인간 지방 조직 Microvascular 함수 Videomicroscopy를 사용 하 여 평가

이 비디오 현미경 기법의 전반적인 목적은 약물적 및 생리학적 자극에 반응하는 분리된 미세혈관의 기능적 특성을 조사하여, 인간의 혈관 기능 장애에 기여하는 병태생리학 및 분자적 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 것입니다. 이 방법은 전신 질환과 연관이 있는 지방 내 국소 미세혈관의 기능 장애에 기여하는 분자적 메커니즘을 이해하는 데 유용합니다. 이 기법의 주요 장점은 혈관을 인체에서 제거한 후 일정 기간 동안 기능이 유지되어 생리학적 특성을 쉽게 조사할 수 있다는 점입니다.

본 실험적 접근 방식의 임상적 관련성은 질환 상태에서 차별적으로 변화하는 경로를 식별하고, 잠재적으로 새로운 치료 표적을 발견할 수 있게 한다는 점에 있습니다. 조직 해부 현미경 하에서 미세 가위와 미세 핀셋을 사용하여 지방 샘플 내의 소동맥 주변의 지방과 결합 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 동맥과 정맥을 구별하는 것이 매우 중요합니다.

동맥은 일반적으로 직경이 더 작고, 긴장도가 더 높으며, 세정맥보다 더 강력하게 반응합니다. 동맥을 분리한 후에는 나일론이나 실크 봉합사를 사용하여 모든 분지점을 묶어줍니다. 다음으로, 10 milliliter 주입기를 사용하여 튜브에 신선한 Krebs 용액을 천천히 채웁니다.

그런 다음, 압력 저장조와 챔버 내의 유리 모세관 피펫에 고무 튜브를 연결하십시오. 이어서, 적출한 동맥을 기관 챔버로 옮기고 혈관을 유리 모세관 피펫에 삽입하여 캐뉼라를 장착하십시오. 나일론 봉합사를 사용하여 피펫에 고정된 동맥의 양끝을 조심스럽게 결찰하십시오.

용기가 고정되면 챔버에서 Krebs 완충액을 천천히 제거하고, 신선한 Krebs 용액 2 mL를 챔버에 추가합니다. 다음으로, 비디오 카메라가 장착된 도립 현미경의 스테이지에 장기 챔버를 부착합니다. 샘플링 속도를 1 kHz로 설정하여 에지 검출 소프트웨어를 켭니다.

남은 가압 튜브를 Krebs 용액이 채워진 두 번째 압력 저장조에 연결한 다음, 압력 저장조를 압력 변환기에 연결합니다. 모든 튜브 연결이 완료되면 가열 블록을 37 °C로 설정합니다. 다음으로, 압력 제어 장치를 사용하여 내강 압력을 5분마다 5 mmHg씩 점진적으로 높여 분리된 혈관 내강 내에 적절한 실험 압력이 형성되도록 합니다.

압력이 60 mmHg에 도달하면 혈관을 20~30분 동안 평형 상태로 유지하고, 휴식 상태의 지방 동맥 직경을 기록하십시오. 평형 기간이 종료되면, 혈관 직경이 적절하게 수축될 때까지 5분마다 1 µL의 endothelin 1을 배스(bath)에 직접 첨가하여 혈관을 휴식기 기저 직경의 약 55%까지 사전 수축시키십시오. 혈류 유도 내피 의존성 혈관 확장을 위해, 평균 내강 내 압력 60 mmHg를 유지하면서 혈관 양단에 압력 차이가 발생할 수 있도록 동맥의 내강 공간에 동일하고 반대 방향으로 연속적인 흐름을 유도하십시오.

3~5분 후에 혈류 매개 확장능을 측정합니다. 5~6분마다 압력 구배를 10 cm H₂O씩 증가시켜 최대 100 cm H₂O까지 높입니다. 혈관의 혈류 매개 확장을 평가한 후, 압력 저장조를 원래 높이로 되돌려 혈류 유도를 중단합니다.

그다음 즉시, 하지만 주의 깊게 챔버 용액을 신선한 Krebs 용액으로 교체하되, 현수된 동맥이 흐트러지지 않도록 하며 혈관이 20~30분 동안 기저 직경으로 돌아오도록 둡니다. 동맥이 휴지기 기저 직경으로 돌아오면, 콜린 매개 내피 의존성 혈관 확장을 평가할 수 있습니다. 이는 이전에 입증된 바와 같이, endothelin 1을 사용하여 혈관을 휴지기 직경의 약 55%까지 사전 수축시키는 것으로 시작합니다.

사전 수축이 이루어지면, 농도를 높여가며 2 µL의 acetylcholine을 배양액에 직접 첨가합니다. 각 용량 투여 5분 후 동맥 직경의 변화를 기록합니다. acetylcholine 용량 반응 실험이 완료되면, papaverine과 혈관 내피 독립적 혈관 확장제를 배양액에 순차적으로 투여하여 혈관 내피 독립적 혈관 확장 및 혈관 생존력을 평가합니다.

인간 비만 모델에서 내장 지방 동맥은 피하 지방 동맥에 비해 혈류량 및 전단 응력의 증가 또는 아세틸콜린에 대한 내피 의존성 혈관 확장 반응이 유의하게 저하되어 있습니다. 그러나 파파베린에 반응하는 내피 독립성 혈관 확장은 두 지방 조직 간에 차이가 없으며, 이는 내장 부위의 혈관 기능 장애가 최소한 질병의 초기 단계에서는 주로 내피 수준의 기능 장애로 인한 것임을 시사합니다. 숙달되면, 이 기술은 적절히 수행될 경우 3~5시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때는 혈관에 가해지는 아주 작은 손상이라도 결과에 영향을 줄 수 있으므로, 시간을 충분히 갖고 세심하게 작업하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 혈관에 siRNA transfection과 같은 다른 방법을 수행하여, 인간 질환에서 특정 유전자가 혈관 운동 기능에 미치는 영향에 대한 추가적인 질문을 해결할 수 있습니다. 이 기술은 개발 이후 지방 조직 생물학 및 미세 순환 분야의 연구자들이 인간 비만 시 지방 조직 미세 환경이 국소 혈관 건강에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청하신 후, 여러분은 비침습적 영상 진단으로는 재현할 수 없는 과정인, 살아있는 피험자로부터 적출한 인간 혈관의 온전한 분절 전체의 병태생리학을 직접 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.