인간 지방 조직 Microvascular 함수 Videomicroscopy를 사용 하 여 평가

이 비디오 현미경 기술의 전반적인 목표는 약리학적 및 생리학적 자극에 반응하여 분리된 미세혈관의 기능적 특성을 조사하여 인간의 혈관 기능 장애에 기여하는 병태 생리학 및 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 것입니다. 이 방법은 전신 질환과 관련된 지방 내 국소 미세혈관 구조의 기능 장애에 기여하는 분자 메커니즘을 이해하는 데 유용합니다. 이 기술의 주요 장점은 혈관이 일정 기간 동안 인체에서 제거된 후에도 기능을 유지하고 생리학적 특성을 쉽게 검사할 수 있다는 것입니다.

이 실험적 접근법의 임상적 관련성은 질병 상태에서 차등적으로 변경되는 경로를 식별하고 잠재적으로 새로운 치료 표적을 발견할 수 있다는 것입니다. 조직 해부 현미경 아래에서 마이크로가위와 마이크로핀치를 사용하여 지방 샘플 내의 작은 동맥에서 주변 지방과 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다. 동맥과 정맥을 구별하는 것이 중요합니다.

동맥은 일반적으로 직경이 더 작고, 더 큰 음색을 나타내며, 정맥보다 더 강력하게 반응합니다. 동맥이 분리되면 나일론이나 실크 봉합사를 사용하여 가지를 묶습니다. 그런 다음 10ml 주사기를 사용하여 튜브에 새 Krebs 용액을 천천히 채웁니다.

그런 다음 챔버 내의 압력 저장소와 유리 모세관 피펫에 고무 튜브를 부착합니다. 다음으로, 절개된 동맥을 장기실로 옮기고 혈관을 유리 모세관 피펫에 캐뉼레이션합니다. 나일론 봉합사로 피펫의 동맥 양쪽 끝을 조심스럽게 고정하십시오.

용기가 고정되면 챔버에서 크렙스 버퍼를 천천히 제거하고 챔버에 2ml의 새 크렙스 용액을 추가합니다. 다음으로, 비디오 카메라가 장착된 도립 현미경의 스테이지에 장기실을 부착합니다. 1kW의 샘플링 속도로 에지 감지 소프트웨어를 켭니다.

나머지 가압 튜브를 두 번째 Krebs 용액으로 채워진 압력 저장소에 연결한 다음 압력 저장소를 압력 변환기에 연결합니다. 모든 튜브가 연결되면 가열 블록을 섭씨 37도로 설정합니다. 다음으로, 압력 제어 장치를 사용하여 5분마다 5분마다 수은 5ml까지 루미날 내 압력을 점진적으로 증가시켜 분리된 혈관의 내강 내에서 적절한 실험 압력을 달성합니다.

압력이 60ml의 수은에 도달하면 20-30분 동안 혈관이 평형을 이루도록 하고 정지 중인 지방 동맥의 직경을 기록합니다. 평형 기간이 끝나면 혈관 직경이 적절하게 수축될 때까지 5분마다 1마이크로리터의 엔도텔린 1을 수조에 직접 첨가하여 혈관을 휴지 기준선 직경의 약 55%까지 사전 수축시킵니다. 흐름 유도 내피 의존성 혈관 확장의 경우, 60mm 수은의 평균 내강 내압을 변경하지 않고 혈관 전체에 압력 차이가 발생할 수 있도록 동일하고 반대 방향으로 동맥의 내강 내 공간으로 지속적인 흐름을 유도합니다.

3-5분 후 흐름 매개 팽창을 측정합니다. 압력 구배의 각 증가를 5-6분마다 10cm씩 증가시키면 최대 100cm의 물까지 변경할 수 있습니다. 유동 매개 혈관 팽창을 평가한 후 압력 저장소를 동일한 높이로 되돌려 유동 유도를 중지합니다.

그런 다음 즉시, 부유 동맥을 방해하지 않고 챔버 용액을 새 Krebs 용액으로 조심스럽게 교체하고 혈관이 20-30분 동안 기준선 직경으로 돌아가기 시작하도록 합니다. 동맥이 휴지 기준선 직경으로 돌아오면 미묘한 콜린 매개 내피 의존성 혈관 확장을 평가할 수 있습니다. 이는 앞서 시연된 바와 같이 엔도텔린 1을 사용하여 혈관을 정지 직경의 약 55%까지 사전 수축시키는 것으로 시작됩니다.

사전 수축이 이루어지면 2 마이크로 리터의 증가하는 용량의 아세틸 콜린을 욕조에 직접 첨가하십시오. 각 용량의 투여 후 5분 후에 동맥경의 변화를 기록합니다. 아세틸콜린 투여 반응이 완료되면 파파베린과 내피 독립 혈관 확장제를 욕조에 직접 순차적으로 투여하여 내피 독립 혈관 확장 및 혈관 생존력을 평가합니다.

증가된 흐름과 순전한 스트레스 또는 아세틸콜린에 대한 내피 의존성 혈관 확장 반응은 인간 비만에서 내장 대 피하 지방 동맥에서 현저히 무뎌집니다. 그러나 파파베린에 대한 반응으로 나타나는 내피 독립적 혈관 확장은 두 가지 부위 간에 차별적으로 변화하지 않았으며, 이는 내장 영역에서의 혈관 기능 장애는 주로 내피 수준, 적어도 질병의 초기 단계에서 기능 장애의 결과임을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3-5시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 혈관에 경미한 손상이라도 결과가 왜곡될 수 있으므로 시간을 갖고 부지런히 노력하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 혈관의 siRNA 형질주입과 같은 다른 방법을 수행하여 인간 질병에서 혈관 운동 기능에 대한 특정 유전자의 영향에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 지방 조직 생물학 및 미세 순환 분야의 연구자들이 지방 조직 미세 환경이 인간 비만에서 국소 혈관 건강에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 피험자에서 제거된 인체 혈관의 온전한 부분 전체의 병태생리학을 직접 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이는 비침습적 이미징으로 복제할 수 없는 과정입니다.