Name: 거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 배우세요 거대 단층 소포에서 막 나노튜브를 당기는 방법으로 곡률이 큰 막과 단백질의 상호작용을 정량 분석하는 기술입니다. 이 방법은 세포 내소작용 및 막 생물학 연구에 활용됩니다.

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저자 감사 Benoit Sorre, Damien Cuvelier, 피에르 Nassoy, 프랑수아 Quemeneur, 및 그들의 필수 기여에 대 한 길 Toombes 그룹에서 나노튜브 메서드를 설정 합니다. 샌드위치 그룹 속하는 CNRS 컨소시엄 CellTiss, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038), 그리고 파리 과학 외 Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F. C. Tsai EMBO 장기 친교 (ALTF 1527-2014)과 마리 퀴리 행동 (H2020-MSCA-IF-2014, 프로젝트 막 ezrin 말라)에 의해 투자 되었다. 석사 시 몬스 사회 휄 로우의 주니어 연구원 이다.

저자는 공개 없다.

하지만, 막의 기본적인 기계적 특성 측정을 의미 하지만 단백질 및 막 간의 결합에 빛을 발산 하는 데 도움이 막 단백질 시스템에 풍부한 정보를 제공 하는 GUVs에서 튜브를 당기기의 방법 곡률입니다. 소개에서 설명 했 듯이, 다른 기술을 서브 미크론 리19 세 표면18,곁에와 단백질을 배양 하거나 관찰 하 여 막 커브 단백질의 효과 측정 하기 위해 존재 합니다 단백질20,21의 주입 시 micropipette 발음 하는 GUVs에서 tubules의 자발적인 형성. 여기 설명 하는 방법을 endocytosis 기하학적 직결 하며 단백질 밀도, 막 긴장, 막 힘 등 동시에 제공 하는 시스템의 중요 한 실제 측정에서 유일 하다.
방법의 중요 한 제한 사소한를 구성 하 고 분석 ...

Endocytosis, 인신 매매, filopodia, 감염 등의 형성 등 많은 세포질 과정 세포 막1,2의 모양에 있는 극적인 변화를 함께 제공 됩니다. 셀에 다양 한 단백질 막에 바인딩 및 그들의 모양을 변경 하 여 이러한 프로세스에 참여 하 고. 가장 주목할 만한 보기는 본질적으로 도메인3,,45,,67바 곡선 특성을 포함 하는 빈/Amphiphysin/Rvs (바) 단백질 가족의 일원. 일반적으로, 그들은 표면에 그리고, 많은 경우에, 또한 얕게 삽입은 bilayer amphipathic 나선 바 도메인 준수는 막으로 작용. 모양, 크기, 및 amphipathic 나선 수와 함께 바 도메인의 결정: (1) 막 곡률의 방향 (즉, 여부 그들은 invaginations 또는 돌출을 유발 한다), 및 (2) 막의 크기 곡률의5,8. 노트, 여기 긍정적인 곡률 달리 곡선된 막, 즉, 상호 작용 입자, 그리고 부정적인 돌출의 볼록한 쪽으로 정의 됩니다. 또한, 단백질 바의 양적 연구는 막에 그들의 효과 물리적 매개 변수 집합에 따라 달라 집니다 공개: 표면 단백질, 막 긴장, 그리고 막 모양 (평면 대 관 대 구형의 밀도 모양)7. 단백질 바 이러한 매개 변수에 따라 수 있습니다: (1) 막 곡률의 센서 역할 (2) 구 부 막, 또는 (3) 유도 막 절단7.
막 셀에 재편 endocytosis, 같은 현상의 양적 측면을 공부에 관련 된 부품의 투명 한 수 비보에 매우 도전 이다. 최소한의 구성 요소를 셀에 곡선된 막을 흉내 낸의 생체 외에서 재구성 어떻게 막 커브 단백질의 작동 기계 이해를 얻기 위하여 수단을 제공 합니다. 이 문서는 막 나노튜브에서 생체 외에서 micromanipulation, confocal 현미경 검사 법, 광학 핀셋을 사용 하 여 다시 구성할 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 공부 하 고, 양적 방법, 단백질, 지질, 또는 작은 분자 곡선된 막 상호 작용 하는 방법을 사용할 수 있습니다. GUVs 지질 누구의 곡률 막 커브 상호 작용 분자의 크기에 비해 무시할 수은 세포 막의 모델로 사용 됩니다. 그들은 electroformation 방법9 는 소포 지질 영화를 수 화와 교류 전류 (AC)10에서 GUVs로 붓기 형성 된다를 사용 하 여 준비 된다. 가장 일반적인 기판 GUVs 재배 되는 인듐 주석 산화물 (ITO) 코팅 중 반 전도성 격판덮개 또는 백 금 철사 (Pt-전선)11. 이 작품에서는, GUVs는이 방법은 버퍼12소금의 면 전에 서 GUVs를 만드는 대안 보다 훨씬 더 잘 작동 하도록 표시 되었습니다로 Pt-전선에 재배 됩니다. Electroformation 프로토콜은 여기에 설명 된 그것을 재현 하는 충분 한 세부 사항에, 하지만 우리는 비슷한 다른 메서드와 GUVs를 만드는 세부 사항13,14에서 설명 되었습니다 이전 기사에 독자를 참조 하십시오. 우리 손에 Pt 전선에 electroformation는 성공적으로 나왔고 GUVs 또는 자연 지질 합성 지질의 혼합에서 ~ 100 m m NaCl을 포함 하는 버퍼에 추출 물. 또한, 성장 하는 동안 GUVs 내부 단백질을 캡슐화 가능 했다 또한. 예를 들어 electroformation 챔버는 그림 1A;에 나와 그것은 2 ~ 10 cm 긴 Pt-와이어 홀더 유리 coverslips와 양쪽에 밀봉 될 수 있다 소계 (PTFE)에서 만든 삽입 구성 ~ 1-2 c m 간격 (그림 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> 그림 1: 실험적인 체제. Pt-와이어에 연결 된 전기 커넥터 (A) 우두머리 electroformation 챔버. (B) 왼쪽: 현미경을 보여주는 실험 시스템, 목표 및 2 개의 micropipettes (왼쪽 및 오른쪽) 위 실험 챔버는 micromanipulators에 연결 된 고 튜브 고 단백질에 대 한 실험 챔버에 삽입 사출입니다. 오른쪽: 실험 챔버의 근접 보기는 포부와 삽입 분사 micropipettes의 끝을 보여주는 목표 위에 탑재. (C) 주사기의 백 엔드에 micropipette 삽입 얇은 디스펜서 장비. 하단의 파란색 점선 개요는 micropipette micropipette 내부 디스펜서의 근접 보기입니다. 이 시스템은 카 세 인 유리 표면 passivate 하 고 필요할 때 미네랄 오일 칠을 다시 하는 micropipette 채우기 위해 사용 됩니다. (D) A 시스템 µ L 양의 단백질 해결책을 발음 하는 데 사용 합니다. 바늘은 주사기와 주입 micropipette에 연결 된 튜브에 연결 되어 있습니다. Micropipette 팁 신중 하 게 단백질 해결책에 몰입 하 고 그렇게 발음 하는 micropipette 팁을 채우기 위해. micropipette 다음 다시 채워집니다 미네랄 오일 패널 C.에에서 표시 하는 시스템을 사용 하 여 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
막 나노튜브, 7에서 반경에 이르기까지 몇 백 nm nm는 우두머리에서 외부 힘으로 당길 수 있다. 이 방법은 처음 세포 막 및 소포, 휨 강성15,16등의 탄성 속성 측정 하도록 설계 되었습니다. 가장 최근 작품, 메서드 가져온된 나노튜브7,17근처 단백질 microinjecting 곡선된 멤브레인과 단백질의 상호 작용 연구를 확대 되었다. 다른 방법 막 커브 단백질 연구 개발 되었습니다. 한 방법에서는, 단백질 세 표면에 닿는 곳에 다르게 크기의 리와 알을 품는. Confocal 현미경 검사 법은 단백질 바인딩 곡률을 이용한 정렬18,19를 나타낼 수 있는 liposome 직경의 함수로 측정 하는 데 사용 됩니다. 다른 방법에서는, 단백질 tubules20,21을 자발적으로 유도 하는 능력을 측정 하기 위해 마이크로 발음 하는 우두머리 근처 주입 됩니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 막 커브 단백질 endocytosis에 관련 된 공부에 특히 적합 한은 대부분 단백질이 일반적으로 미리 형성한 막 나노튜브와 함께 화물 포함 된 막 invagination 연결을 발생 합니다 평면 플라즈마 멤브레인 기본 또한,이 방법에서는, 달리 곁된 작은 리와 분석 결과에 막 나노튜브는 지속적으로에 연결 막; 따라서, 그것은 한 상황으로 예상 vivo에서우두머리와 기계적 평형 에입니다. 따라서, 근본적인 막 물리학 적용 하 고 우리가 우리의 측정22,,2324에서 기계적 특성의 과다를 추정할 수 있다.
이 방법의 전체 구현에 대 한 필요한 장비는 confocal 현미경, 광학 핀셋, 그리고 하나 또는 두 개의 micropipettes 물 탱크 (그림 1B)에 연결을 포함 합니다. 모든 3 개를 결합해 서, 동시에 막 긴장, 막 곡률, 단백질의 표면 밀도 측정 하 고 힘25를 튜브에 가능 하다. Micropipette 포부 필수적 이며, 그것은 쉽게 액체 정역학 압력을 통해26포부 압력 제어 하는 물 탱크에 연결 홀더 유리 제 micropipette 삽입 하 여 구성 됩니다. micropipette 홀더는 제어는 micromanipulator 고, 이상적으로, 한 방향으로 정밀 운동 위한 압 전 액추에이터. 나노튜브를, microaspirated 우두머리는 짧게 미크론 크기의 구슬을 다음 멀리는 나노튜브를 만드는에 붙어 됩니다. 이 구현에는 구슬27게시 된 프로토콜 따라 생성 될 수 있다 광학 족집게에 의해 개최 됩니다. 그것이 비록 정확한 힘 측정 비용 다른 방법으로, 광학 족집게 및 풀 나노튜브의 분배 가능 합니다. 광학 트랩을 만들려고 너무 어려운 경우 또는 힘 측정은 중요 하지,와 같은 경우 단순히 곡선된 멤브레인에 대 한 단백질의 선호를 확인 하 고 싶어 하는 경우 튜브 발음 하는 두 번째 micropipette28의 끝에 비드를 사용 하 여 가져온 수 있습니다. 그것은 또한30,31흐름 또는 중력29 를 사용 하 여 튜브를 당겨 수 있습니다. 또한, confocal 현미경 검사 법 중요 하지 않습니다. 그러나, 그것은 단백질의 표면 밀도 측정 하기 위해 그렇게 선호. 그것은 또한 지질 막 힘 및 긴장은 별도로 따라서 튜브의 형광 강도에서 나노튜브 반경 측정 있습니다. 형광에서 추론 튜브 반경 이러한 수량 사이의 관계 막 준수 단백질25의 존재로 인해 잘 설립 방정식에서 일탈 하는 경우에 특히 중요 하다. 중요 한 것은, 하나로 튜브 곡률을 측정할 수 있을 것입니다 광학 트랩 confocal 현미경 검사 법의 분배 수 없습니다.
이 프로토콜에서 설명 된 대로 메서드 나노튜브는 바 가족25,,3233,34에서에서 주로 그들에 다양 한 주변 막 단백질의 곡률을 이용한 정렬 공부 하는 데 사용 되었습니다. . 그것은 또한 KvAP에 농축 conically 모양의 막 횡단 칼륨 채널 단백질35바 같은 방식으로 나노튜브 곡선을 표시 했다. GUVs 내부 단백질을 캡슐화 하는 메서드를 최적화 하 여 부정적인 곡률과 단백질의 상호 작용은 최근 조사 잘36로. 또한,이 메서드는 사용 단백질 건설 기계25,37 의 형성을 명료 하 고 중 선 긴장38단백질 dynamin39, 또는 바 막 절단의 메커니즘을 연구 하 단백질40,41. 뿐만 아니라 단백질, 작은 분자 또는 이온 곡률을 유도할 수 있다 또한. 이 메서드를 사용 하 여 칼슘 이온 소금 없는 조건42에서 긍정적인 곡률을 유도 하기 위해 표시 했다. 흥미롭게도, 그것은 또한 보였다 지질 demixing 포인트43,44근처는 작곡에만 있지만 정렬, 곡률을 받을 수 있습니다. 합계에서는, 연구원은 어떻게 중 정수 막 구성 요소 (예:, 지질 또는 막 횡단 단백질) 조사에 관심이 메서드를 사용할 수 있습니다 또는 주변 분자 바인딩 (중 내부 또는 외부 GUVs)와 상호 작용 기계 및 양적 관점에서 원통 곡선된 막 그것은 또한22,,2345막 자체의 기계적 성질 측정에 관심 있는 사람을 위한 것입니다.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>그림 3의 데이터에 사용된 지질의 예</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]</td><td>Avanti</td><td>880129</td><td>biotinylated lipid</td></tr><tr><td>BODIPY-TR-C5-ceramide</td><td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td><td>D7540</td><td>형광 지질</td></tr><tr><td>BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)</td><td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td><td></td><td>단백질 밀도 보정을 위한 형광 지질</td></tr><tr><td>Egg L-&alpha;-phosphatidylcholine (eggPC)</td><td>Avanti</td><td>840051</td><td>튜브 반경 상수</td></tr><tr><td>&beta;-소우유(>99%)의 카제인을</td> 교정하는 데 사용됩니다.<td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td>는 <td>마이크로피펫을 부동태화하는 데 사용됩니다. 실험 챔버</td></tr><tr><td>: 설탕</td>, <td>시그마 Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr>, <tr><td>D (+) 포도</td>당 <td>: 시그마 Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td>, <td>시그마 Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>: 시그마 Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>삼투압계</td><td>: 패자</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Pt-wires, 0.5 mm 직경, 99.99 % 순도</td><td>Goodfellow USA</td><td></td><td>GUV 전기 형성</td></tr><tr><td>함수 발생기</td><td></td>에 사용되는 <td>PT005139 GUV</td><td>전기</td></tr><tr><td>퍼티 실란트</td><td>Vitrex (CML France)</td>의 전류를 생성하는 데 사용되는 <td>CRIT 140013</td><td>전기 챔버를 밀봉하는 데 사용</td></tr> 목욕 <tr><td>초음파 발생기</td><td></td><td>n / a</td><td>전기 챔버를 청소하는 데 유용하지만 중요</td></tr><tr><td>하지는 않습니다.Nikon TE2000 도립 현미경, eC1 컨포칼 시스템(Nikon), 두 개의 레이저 라인(&lambda; = 488nm 및 543nm); 5 W 이테르븀 섬유 연속파 레이저에 의해 유도된 광학 핀셋 (&lambda; > 1070 nm; IPG GmBH Germany)광학</td><td></td><td></td> 핀셋, 마이크로 매니퓰레이터<td></td></tr><tr><td></td><td></td>, <td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>, 붕규산 모세관(각각 내부 및 외부 반경 0.78mm 및 1mm)</td>이 장착된 컨포칼 현미경 시스템의 예<td>Harvard Apparatus</td><td>30-0036</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러,</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로포지</td>, <td>Narishige</td><td>MF-800</td><td></td></tr><tr><td>압전 액추에이터</td><td>Physik Instrumente</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 스트렙타비딘 코팅 비드(직경 3.2 &마이크로; m)</td><td>스페로텍</td><td>SVP-30-5</td><td></td></tr></tbody></table>

거 대 한 unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

세포 막의 재편 endocytosis, 인신 매매, 등 filopodia형성 등 많은 세포 현상의 중요 한 부분입니다. 많은 다른 단백질 그들의 능력을 감지 하거나 유도 막 곡률 때문에 곡선된 멤브레인과 연결 합니다. 일반적으로 이러한 프로세스는 다양 한 단백질 셀에서 양이 많게 공부 하기에 너무 복잡 하 포함 한다. 우리는 endocytic 목 같은 곡선된 세포 구조를 흉내 낸는 곡선된 막에 생체 외에서다시 구성할 프로토콜을 설명 합니다. 거 대 한 unilamellar 소포 (우두머리)는 그의 내부 압력 및 표면 장력 micropipette 포부와 함께 제어 되는 세포 막의 모델로 사용 됩니다. 광학 핀셋을 사용 하 여 우두머리에는 포인트 당기는 힘을 적용 평면 막에 연결 된 높은 곡률의 나노튜브를 만듭니다. 이 방법은 전통적으로 굽 힘 강성 등 지질 막의 기본적인 기계적 특성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 그것은 단백질 막 곡률 및 그들은 모양과 막의 역학에 영향을 미칠 방법으로 상호 작용 하는 방법을 공부 하 확장 되었습니다. Micromanipulation, microinjection, 광학 핀셋, confocal 현미경 검사 법을 결합 한 시스템 동시에 막 곡률, 막 긴장, 그리고 단백질의 표면 밀도의 측정을 허용 한다. 이 측정에서 단백질 막 시스템의 많은 중요 한 기계 및 형태학 속성 유추 수 있습니다. 또한, 우리 하다 생리 소금 농도 형광 강렬 레이블이 단백질과 지질에서에서 막에 단백질의 표면 밀도 측정 하는 방법의 GUVs를 만드는 프로토콜.

튜브를 당기 실험 멤브레인에 대 한 중요 한 기계적인 정보를 줄 수 있습니다. 단백질 또는 다른 분자를 막 곡률, 막와 커플 하 고 튜브 반경 막 긴장 Canham Helfrich 해밀턴을 적용 하 여 관련 될 수 없을 경우에는 튜브를 방정식 우두머리50,51에서 가져온 
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq3v6.jpg">(식 1)
어디 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq4v3.jpg"...

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

이 nanotube 당기는 방법론의 전반적인 목표는 관심사의 특정한 단백질과 높게 구부려진 막 사이 상호 작용을 양적으로 공부하기 위한 것입니다. 이 방법은 세포내이입(endocytosis) 및 세포내 이동(intracellular trafficking)과 같은 세포막 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 단백질이 어떻게 구부러진 막에 결합하고 상호 변형되는지 직접 정량화할 수 있습니다.처음에 이 방법은 지질막의 기본적인 기계적 특성을 측정하는 데 사용되었습니다. 최근에는 단백질 막 상호 작용, 특히 단백질 형성 막에서 중요한 메커니즘을 밝히는 데 적용되고 있습니다. 전기 형성 챔버의 백금 와이어에서 직접 거대한 단층 소포를 수집하는 것으로 시작하십시오.실험실을 구성하려면, 금속 바닥에 1mm 간격으로 두 개의 직사각형 유리 커버 슬립을 배치하고, 긴 가장자리를 따라 유리 마이크로피펫 팁이 최소한 챔버의 중앙에 도달할 수 있을 만큼 충분히 큰 구멍을 남겨둡니다. 실험실과 유리 마이크로피펫에 고순도 베타 카제인 용액을 밀리리터당 5mg으로 채우고 거품이 생기지 않도록 주의합니다. 챔버가 부동태화되는 동안 대물렌즈 위 중앙에 있는 광학 현미경에 장착하고 팁이 대물렌즈 위에 올 때까지 긴 가장자리를 따라 구멍을 통해 흡인 마이크로피펫의 팁을 삽입합니다.흡입 압력이 0에 가까워지도록 물 탱크 수위를 조정하고 적절한 실험 농도에서 실험 완충액에 용해된 관심 분자를 주입 마이크로피펫에 채웁니다. 주입 마이크로피펫을 마이크로매니퓰레이터 내부에 장착하고 실험실의 다른 쪽을 통해 마이크로피펫을 삽입합니다. 배양이 끝나면 챔버에서 베타-카제인 용액을 제거하고 실험용 완충액으로 챔버를 여러 번 헹굽니다.그런 다음 몇 마이크로리터의 소포 용액을 챔버에 추가한 다음 몇 마이크로리터의 스트렙타비딘 코팅 비드를 최종 농도로 0.1 곱하기 10에서 부피당 음의 3% 비드 속도 이하로 추가합니다. 소포와 구슬이 챔버 바닥에 가라앉은 후 실험용 완충액이 약 15분 동안 증발하도록 한 다음 이 시점에서 소포가 광학 현미경에서 눈에 띄게 물결쳐야 합니다. 소포가 적절하게 느슨해지면 피펫 내의 멤브레인 길이가 피펫 반경과 같거나 클 때까지 개별 소포를 마이크로피펫으로 흡인합니다.적절한 크기의 흡인 텅이 확인되면 챔버의 열린 가장자리를 미네랄 오일로 밀봉합니다. 흡인 압력의 영점 위치를 설정하려면 흡인 피펫의 끝을 비드 근처에 배치하고 비드가 피펫에 의해 빨려 들어가거나 날아가지 않도록 물 탱크의 높이를 조정합니다. 물의 높이를 조정하는 것은 마이크로피펫에 의해 흡인되는 소포의 막 장력을 제어하는 데 중요합니다.소포를 흡인하고 마이크로피펫을 깨뜨리지 않고 마이크로피펫을 위로 움직여 초점을 흐리게 합니다. 광학 핀셋을 사용하여 챔버 바닥에서 약 20마이크로미터 떨어진 곳에 비드를 가둡니다. 소포를 비드에서 멀어지게 하고 광학 트랩과 정렬하여 다시 초점을 맞추고, 평형 위치를 측정하기 위해 1-2분 동안 비드의 움직임을 기록합니다.멤브레인 장력을 줄이기 위해 소포를 잃지 않고 마이크로피펫 내부의 압력을 최대한 낮추고, 약 1초 동안 소포를 비드와 조심스럽게 접촉시켜 스트렙타비딘-비오틴 결합을 확립합니다. 그런 다음 피에조 액추에이터를 사용하여 소포를 부드럽게 뒤로 당겨 나노 튜브를 만듭니다. 흡인 압력을 증가시켜 흡인 텅(aspiration tongue)을 재현하고 흡인 피펫의 축 내에 튜브를 정렬합니다.튜브와 소포에 완전히 초점을 맞추고 명시야 현미경 검사로 몇 분 동안 30Hz 수집 속도로 비드의 움직임과 영점 위치에 대한 물 탱크의 높이를 기록합니다. 모든 이미지를 얻었으면 다른 흡인 압력과 멤브레인 장력에서 비드의 움직임을 다시 기록합니다. 관심 단백질 또는 분자를 주입하려면 주입 마이크로피펫을 나노튜브 근처로 가져와서 광학 트랩의 비드가 교란되지 않도록 주의하고 1-2파스칼의 압력으로 단백질을 부드럽게 주입합니다.단백질 결합이 평형을 이룬 후, 노출된 멤브레인에 대해 입증된 것처럼 추가된 단백질이 있는 상태에서 단계적 측정을 반복합니다. 100% DOPC 소포에서 추출한 나노튜브의 힘과 반경 측정은 힘이 광학 트랩의 비드 변위와 형광 강도의 반경에서 측정되기 때문에 독립적이며, 멤브레인 굽힘 강성을 계산하는 두 가지 방법을 제공합니다. 기저 소포 위의 막 튜브에서 BAR 또는 칼륨 채널 단백질이 상대적으로 풍부하다는 것은 단백질이 구부러진 막에 결합할 가능성이 더 높다는 것을 나타냅니다.실제로, N-BAR 단백질 엔도필린 A2가 멤브레인에 결합하면 튜브 힘이 점차 0으로 감소하며, 이는 튜브를 안정적으로 유지하는 3차원 골격이 형성됨을 나타냅니다. 이 절차에 따라 다른 기술을 결합하여 추가 질문에 답할 수 있습니다(예: 멤브레인 튜브의 단백질 조직을 감지하기 위한 고해상도 현미경 검사 또는 단백질 이동성을 측정하기 위한 단일 입자 추적).

pulling-membrane-nanotubes-from-giant-unilamellar-vesicles

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

물방울 인터페이스 지질 이중층에 대한 미세 유체 분사는 막 비대칭, 횡단 단백질의 결합, 재료의 캡슐화 제어와 소포를 생성 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 구획화 된 생체 분자가 소망되는 생물학적 시스템의 다양한 연구에 적용 할 수있다.

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

단계 구분 된 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs)에 대 한 실험은 자주 생리 솔루션 조건 게을리. 이 작품 횡단 막 솔루션 비대칭 및 온도 기능으로 충전된 multicomponent GUVs에서 액체-액체 상 분리에 높은 염 분 버퍼의 효과 연구에 접근을 제공 합니다.

형광 현미경 검사 법으로 모니터링 하는 대칭 및 비대칭 솔루션 조건에서 충전된 Vesicles의 위상 동작

우리는 지역화 된 칼슘 이온 기울기를 사용 하 여 소포의 비접촉 식 micromanipulation 위한 기술 제시. 주변에 거 대 한 지질 기 칼슘 이온 솔루션의 microinjection는 막 관 돌출의 생산의 결과로 지질 막 개장 하기 위하여 이용 된다.

막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

솔리드-지원, 단백질-무료, 이중 인지질 bilayer 막 (DLBM) 복잡 하 고 동적 지질 나노튜브 네트워크로 변형 될 수 있다 고 바인딩과 그물의 2D 상향식 모델로 사용할 수 있습니다.

자발적인 형성 및 바인딩과 그물에 대 한 상향식 모델로 인공 지질 나노튜브 네트워크의 재배치

이 프로토콜의 목표는 마이크로파이펫 흡인에 의해 거대 소포의 막 기계적 특성을 안정적으로 측정하는 것입니다.

마이크로 파이펫 포부로 전기 형성 및 기계적 특성 측정에 의한 거대한 Unilamellar 하이브리드 소포의 Obtention

이 프로토콜은 거대한 유니라멜라 지질 소포와 함께 글라이딩 키네신 운동성을 사용하여 지질 나노튜브 네트워크를 제조하는 과정을 기술한다.

글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작

이 기사에서는 내부, 환형 및 외부 영역에서 맞춤형 전기 전도성을 가진 소포 내 소포 구조를 가진 화합물 cGUV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하는 방법을 제시합니다. 전기형성은 삼투압 충격을 통해 구강세포와 cGUV로 변형되는 간단한 GUV를 합성하여 핵이 있는 세포의 생물물리학을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다.

Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells(복합 거대 단층소포의 합성: 핵세포의 생체 모방 모델)

이 초보자 가이드는 액적 전달 방법을 통해 GIV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하기 위한 일반적인 프로토콜을 제시하고, 중요한 단계를 논의하고, 합성 생물학 및 마이크로로보틱스를 포함한 다양한 응용 분야에 필요한 가능한 조정에 도움이 되는 통찰력을 제공합니다.

액적 전달 방법을 사용하여 거대한 단층 소포를 안정적으로 준비

배우세요 거대 단층 소포에서 막 나노튜브를 당기는 방법으로 곡률이 큰 막과 단백질의 상호작용을 정량 분석하는 기술입니다. 이 방법은 세포 내소작용 및 막 생물학 연구에 활용됩니다.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

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