료 센터 (BMC)에서 비만 수술 프로그램에 등록. 40 과목의 총이이 실험에 참가 했다.</li>
	<li>계획된 bariatric 수술 하는 동안 작업을 수행 하는 외과 의사에 의해 피하와 내장 지방 조직 샘플을 수집.
	<ol><li>수확은 피하 지방 조직을 더 낮은 복 부 벽에서 내장 지방 그레이터 omentum에서 각각. 전형적인 지방 조직 샘플 크기 3-10 mg의 조직에서 변화 한다.</li>
		<li>장소 조직을 즉시 차가운 HEPES 버퍼 ph 7.4와 최대 24 h. 4 ° C에서 저장소 솔루션 
		참고: 또한, 지방 arterioles 다른 유형의 헤 르 니 아 수리 등 성형 수술, 수술 중 뿐만 아니라 마른 개인에서 얻어질 수 있다 그리고 또한 수 트랜스 피부 복 부 지방 패드 생 검을 통해 피하 디포에서 biopsied 6.</li>
	</ol></li> <li>주변 지방과 결합 조직 (50-350 µ m intraluminal 직경, 길이 2-3 m m) 작은 지방 arterioles에서 제거 신중 하 게 조직 해 부 현미경, 마이크로-가 위 및 마이크로 집게를 사용 하 여,.</li>
	<li>Arterioles 유리 모 세관 펫에 cannulating 전에 작은 나일론 또는 실크 봉합을 사용 하 여에 모든 지점에서 넥타이. 신중 하 게 해 부하는 arterioles 되 벽의 사소한 손상 원인 중요 한 기능 변경 이후.
	빛과 열으로 <ol><li>최소화 배 노출 혈관 확장을 일으킬 수 있습니다. 그것은 때로는 어려울 수 있습니다 venules arterioles 구별, 이후 혈관의 끝 물에 의해 혈관의 크기 및 평활 근 음색을 식별 합니다. Arterioles는 일반적으로 더 작은 이며 venules에 비해 더 큰 톤.</li>
	</ol></li> <li>기관 챔버 준비. 천천히 KREBS 솔루션 10 mL 주사기를 사용 하 여 유리 모 세관 펫 및 고무 튜브를 작성.</li>
	<li>고무 튜브 채워지고 유리 모 세관 펫 챔버 내에 장기 KREBS 솔루션에 잠긴, 일단 안전 하 게 보안된 펫에 arterioles cannulate와 나일론 되의 두 끝을 묶어 또는 실크 봉합 사 매듭 신중 하 게.</li>
	<li>KREBS 솔루션과 장기 챔버를 채워 최대 2 mL.</li>
	<li>거꾸로 현미경 (배율 10 배 / 0.25 목표)와 함께 무대에 기관 실 확보 및 비디오 카메라.</li>
	<li>1 kHz의 샘플링 레이트에서 실시간에 스트리밍 가장자리 탐지 소프트웨어에 설정 (1 프레임/초).</li>
	<li>연결할 가압된 튜브의 한쪽 채워진된 압력 저수지 microbubbles, 무료로 KREBS 솔루션으로 거품 실험 오류를 발생할 수 있습니다. 기관 실에 가압된 튜브의 다른 쪽을 연결.</li>
	<li>깨끗 한 배관 압력 트랜스듀서에 KREBS 솔루션 가득 압력 저수지를 연결.</li>
	<li>제어이 두 저수지의 높이 조절 하 여 내부 luminal 흐름; 따라서 때 저수지에 배치 됩니다 같은 높이, 아니 내 luminal 흐름 발생 합니다.</li>
	<li>이러한 모든 프로세스가 완료 되 면 설정 37에 온도 유지 하기 위해 블록 및 소프트웨어 프로그램을 난방 ° C. 지속적으로 perfuse KREBS 솔루션과 선박 및 5% CO 2, 21% O 2와 N 74%의 가스 혼합 aerate 2 전체 실험 절차에 걸쳐 7 , 8.</li>
	<li>원하는 압력 insi 달성 하기드의 격리 된 선박 루멘 점차적으로 압력 제어 장치 묘 인터페이스 패널에서 내 피 층 손상을 방지 하기 위해 느린 속도로 이렇게 통해 intraluminal 압력 (5 mmHg, 매 5 분)를 증가. 
	참고: 압력 60 mmHg에 도달 하면, 20-30 분 평형 기간 필요 선박 안정 합니다. 모든 혈관 기능 연구 60 mmHg, pH 7.4에서 37 ° C에서 수행 됩니다. 7</li></ol> 4. 지방 Microvascular 함수의 평가 참고: 일반적으로, 많은 되 종속 내 피 혈관 확장 (흐름 유도)에 생리 적인 응답에 elicited 수 및 약리 자극 (Ach 유도).
<ol><li>흐름 중재, 종속 내 피 혈관 확장 <ol><li>가압, 다음 나머지 (디)에서 지방 되의 직경을 기록. 이 휴식 기준 직경으로 불린다.</li>
		<li>미리 endothelin 1의 1 µ L을 추가 하 여 ~ 55% 휴식 기준 직경 (Dp)의 혈관을 수축 (동부 표준시-1, 10 &#8722; 10 M) 목욕 및 효과 대 일 분 대기에 직접. 상태를 막혀서 미리 원하는 ~ 55%에 도달 될 때까지이 과정을 반복.</li>
		<li>압력 차이 평균 intraluminal 압력을 변경 하지 않고 선박에 걸쳐 개발 될 수 있도록 유도 지방 조직 arterioles, 평등 하 고 반대 방향의 intraluminal 공간으로 연속 흐름을 사전 수축, 다음 60 mmHg의. 
		참고: 예를 들어 한 저수지 높이 10 cm에 의해 이동 하는 경우 다른 하나 필요를 압력 기울기를 변경 하 고 따라서 intraluminal 유량 변경 10 cm에 의해 이동 해야 합니다. 더 정확한 흐름 속도 측정 바란다면 양적 유량 시스템 실험 설정에 적용할 수 있습니다.</li>
		<li>흐름 중재 팽창 측정 흐름 유도의 개시 후 3-5 분. Intraluminal 흐름 (압력 기온 변화도)의 수준 수 범위의 0-100 cmH 2 오 증가 압력 기온 변화도의 각 증가 Δ10 cmH 2 O 100 cmH 2 오의 최대 5-6 분 마다 
		참고: 안정 층 류는 루멘에서 유도 하기 위하여 두 마이크로 유리 정 팁 크기 필요가 arterioles;의 내부 직경에 매우 가까울 그렇지 않으면, 루멘 내의 난 류를 생산 하 고 원치 않는 측정 오류를 유발.</li>
		<li>흐름-중재 팽창 평가, 다음 돌아가기 압력 저수지 같은 높이 (60 mmHg).</li>
		<li>그런 다음 즉시 상공에서 솔루션을 제거 하 여 되 고 챔버를 세척 하 고 신선한 KREBS 솔루션으로 대체. 이 챔버 내에 중단된 되는 방해 하지 않는 만큼 주의 이루어집니다.</li>
		<li>3-4 회 20-30 분, 또는 격리 된 선박 휴식 기준 지름에 반환 될 때까지이 과정을 반복.</li>
	</ol></li> <li>중재 하는 아 세 틸 콜린, 내 피-종속, 엷게 <ol><li>지방 되는 휴식 기준 직경에 반환은, 미리 수축 endothelin-1 (동부 표준시-1, 10 를 투여 하 여 배 ~ 55% &#8722; 10 M) 위의 섹션에서에서 설명한 대로 4.1.2 목욕에 직접.</li>
		<li>사전 수축에 따라 순차적으로 수용 체 중재 하는, 산화 질소 주 작동 근 (Ach, 10 -5 M에 10 -9) 직접 목욕 하는 아 세 틸 콜린의 증가 복용량 (2 µ L)를 관리. 각 복용량의 관리 후 arteriolar 직경 5 분에 있는 변화를 기록.</li>
		<li>배 최종 Ach 복용량의 관리를 다음 대 지에 도달 했습니다 일단 워시는 용기 3-4 회 KREBS 솔루션. 복구 하 고 초기 직경 휴식을 반환 선박에 대 한 20-30 분을 허용 합니다. 장기 의회에서 pH를 유지 하려면 변경 KREBS 솔루션 15 분 마다</li>
	</ol></li> <li>품 어 되 N w-니트로-l-아르기닌 메 틸 에스테 르 (L 이름, 10 -4 M), 30 분, 산화 질소 synthase의 억제제 및 다음 반복 4.2.1 및 4.2.2 특성의 상대적 기여도를 Ach 중재 혈관을 산화 질소.</li>
	<li>목욕에 직접 papaverine (10 10 -4 M를 -8)의 증가 복용량의 순차적 행정에 의해 endothelium 독립 혈관 (혈관 부드러운 근육 기능) 및 선박 생존 능력을 평가합니다. 혈관 직경, 반환 하거나 papaverine (즉 적절 한 혈관)에 대 한 응답 휴식 기준선 (디) 직경을 초과 하지 않습니다, 선박 비 가능한 고려 하 고 데이터 요소를 삭제.</li>
</ol> 5. 데이터 분석 및 계산 <ol><li>계산 혈관 반응성. 데이터 표현에 대 한 백분율 혈관 혈관 직경 기준 차이 대 한 계정 및 다음 수식을 사용 하 여 계산을 사용 하 여: % 혈관 (DT-Dp/디-Dp) × 100 = DT는 주어진된 시간 (최대에 기록 된 직경 지름), Dp입니다 vasoconstriction 에이전트 (즉 추가 후 기록. ET-1 유도 축의 직경), 고 디 바로 앞 vasoconstriction 에이전트 (휴식 초기 직경)의 추가 기록입니다. 9</li> <li>Ach, papaverine, 또는 외-1 최대 응답 (EC 50)의 50%를 elicits 의해 정의 될 수 있는 농도 주 작동 근에 혈관 확장 및 vasoconstriction 감도 (복용량 응답) 정의 자형 매개 변수 및 플롯, 앞에서 설명한 대로. 10 참고: 지방이 많은 microvessels의 혈관의 관찰자 간 재현성 연구는 0.99의 높은 상관 계수 (CC) (n = 10 배 실험) 우리의 실험실에.</li></ol>
 6. 통계 분석 <ol><li>익스프레스 연속 측정 ± SEM.를 의미 이 일반적으로 배포 하는 경향이. 반복 측정 양방향 ANOVA에 의해 지방 arterioles 혈관 반응성 분석.</li>
	<li>또는 처리 그룹 사이 복용량 응답을 누적 혈관에 대 한 음모의 곡선 (AUC) 아래 영역을 비교합니다. 모든 경우에 P 고려 &#60; 0.05 통계적.</li>
</ol>

<ol><li>Schubert, R., Mulvany, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myogenic+response%3A+established+facts+and+attractive+hypotheses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">The myogenic response: established facts and attractive hypotheses.</a> Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).</li>
<li>Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Myogenic+Response+and+Vasoactivity+In+Resistance+Mesenteric+Arteries+Using+Pressure+Myography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography.</a> J Vis Exp. (101), e50997(2015).</li>
<li>Gutterman, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Microcirculation%3A+Regulation+of+Flow+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond.</a> Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).</li>
<li>Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity-Induced+Changes+in+Adipose+Tissue+Microenvironment+and+Their+Impact+on+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).</li>
<li>Farb, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+adipose+tissue+inflammation+represents+an+intermediate+cardiometabolic+phenotype+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity.</a> J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).</li>
<li>Farb, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT5A-JNK+regulation+of+vascular+insulin+resistance+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Med%22%5BJournal%5D)">WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity.</a> Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).</li>
<li>Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+renin-angiotensin+system+contributes+to+blunted+vasodilation+induced+by+transient+high+pressure+in+human+adipose+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).</li>
<li>Farb, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclooxygenase+inhibition+improves+endothelial+vasomotor+dysfunction+of+visceral+adipose+arterioles+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).</li>
<li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age+on+the+vasodilatory+function+of+human+skeletal+muscle+feed+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).</li>
<li>Ives, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+feed+arteries+studied+in+vitro%3A+the+effect+of+temperature+on+alpha%281%29-adrenergic+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness.</a> Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).</li>
<li>Grizelj, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+flow-and+acetylcholine-induced+dilations+in+visceral+compared+to+subcutaneous+adipose+arterioles+in+human+morbid+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity.</a> Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).</li>
<li>Farb, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriolar+function+in+visceral+adipose+tissue+is+impaired+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).</li>
<li>Tanner, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-Related+Protein+1+Mediates+Low+Glucose-Induced+Endothelial+Dysfunction+in+Human+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).</li>
<li>Ives, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha1-Adrenergic+responsiveness+in+human+skeletal+muscle+feed+arteries%3A+the+impact+of+reducing+extracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH.</a> Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).</li>
<li>Dharmashankar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase-dependent+vasodilation+of+human+subcutaneous+arterioles+correlates+with+noninvasive+measurements+of+endothelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function.</a> Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).</li>
<li>Truran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+and+leptomeningeal+arteriole+endothelial+dysfunction+induced+by+beta-amyloid+peptide%3A+a+practical+human+model+to+study+Alzheimer%27s+disease+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy.</a> J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).</li>
<li>Karki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forkhead+box+O-1+modulation+improves+endothelial+insulin+resistance+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).</li>
<li>Shahid, M., Buys, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+murine+resistance+artery+function+using+pressure+myography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing murine resistance artery function using pressure myography.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 또는 보고서 이해 충돌 있다.

해 부 및 주위 조직에서 지방 arterioles의 절연 기술 프로토콜 세부 사항에 주의 함께 시간과 노동 집약적인 과정 수. 있습니다 서 절차 세심 한 기술과 부드러운 근육 또는 내 피 손상을 방지 하기 위해 특수 해 부 기구는 microvasculature의 레이어를 셀 필요 합니다. Arteriolar 벽에도 작은 실수로 구멍 intraluminal 가압 및 실패 한 실험에서 결과 방지할 수 있습니다. 또한, cannulation arterioles 봉합 활용의 그릇의 각 끝에 유리 모 세관 피펫은 끝 사이 arterioles 확보 중요 합니다.
인간의 고립 된 microvessels 60 mmHg에서 가압의 30-40 분 후 자발적인 조직적 톤을 개발할 수 있습니다. 그러나, 우리 인간의 많은 arterioles 일반적으로 50-350 µ m 내부 luminal 직경의 혈관 평활 근의 스파스 레이어와 상대적으로 작은 고 골격 근육 arterioles에 비해 중요 한 조직적...

Videomicroscopy 작은 arterioles 생활 인체 ex vivo에서제거의 조절과 기능 검사를 활용 하는 유용한 기술입니다. 우리 연구소는 microvasculature에 다양 한 많은 microenvironments의 효과 특성을 다른 지방 조직 구획에서 작은 microvessels에 밖으로 해 부에 집중 했다. 이 기술의 주요 장점은 인체에서 제거 하는 혈관 기능 유지와 생 시간을 몇 분 안에 쉽게 시험 될 수 있다. 생리 적인 조건 유사 하 고 과거 압력 마이크로 유리 뉼 많은 비보에 특성을 정리를 통해 intraluminal 공간에서 유지 관리를 꾸준히. 1 , 2 또한, 자동된 가장자리 감지 소프트웨어와 신뢰할 수 있는 videomicroscopy 설정 endothelium 종속-독립적인 vasodilator 및 vasoconstrictor 용량 절연의 질적 및 양적 평가 대 한 허용 물리적 및 약리 자극에 대 한 응답에서 실시간, 허용 빠른 생리 적 평가에서 선박. 3 다른 microvascular 기법 와이어 myography 적은 시간이 소요 되며 힘 변환기에 의해 다양 한 agonists 긴장 응답을 측정 하는 경향이 사용할 수 있습니다.
본 연구실은 비만는 맥 관 구조에 다른 지방 조직 도메인의 효과에 초점을 맞추고 혈관 부전 사이의 관계를 검사 하는 videomicroscopy를 적용 하 고 있다. 내부-복 부 내장 지방의 축적으로 중앙 adiposity adipocytokine 생산, 대사 장애, 및 cardiometabolic 위험에 가장 밀접 하 게 연결 되었습니다. 프로 atherogenic cytokines 및 adipokine dysregulation의 과잉 생산으로 지방 조직 장애는 이러한 프로세스에 연루 강력 하지만 특정 규제 분자 및 치료 목표는 크게 남아 postulated이 되었습니다. 알려지지 않은. 4 또한, 현지 지방 조직 수준, 모 세관 진공 및 장애인된 관류에 지방 조직 pseudohypoxia 및 대사 dysregulation 연결 되었습니다. 심혈 관 질환 지방 조직 장애의 결과 수 있습니다 가설 진화입니다. 지방에서 특히 중앙/내장 adiposity, 가능성이 함께 협회에서에서 발표 하는 프로 atherogenic 중재자 홍보 내 피 기능 장애 및 병원 성 혈관 변화 될 수 있는 많은 맥 관 구조에 로컬로 명단 및 사용 하 여 검출 된 여기에 방법을 설명합니다. 5
고립 된 지방 조직 arterioles의 기능 평가 이상과 인간의 비만에 혈관 장애에 기여 하는 분자 메커니즘의 이해를 얻기 위해 유용한 방법입니다. 지방 서비스 센터 관련 장애에 기여 하는 메커니즘을 조사, endothelium 종속을 검사 하는 방법을 개발 했습니다 및-microvasculature의 독립적인 vasodilatory 응답 각종 규제의 식을 평가 하 고 bariatric 수술의 때에 뚱뚱한 과목에서 얻은 내장과 피하 (SC) 지방 조직 표본 쌍된에 후보자.

<table><tbody><tr><td>화학명</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6625</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘(CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산 (EGTA)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 알드리치</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>N w -nito-L- 아르기닌 메틸 에스테르 염산염</td><td>시그마 알드리치</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘(MgSO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨(KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>파파베린</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3510</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨(NaHCO 3 )Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 일수화물(NaH2Po4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Finescience tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Zeiss Achromat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory tubing</td><td>Euro-Pharm</td><td>250100306F999</td><td></td></tr><tr><td>Needle/pippette puller</td><td>David kopf instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic monofilament nylon suture</td><td>외과 전문</td><td>A7756N</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Finescience 도구</td><td>150000-08</td><td></td></tr><tr><td>용기 챔버</td><td>DMT</td><td>VAS v.2.1</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 지방 조직 microvascular 함수 videomicroscopy를 사용 하 여 평가

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

비만 대사 및 심혈 관 질환의 발전에 밀접 하 게 연결 된다, 그러나 약간이 프로세스를 제어 하는 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 그것은 국부 적으로 그리고 체계적으로, 중앙/내장 adiposity와 협회에서 특히 지방 조직에서 발표 프로 atherogenic 중재자 병원 성 혈관 변화를 촉진 수 있습니다 그리고 개념 심혈 관 질병이 있을 수 있습니다 가상은 지방 조직 장애의 결과 진화 하 고 있습니다. 여기, 우리는 그대로 작은 인간의 arterioles 살아있는 인간을 대상의 지방 창 고에서 제거의 vasodilator 및 vasoconstrictor 응답의 분석을 포함 하는 videomicroscopy의 독특한 방법을 설명 합니다. Videomicroscopy는 응답을 vivo에서 조건 압력된 시스템을 사용 하 여 약리학 또는 생리 적 자극으로 격리 된 microvessels의 기능 속성을 검사 하는 데 사용 됩니다. 기술은 이상과 지방 조직 환경 내에서 로컬로 혈관 장애에 기여 하는 분자 메커니즘의 이해를 얻기 위해 유용한 방법입니다. 또한, 지방 조직 microvasculature에 이상 또한 조직의 질병으로 연결 되었습니다. 우리는 뚱뚱한 주제에 있는 창 고 전용 혈관 응답 검사에이 기술을 적용. 우리는 증가 흐름을 두 개의 서로 다른 많은 플랫폼에서 동일한 개인에서 bariatric 수술 동안 격리 지방 arterioles (50-350 µ m 내부 직경, 길이 2-3 m m)에서 아 세 틸 콜린 endothelium 종속 엷게 평가. 우리는 내장 지방에서 arterioles 피하 창 고에서 고립 된 선박에 비해 장애인된 endothelium 종속 엷게 전시 시연 했다. 연구 결과 내장 microenvironment는 조직의 질환 메커니즘을 증가 내장 adiposity를 연결 하는 임상 관측에 관련 될 수 있는 혈관 내 피 기능 장애와 관련 된 것이 좋습니다. Videomicroscopy 기술은 다른 지방 창 고에서 관 고기 검사 하 고 결과 비교 하 여 비만 대사 장애의 다른 정도 가진 개인에 걸쳐 사용할 수 있습니다. 메서드 또한 임상 내정간섭에 응답에 경도 혈관 반응 검사를 사용할 수 있습니다.

우리 연구소는 endothelium 종속 검사를 videomicroscopy를 사용 하 고 있다 고-지방 조직 arterioles의 vasocontractile 기능 뿐만 아니라 독립적인 혈관, 피하와 내장 지방 비만 인간의에서 격리. 특성 실험 설정 그림 1A에 표시 됩니다. 지방 조직 arterioles 두 유리 모 세관 펫 사이 일시 중단 하 고 챔버 내에 장기 그림 1B와 같이 봉합과 장소에 고정 됩니다. Arteriolar 응답 다음 사전 수축 외 1 ~ 55%의 초기 직경 (그림 2B), 다음, 다음 주 작동 근 유도 기준선 (그림 2A)에서 선박을 검사 하 여 평가 될 수 있다 위에서 설명한 섹션 5.1, 혈관 고 <strong class="xfi...

Videomicroscopy 시스템은 고립 된 지방 조직 arterioles 생리 및 약리 자극에 대 한 응답에서의 기능 속성을 검사 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 비만 인 간에 있는 다른 지방 조직 도메인에 microvascular 고기 검사를 사용할 수 있습니다.

인간 지방 조직 Microvascular 함수 Videomicroscopy를 사용 하 여 평가

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

이 비디오 현미경 기법의 전반적인 목적은 약물적 및 생리학적 자극에 반응하는 분리된 미세혈관의 기능적 특성을 조사하여, 인간의 혈관 기능 장애에 기여하는 병태생리학 및 분자적 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 것입니다. 이 방법은 전신 질환과 연관이 있는 지방 내 국소 미세혈관의 기능 장애에 기여하는 분자적 메커니즘을 이해하는 데 유용합니다. 이 기법의 주요 장점은 혈관을 인체에서 제거한 후 일정 기간 동안 기능이 유지되어 생리학적 특성을 쉽게 조사할 수 있다는 점입니다.본 실험적 접근 방식의 임상적 관련성은 질환 상태에서 차별적으로 변화하는 경로를 식별하고, 잠재적으로 새로운 치료 표적을 발견할 수 있게 한다는 점에 있습니다. 조직 해부 현미경 하에서 미세 가위와 미세 핀셋을 사용하여 지방 샘플 내의 소동맥 주변의 지방과 결합 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 동맥과 정맥을 구별하는 것이 매우 중요합니다.동맥은 일반적으로 직경이 더 작고, 긴장도가 더 높으며, 세정맥보다 더 강력하게 반응합니다. 동맥을 분리한 후에는 나일론이나 실크 봉합사를 사용하여 모든 분지점을 묶어줍니다. 다음으로, 10 milliliter 주입기를 사용하여 튜브에 신선한 Krebs 용액을 천천히 채웁니다.그런 다음, 압력 저장조와 챔버 내의 유리 모세관 피펫에 고무 튜브를 연결하십시오. 이어서, 적출한 동맥을 기관 챔버로 옮기고 혈관을 유리 모세관 피펫에 삽입하여 캐뉼라를 장착하십시오. 나일론 봉합사를 사용하여 피펫에 고정된 동맥의 양끝을 조심스럽게 결찰하십시오.용기가 고정되면 챔버에서 Krebs 완충액을 천천히 제거하고, 신선한 Krebs 용액 2 mL를 챔버에 추가합니다. 다음으로, 비디오 카메라가 장착된 도립 현미경의 스테이지에 장기 챔버를 부착합니다. 샘플링 속도를 1 kHz로 설정하여 에지 검출 소프트웨어를 켭니다.남은 가압 튜브를 Krebs 용액이 채워진 두 번째 압력 저장조에 연결한 다음, 압력 저장조를 압력 변환기에 연결합니다. 모든 튜브 연결이 완료되면 가열 블록을 37 °C로 설정합니다. 다음으로, 압력 제어 장치를 사용하여 내강 압력을 5분마다 5 mmHg씩 점진적으로 높여 분리된 혈관 내강 내에 적절한 실험 압력이 형성되도록 합니다.압력이 60 mmHg에 도달하면 혈관을 20~30분 동안 평형 상태로 유지하고, 휴식 상태의 지방 동맥 직경을 기록하십시오. 평형 기간이 종료되면, 혈관 직경이 적절하게 수축될 때까지 5분마다 1 µL의 endothelin 1을 배스(bath)에 직접 첨가하여 혈관을 휴식기 기저 직경의 약 55%까지 사전 수축시키십시오. 혈류 유도 내피 의존성 혈관 확장을 위해, 평균 내강 내 압력 60 mmHg를 유지하면서 혈관 양단에 압력 차이가 발생할 수 있도록 동맥의 내강 공간에 동일하고 반대 방향으로 연속적인 흐름을 유도하십시오.3~5분 후에 혈류 매개 확장능을 측정합니다. 5~6분마다 압력 구배를 10 cm H₂O씩 증가시켜 최대 100 cm H₂O까지 높입니다. 혈관의 혈류 매개 확장을 평가한 후, 압력 저장조를 원래 높이로 되돌려 혈류 유도를 중단합니다.그다음 즉시, 하지만 주의 깊게 챔버 용액을 신선한 Krebs 용액으로 교체하되, 현수된 동맥이 흐트러지지 않도록 하며 혈관이 20~30분 동안 기저 직경으로 돌아오도록 둡니다. 동맥이 휴지기 기저 직경으로 돌아오면, 콜린 매개 내피 의존성 혈관 확장을 평가할 수 있습니다. 이는 이전에 입증된 바와 같이, endothelin 1을 사용하여 혈관을 휴지기 직경의 약 55%까지 사전 수축시키는 것으로 시작합니다.사전 수축이 이루어지면, 농도를 높여가며 2 µL의 acetylcholine을 배양액에 직접 첨가합니다. 각 용량 투여 5분 후 동맥 직경의 변화를 기록합니다. acetylcholine 용량 반응 실험이 완료되면, papaverine과 혈관 내피 독립적 혈관 확장제를 배양액에 순차적으로 투여하여 혈관 내피 독립적 혈관 확장 및 혈관 생존력을 평가합니다.인간 비만 모델에서 내장 지방 동맥은 피하 지방 동맥에 비해 혈류량 및 전단 응력의 증가 또는 아세틸콜린에 대한 내피 의존성 혈관 확장 반응이 유의하게 저하되어 있습니다. 그러나 파파베린에 반응하는 내피 독립성 혈관 확장은 두 지방 조직 간에 차이가 없으며, 이는 내장 부위의 혈관 기능 장애가 최소한 질병의 초기 단계에서는 주로 내피 수준의 기능 장애로 인한 것임을 시사합니다. 숙달되면, 이 기술은 적절히 수행될 경우 3~5시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 혈관에 가해지는 아주 작은 손상이라도 결과에 영향을 줄 수 있으므로, 시간을 충분히 갖고 세심하게 작업하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 혈관에 siRNA transfection과 같은 다른 방법을 수행하여, 인간 질환에서 특정 유전자가 혈관 운동 기능에 미치는 영향에 대한 추가적인 질문을 해결할 수 있습니다. 이 기술은 개발 이후 지방 조직 생물학 및 미세 순환 분야의 연구자들이 인간 비만 시 지방 조직 미세 환경이 국소 혈관 건강에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청하신 후, 여러분은 비침습적 영상 진단으로는 재현할 수 없는 과정인, 살아있는 피험자로부터 적출한 인간 혈관의 온전한 분절 전체의 병태생리학을 직접 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Capillaroscopy 직접 microcirculation을 시각화를위한 비 침습적 상대적으로 저렴한 방법입니다. 팔 혈액의 흐름 기술은 내피 기능의 인정 비 침습적 조치를 제공합니다.

Microvascular 및 내피 기능의 비 침습적 평가

Intravital 현미경 검사는 동물에서 망막 혈관 직경, 혈류 속도 및 총 망막 혈류를 시각화하고 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

생쥐의 망막 혈류에 대한 Intravital Video Microscopy 측정

본 논문은 죽상동맥경화증의 여러 단계를 평가하기 위해 의학 연구에서 일반적으로 사용되는 혈관 기능 및 형태에 대한 몇 가지 비침습적 평가에 대한 방법론적 고려 사항을 설명합니다.

혈관 기능 및 형태의 비 침습적 평가에 대한 방법 론적 접근

인슐린 유도 혈관 근육 관류를 조절 하 고 증가 microvascular 표면적 (microvascular 모집) 용 질 exchange에 사용할 수 있는 혈액과 조직 interstitium 사이. 결합된 intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 동시에 큰 배와는 미세 혈관에서 인슐린의 활동을 평가 하 여 vivo에서.

Intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 마우스 Hindlimb의 인슐린 유도 된 혈관과 근육 관류 결합

높은 지질 콘텐츠로 인해 지방 조직 전통적인 조직학 방법을 사용 하 여 시각화를 도전 하고있다. Adipo 분명 강력한 라벨 및 지방이 많은 직물의 고해상도 체적 형광 이미징 기술을 삭제 하는 조직 이다. 여기, 샘플 준비, 전처리, 얼룩, 지우기, 및 이미징에 대 한 설치 방법을 설명 합니다.

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

현재 연구의 초점은 지방 조직 아키텍처와 세포 구성의 3D 영상에 대 한 이상적인 방법으로 전체-마운트 immunostaining 및 시각화 기법을 설명 하.

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

새로운 혈관 형성 및 동 정적인 신경 분포 개장 하는 지방 조직에서 중추적인 역할을 재생합니다. 그러나, 시각화 및 양적 측정 지방 조직에 기술적인 문제가 남아 있다. 여기 우리는 성공적으로 레이블 및 양적 혈관과 다른 adipose 조직에 신경 섬유의 밀도 비교 하는 프로토콜을 제시.

혈관과 신경 섬유 지방 조직에서 공동 얼룩

이 프로토콜은 마우스에서 분리 된 장 간 막 동맥의 경 벽 등각 장력을 평가 하는 와이어 묘 조 그래피의 사용을 설명 하며, 내 피 세포 및 혈관 주위 지방 조직에서 방출 되는 요인에의 한 변조를 특별히 고려 합니다.

혈관 주위 지방 조직에 의해 변조에 초점을 맞춘 분리 된 장 간 동맥을 사용 하 여 혈관 톤 응답성의 평가

여기에서 우리는 기능적 혈관화된 베이지색 지방 조직을 엔지니어링하기 위한 간단한 접근 방식으로 설치류 또는 인간 지방 조직에서 분리된 미세혈관 조각의 사용을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Microvascular Fragments에서 Vascularized Thermogenic Adipose Tissue의 3차원 배양

여기에서는 인간 피하 지방 조직(hSATMVECs)에서 미세혈관 내피 세포를 분리, 배양 및 표현형으로 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 hSATMVEC-지방 세포 누화의 실험 모델을 설명합니다.

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

학습하세요 비디오현미경을 이용한 인간 지방 조직 미세혈관 기능 평가 방법을. 고립된 소동맥의 생리적 특성을 분석하여 비만 관련 혈관 기능 장애의 분자 메커니즘을 규명하고 새로운 치료 표적을 발견할 수 있습니다.

인간 지방 조직 Microvascular 함수 Videomicroscopy를 사용 하 여 평가

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