거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

이 nanotube 당기는 방법론의 전반적인 목표는 관심사의 특정한 단백질과 높게 구부려진 막 사이 상호 작용을 양적으로 공부하기 위한 것입니다. 이 방법은 세포내이입(endocytosis) 및 세포내 이동(intracellular trafficking)과 같은 세포막 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 단백질이 어떻게 구부러진 막에 결합하고 상호 변형되는지 직접 정량화할 수 있습니다.

처음에 이 방법은 지질막의 기본적인 기계적 특성을 측정하는 데 사용되었습니다. 최근에는 단백질 막 상호 작용, 특히 단백질 형성 막에서 중요한 메커니즘을 밝히는 데 적용되고 있습니다. 전기 형성 챔버의 백금 와이어에서 직접 거대한 단층 소포를 수집하는 것으로 시작하십시오.

실험실을 구성하려면, 금속 바닥에 1mm 간격으로 두 개의 직사각형 유리 커버 슬립을 배치하고, 긴 가장자리를 따라 유리 마이크로피펫 팁이 최소한 챔버의 중앙에 도달할 수 있을 만큼 충분히 큰 구멍을 남겨둡니다. 실험실과 유리 마이크로피펫에 고순도 베타 카제인 용액을 밀리리터당 5mg으로 채우고 거품이 생기지 않도록 주의합니다. 챔버가 부동태화되는 동안 대물렌즈 위 중앙에 있는 광학 현미경에 장착하고 팁이 대물렌즈 위에 올 때까지 긴 가장자리를 따라 구멍을 통해 흡인 마이크로피펫의 팁을 삽입합니다.

흡입 압력이 0에 가까워지도록 물 탱크 수위를 조정하고 적절한 실험 농도에서 실험 완충액에 용해된 관심 분자를 주입 마이크로피펫에 채웁니다. 주입 마이크로피펫을 마이크로매니퓰레이터 내부에 장착하고 실험실의 다른 쪽을 통해 마이크로피펫을 삽입합니다. 배양이 끝나면 챔버에서 베타-카제인 용액을 제거하고 실험용 완충액으로 챔버를 여러 번 헹굽니다.

그런 다음 몇 마이크로리터의 소포 용액을 챔버에 추가한 다음 몇 마이크로리터의 스트렙타비딘 코팅 비드를 최종 농도로 0.1 곱하기 10에서 부피당 음의 3% 비드 속도 이하로 추가합니다. 소포와 구슬이 챔버 바닥에 가라앉은 후 실험용 완충액이 약 15분 동안 증발하도록 한 다음 이 시점에서 소포가 광학 현미경에서 눈에 띄게 물결쳐야 합니다. 소포가 적절하게 느슨해지면 피펫 내의 멤브레인 길이가 피펫 반경과 같거나 클 때까지 개별 소포를 마이크로피펫으로 흡인합니다.

적절한 크기의 흡인 텅이 확인되면 챔버의 열린 가장자리를 미네랄 오일로 밀봉합니다. 흡인 압력의 영점 위치를 설정하려면 흡인 피펫의 끝을 비드 근처에 배치하고 비드가 피펫에 의해 빨려 들어가거나 날아가지 않도록 물 탱크의 높이를 조정합니다. 물의 높이를 조정하는 것은 마이크로피펫에 의해 흡인되는 소포의 막 장력을 제어하는 데 중요합니다.

소포를 흡인하고 마이크로피펫을 깨뜨리지 않고 마이크로피펫을 위로 움직여 초점을 흐리게 합니다. 광학 핀셋을 사용하여 챔버 바닥에서 약 20마이크로미터 떨어진 곳에 비드를 가둡니다. 소포를 비드에서 멀어지게 하고 광학 트랩과 정렬하여 다시 초점을 맞추고, 평형 위치를 측정하기 위해 1-2분 동안 비드의 움직임을 기록합니다.

멤브레인 장력을 줄이기 위해 소포를 잃지 않고 마이크로피펫 내부의 압력을 최대한 낮추고, 약 1초 동안 소포를 비드와 조심스럽게 접촉시켜 스트렙타비딘-비오틴 결합을 확립합니다. 그런 다음 피에조 액추에이터를 사용하여 소포를 부드럽게 뒤로 당겨 나노 튜브를 만듭니다. 흡인 압력을 증가시켜 흡인 텅(aspiration tongue)을 재현하고 흡인 피펫의 축 내에 튜브를 정렬합니다.

튜브와 소포에 완전히 초점을 맞추고 명시야 현미경 검사로 몇 분 동안 30Hz 수집 속도로 비드의 움직임과 영점 위치에 대한 물 탱크의 높이를 기록합니다. 모든 이미지를 얻었으면 다른 흡인 압력과 멤브레인 장력에서 비드의 움직임을 다시 기록합니다. 관심 단백질 또는 분자를 주입하려면 주입 마이크로피펫을 나노튜브 근처로 가져와서 광학 트랩의 비드가 교란되지 않도록 주의하고 1-2파스칼의 압력으로 단백질을 부드럽게 주입합니다.

단백질 결합이 평형을 이룬 후, 노출된 멤브레인에 대해 입증된 것처럼 추가된 단백질이 있는 상태에서 단계적 측정을 반복합니다. 100% DOPC 소포에서 추출한 나노튜브의 힘과 반경 측정은 힘이 광학 트랩의 비드 변위와 형광 강도의 반경에서 측정되기 때문에 독립적이며, 멤브레인 굽힘 강성을 계산하는 두 가지 방법을 제공합니다. 기저 소포 위의 막 튜브에서 BAR 또는 칼륨 채널 단백질이 상대적으로 풍부하다는 것은 단백질이 구부러진 막에 결합할 가능성이 더 높다는 것을 나타냅니다.

실제로, N-BAR 단백질 엔도필린 A2가 멤브레인에 결합하면 튜브 힘이 점차 0으로 감소하며, 이는 튜브를 안정적으로 유지하는 3차원 골격이 형성됨을 나타냅니다. 이 절차에 따라 다른 기술을 결합하여 추가 질문에 답할 수 있습니다(예: 멤브레인 튜브의 단백질 조직을 감지하기 위한 고해상도 현미경 검사 또는 단백질 이동성을 측정하기 위한 단일 입자 추적).