Name: Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 학습하세요 콘포칼 현미경을 이용한 pHluorin 기법으로 췌도 섬에서 인슐린 과립 외배출을 실시간으로 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 당뇨병 연구에서 인슐린 분비 조절 메커니즘을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

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저자는 현미경으로 도움말에 대 한 핵심 시설을 이미징 DRI에서 마 샤 Boulina 감사 합니다. 이 작품은 NIH 교부 금 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 및 R56 DK084321 (AC)에 의해 지원 되었다.

마이애미 대학의 동물 윤리 위원회는 모든 실험을 승인 했습니다.
 1. 바이러스 성 감염의 그대로 고립 된 인간 또는 마우스 췌 장 독도 <ol><li>섬 문화: 섬 문화 미디어 준비: Connaught 의료 연구 실험실 (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS 및 2 m L-글루타민.
	<ol><li>인간 췌 장 독도 통합 섬 배포 프로그램 (NIDDK, NIH)에서 얻을 수 있습니다. 도착 시 전송는 독도 (~ 500 섬 등가물) 35 m m 비-조직 문화 취급 37 ° C에서 2 mL CMRL 문화 미디어, 바이러스 성 감염 하기 전에 24 시간을 위한 5%/95% CO 2 /O 2 접시.</li>
		<li>마우스 췌 장 독도 이전 설립된 프로토콜 16 다음 격리 될 수 있습니다. 절연, 다음 문화 ~ 200 섬 등가물에 35 m m 비-조직 문화 취급 37 ° C에서 2 mL CMRL 문화 미디어, 바이러스 성 감염 하기 전에 24 시간을 위한 5%/95% CO 2 /O 2 접시. 
		참고: NPY pHluorin와 형광 중복을 피하기 위해 독도 GFP 또는 YFP 기자 들과 유전자 변형 마우스를 사용 하지 마십시오.</li>
	</ol></li> <li>바이러스 준비 참고: NPY pHluorin 퓨전 pcDNA3 벡터 10으로 복제 되었고 adenoviral 생산 adenoviral vector에 subcloned [아 데 노비 루스 serotype 5 (DE1/E3)] 재조합 아 데 노 바이러스에 의해 제조 회사입니다. 바이러스는 aliquoted 및-80 ° c.에 저장 바이러스 성 재고 10 titers에서 회사에 의해 제공 됩니다 12 10 13 바이러스 성 입자 (~ 3 × 10 10-3 x 10 11 PFU).
	<ol><li>에 대 한 생체 외에서 섬, 사용 10 6 PFU/mL, 감염 (MOI)의 대략적인 다양성의 약 2 (자세한 토론 참조) 결과</li></ol></li>
	<li>췌 장 독도의 바이러스 성 감염 
	주의: 작업 adenoviruses Biosafety 수준 2 (BSL2) 절차와 인증을 요구 한다. 지도와 BSL2 절차에 대 한 교육 기관 Biosafety 장교와 확인 하십시오.
	<ol><li>위에서 설명한 대로 인간/마우스 독도 준비.</li>
		<li>추가 5-10 µ L 재고 바이러스의 인간/마우스 독도 CMRL 문화 미디어의 (10 %FBS 2 mM L-글루타민) 2 mL에 포함 된 각 35 mm 페 트리 접시. 
		참고: 바이러스 titer에 따라 사용 하는 회사 데이터 시트에서 제공 하는 바이러스의 볼륨 조절.</li>
		<li>포함 하는 바이러스에서 독도 문화 24 h. 위해 37 °C/5% CO 2 미디어</li>
		<li>후 24 h 발음 바이러스 포함 된 미디어 및 (와 함께 10 %FBS 2 mM L-글루타민) 2 mL CMRL 문화 미디어 바꿉니다.</li>
		<li>4-6 일 37 °C/5% CO 2, 대체 미디어 매 3 일에는 독도 문화.</li>
		<li>후 4-6 일 경작의 기대 주위 감염 되는 작은 섬 세포의 30%. 독도 라이브 이미징 실험에 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 2. Confocal 이미징의 감염 독도 참고: confocal 영상에 필요한 장비와 재료에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.
<ol><li>시 약 준비 및 실험적인 체제 <ol><li>준비 extracellular 솔루션: pH 7.4, 살 균 필터링 추가 125 mM NaCl, 5.9 m m KCl, 2.56 m m CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25mm HEPES, 0.1 %BSA. 
		참고:이 버퍼는 일반적으로 포도 당 없이 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 포도 당 원하는 최종 농도 도달 하는 실험의 날에 추가 됩니다.
		<ol><li>준비 기저 포도 (3mm) 매체: extracellular 솔루션 50 mL에 2 M 포도 당 재고의 75 µ L을 추가.</li>
			<li>Hyperglycemic (16mm) 매체: extracellular 솔루션 50 mL에 2 M 포도 당 재고의 400 µ L를 추가</li></ol>
		</li> <li>3mm 포도 당을 포함 하는 extracellular 해결책에 어떤 추가 자극 (예를 들어, KCl 또는 아데노신 3 인산 염 (ATP)) 희석.</li>
		<li>실험을 시작 하기 전에 1 h coverslip를 폴 리-D-리 솔루션 (1 mg/mL)의 30 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 H 2 o.와 그것을 rinsing 하 여 폴 리-D-리와 coverslips을 pretreat 
		참고: 폴 리 코팅 coverslips 저장할 수 있습니다 실 온에서 6 개월까지.</li>
		<li>1 mL 피 펫을 사용 하 여 실험 하기 전에 적어도 1 시간 35 mm 페 트리 접시 3 mM 포도 당을 세포 외 솔루션을 포함 하는 독도 전송 합니다. 37 ° C, 5% CO 2에 독도 유지. 
		참고: 필요한 경우, 원형질 막이이 단계에서 표시 수 있습니다. 원형질 막에 레이블을, 3 mM 포도 당을 세포 외 솔루션 2 µ M 디-8-ANEPP 염료를 추가 합니다. 37 °C/5% CO 2에서 1 시간을 위한 염료 해결책에서 독도 품 어. 488에서 원형질 막 염료를 흥분 수 nm와 620에서 nm.</li>
		<li>분 실험을 시작 하기 전에 부착는 coverslip 이미징 챔버를 진공 실리콘 그리스와 씰링 합니다. 이미징 플랫폼 이미징 챔버를 수정 합니다. 20 분에 대 한 표면에는 독도 준수 coverslip의 폴 리 D Lysine 치료 영역에 20-30 독도 배치를 피 펫을 사용 하 여 
		참고: 그것은 중요 coverslip 섬 손상을 피하기 위하여 완전히 건조 하 게 하지 않습니다.</li>
		<li>는 독도 coverslip 준수는 하는 동안 철저 하 게 물으로 헹 궈 서 관류 시스템을 준비 합니다. 다른 채널에 추가 하는 각 솔루션: 3 mM 포도 당 (1 채널), 16 mM 포도 당 (2 채널), 16 mM 포도 당 100 µ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)와 10 µ M 산림 (채널 3), 3 mM 포도 당 (채널 4), 3 mM 포도 당 (에서 10 µ M ATP에에서 25 m m KCl 채널 5)입니다. 각 채널을 개별적으로 열고 몇 분 동안 솔루션 흐름을 보내는 여 시스템에서 모든 거품을 제거 하 고 흐름 일관 (0.5 mL/min) 이며 튜브 유출 되지 않습니다 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>관류 콘센트 튜브에 단일 인라인 솔루션 히터를 연결 하 고 37 outflowing 버퍼의 온도 조정 ° c.</li>
		<li>흡입 펌프를 준비합니다. 시스템에서 모든 거품을 제거 하 고 흐름은 일관 되 고 튜브 유출 되지 않습니다 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>는 독도 coverslip 표면에 고착 되 면 부드럽게 채워 이미징 챔버를 3 mM 포도 당을 포함 하는 세포 외 솔루션. 독도 coverslip의 표면에서 세척 하지 마십시오.</li>
		<li>현미경 단계에 독도와 이미징 플랫폼을 배치 하 고 관류 시스템 및 흡입 펌프에 연결.</li>
		<li>차례 흐름에 그리고 끊임없이 perfuse 3 세대 extracellular 솔루션 독도. 시스템은 이제 confocal 영상에 대 한 준비.</li>
	</ol></li> <li>Confocal 영상 <ol><li>낮은 확대와 함께 현미경 분야에는 독도 찾습니다. 일단는 독도에 초점, 더 높은 확대 목표 전환 (예를 들어, 63 X 물 침수 목표 (63 X / 0.9 없음)).</li>
		<li>소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 인수를 열고 공명 스캐너 모드 활성화.</li>
		<li>XYZT 영상 모드를 선택 하 고 인수 설정을 다음과 같이 구성: <ol><li>설정에 아르곤 레이저와 488 nm 레이저 라인과 레이저 파워 pHluorin 여기에 대 한 50%를 조정.</li>
			<li>505-555 nm에 방출 수집.</li>
			<li>는 512 x 512 픽셀의 해상도 선택합니다. 보도 &#34; 라이브 &#34; 이미징 시작 (일반적인 이득은 약 600 V) 이득 레벨을 조정할을.</li>
			<li>설정 시작 및 z 스택의 끝:는 섬 위에 집중 하 고 선택 &#34; 시작 &#34; 마지막 집중 될 수 있는 선택 평면 이동 &#34; 끝 &#34;. 5 µ m의 z 단계 크기를 사용 합니다. 소프트웨어 자동으로 confocal 비행기의 수를 계산 합니다.</li>
			<li>1.5-2 s에 가까운 각 z 스택의 인수에 대 한 시간 간격을 설정 하 고 옵션 선택 &#34; 멈출 때까지 취득 &#34; 연속 이미징.</li>
			<li>보도 &#34; 시작 &#34; ini 버튼tialize.</li>
		</ol></li> <li>다양 한 자극 프로토콜을 사용 하 여 원하는 자극으로 독도 perfusing 하 여과 립 exocytosis를 유도. 자극 프로토콜 원하는 과학적 목적 (아래 참조)에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>자극 프로토콜 참고: 3 mM 포도 당을 포함 하는 extracellular 솔루션과 지속적인 관류 동안 섬 배경 활동의 적어도 2 분을 기록 하 여 시작 하는 모든 자극 프로토콜에서. 원하는 기간에 대 한 자극 제와 perfuse. 각성제의 순서, 자극의 지속 시간 녹음 기간 원하는 과학적 목적에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다. 새로운 자극을 시작 하기 전에 3 mM 포도 당을 포함 하는 extracellular 솔루션과 독도 씻어 있는지 확인 하십시오. 아래 샘플 자극 프로토콜 메서드 기능을 보여 주기 위해 사용 되었습니다을 찾아.
	<ol>PHluorin pH 감도 및 바이러스 감염 효율 ( 그림 3)에 대 한 긍정적인 제어로 염화 암모늄 (NH 4 Cl)와 <li>Stimulate: 3 mM 포도 당 (2 분) &#8594; 50mm NH 4 Cl (2 분)에 3 mM 포도 당 &#8594; 포도 당 3 m m (2 분) 참고: NH에서 4 Cl 솔루션, 아데닌 기초에 NaCl을 대체.</li>
		<li>Stimulate ( 그림 5 및 그림 6) 포도 당 농도 증가 시켜 인슐린과 립 exocytosis: 3 mM 포도 당 (2 분) &#8594; 16 m m 포도 당 (15-30 분) &#8594; 3 m m 포도 당 (2 분 
		참고: 적어도 15 분에 대 한 16 G 솔루션으로 지속적으로 독도 perfuse 활동의 몇몇 파열을 보려면 
		참고: 분 비 응답 17의 일관성을 증가 하기 위하여 사용자가 3g와 16 G 솔루션 캠프 모금 에이전트 (100 µ M IBMX 및 10 µ M 산림)를 추가할 수 있습니다. 이 립 분 비의 시간적 패턴을 변경 하지 않습니다. 내용은 15와 토론을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+insulin+granule+biogenesis+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis.</a> Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).</li>
<li>Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cell+identity%2C+glucose+sensing+and+the+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion.</a> Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).</li>
<li>Rorsman, P., Renstrom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+granule+dynamics+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).</li>
<li>Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vti1a+identifies+a+vesicle+pool+that+preferentially+recycles+at+rest+and+maintains+spontaneous+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).</li>
<li>Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+insulin+vesicle+dynamics+during+pulsatile+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion.</a> Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).</li>
<li>Ohara-Imaizumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+exocytosis+and+endocytosis+of+insulin+secretory+granules+in+the+pancreatic+beta-cell+line+MIN6+using+pH-sensitive+green+fluorescent+protein+%28pHluorin%29+and+confocal+laser+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy.</a> Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).</li>
<li>Whim, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta+cells+synthesize+neuropeptide+Y+and+can+rapidly+release+peptide+co-transmitters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters.</a> PLoS One. 6 (4), e19478(2011).</li>
<li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+%26%2334%3Bkiss-and-run%26%2334%3B+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of &#34;kiss-and-run&#34; exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).</li>
<li>Zhu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+I+and+IX+function+redundantly+in+controlling+fusion+pore+of+large+dense+core+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).</li>
<li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+fusion+pore+opening+and+the+amount+of+hormone+released+are+regulated+by+myosin+II+during+kiss-and-run+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis.</a> Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).</li>
<li>Felmy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+cargo+release+from+dense+core+granules+by+size+and+actin+network%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network.</a> Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Gandasi, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+Red+Fluorescence+Proteins+as+Markers+for+Secretory+Granule+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis.</a> PLoS One. 10 (6), e0127801(2015).</li>
<li>Almaca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+coordination+of+insulin+granule+exocytosis+in+intact+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets.</a> Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lepr%28db%29+mouse+model+of+type+2+diabetes%3A+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> J Vis Exp. (99), e52632(2015).</li>
<li>Hanna, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kiss-and-run+exocytosis+and+fusion+pores+of+secretory+vesicles+in+human+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).</li>
<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+transfection+of+isolated+pancreatic+islets%3A+a+study+of+programmed+cell+death+%28apoptosis%29+and+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function.</a> J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).</li>
<li>Michael, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cargo+proteins+in+pancreatic+beta-cells%3A+design+determines+secretion+kinetics+at+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis.</a> Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).</li>
<li>Serre-Beinier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx36+makes+channels+coupling+human+pancreatic+beta-cells%2C+and+correlates+with+insulin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression.</a> Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).</li>
<li>Rutter, G. A., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+connectivity+in+pancreatic+islets%3A+a+type+2+diabetes+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?</a> Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).</li>
<li>Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHuji%2C+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+for+imaging+of+exo-+and+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis.</a> J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).</li>
<li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 원고는 confocal 현미경 검사 법에 의해 exocytosis 그대로 췌 장 독도 내 베타 세포에서 인슐린 알갱이의 시각화를 사용할 수 있는 기술을 설명 합니다. 그것은 높은 transfection 효율을 보장 하기에 아 데 노비 루스 복제 형광 기자로 NPY-pHluorin를 사용 합니다.
방법은 우리 손에 고효율, 그것은 주로 두 개의 매개 변수 의존 하는 몇 가지 수정 해야 할 수도 있습니다: 1) 섬 준비, 및 감염 조건 최적화와 바이러스 성 주식의 2) titer의 품질. 독도의 바이러스 감염, 이전 섬 준비를 37 ° c.에 하룻밤 격리 및 수송 스트레스 로부터 복구할 수 있도록 셀 섬 표면 또는 섬 센터18 에 hypoxic 세포 (어두운 세포)의 존재에서 튀어나와 등 감소 생존의 흔적에 대 한 확인 하 고 감염/식 기간 내내 가벼운 현미경 섬 형태 검사 . 각 바이러스 성 주식의 titer 및 감염 효율성에서 달라질...

인슐린은 췌 장의 작은 섬의 베타 세포에 의해 생산 하 고 포도 당 물질 대사1의 키 레 귤 레이 터 이다. 죽음 또는 베타 세포의 기능 장애 포도 당 항상성을 방해 하 고 당뇨병2리드. 인슐린은 캘리포니아2 +에서 출시 된 코어 조밀한과 립에 포장-종속 방식3. 인슐린과 립 exocytosis 규제 어떻게 elucidating 완벽 하 게 이해 어떤 인슐린 분 비를 결정 하 고 당뇨병의 치료에 대 한 새로운 치료 대상의 식별에 대 한 새로운 경로 열 며 필수적 이다.
인슐린 exocytosis는 광범위 하 게 연구 되었습니다 형광 분자와 함께에서 막 커패시턴스 측정 등 미세한 접근 electrophysiological 접근을 사용 하 여. 막 커패시턴스 측정 좋은 시간적 해상도 있고 단일 셀 레코딩을 허용. 그러나, 커패시턴스에 변경 셀의 net 표면 변화를 반영 고 할 하지 개별 퓨전 이벤트를 캡처 또는 다른 비 인슐린 분 비 소포3에서 인슐린과 립 퓨전을 구별. 형광 프로브 및 소포 화물 단백질와 함께 2 광자 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 등 미세한 방법을 추가 정보를 제공합니다. 이러한 기술은 단일 exocytotic 이벤트 및 사전 및 사후 exocytotic 단계를 캡처하고 셀3의 인구에 있는 exocytotic 패턴을 공부 하 고 사용할 수 있습니다.
형광 기자 세 가지 유형의 수: 1) extracellular, 2) 세포질, 또는 3) 나노미터. 1) extracellular 기자는 extracellular 환경4를 통해 소개 될 수 있는 폴라 추적기 (예를 들어, dextrans, sulforhodamine B (연료 부스터), 루시퍼 노란색, pyranine). 폴라 추적기를 사용 하 여 셀의 인구에는 퓨전의 조사 가능 하며 혈관 등 다양 한 세포 구조를 캡처합니다. 그러나, 그들은 소포 화물 동작에 보고 하지 않습니다. 2) 세포질 기자는 세포질 얼굴과 도킹 및 exocytosis에 참여 막 관련 단백질에 결합 하는 형광 프로브. 예는 신경 전달 물질 방출5공부에 대 한 신경 과학에서 성공적으로 사용 된 성 N-ethylmaleimide-민감한 요소 첨부 단백질 수용 체 (무) 가족 구성원을 포함 합니다. 이러한 여러 바인딩 파트너는 단백질과 인슐린과 립 하지 않습니다 특정. 3) 기공을 기자는 화물 전용 기 행동의 조사에 대 한 허용 하는 기공을 화물 단백질을 융합 하는 형광 프로브. 인슐린과 립 특정 화물 단백질 등이 인슐린, c-펩 티 드, 작은 섬 녹말 체 폴 리 펩 티 NPY 등6,7. NPY는 인슐린과 립, 포함에 이며 공동 출시, 인슐린과 형광 기자8에 대 한 우수한 파트너 만들기.
Exocytosis 신경 내 분 비 세포, 특정 synaptotagmin isoforms9,10 의 요구 등의 다양 한 측면을 연구 NPY 다른 형광 단백질의 융합 이전 고용 방법 방출의 시간-과정에 따라 다릅니다 말라 골격 myosin II11,12. 이 연구에서 우리는 비 형광은 수정 된 GFP가 형광 기자로 pHluorin를 선택 고밀도 코어 내부 산 성 pH에서과 립 하지만 된다 중립 extracellular pH13에 노출 되 면 밝은 형광. 성숙한 인슐린과 립 산 성 pH를 5.5 아래 있다. 일단은 립 원형질 막 및 열립니다 퓨즈, 그것의 화물 수 기자로 서 pH에 민감한 단백질 pHluorin 사용 하 여7,147.4의 extracellular 중립 pH에 노출 됩니다.
PH 민감한 성격의 pHluorin 그리고 인슐린과 립에 있는 NPY의 선택적 식에 비추어 NPY pHluorin 퓨전 구문 인슐린과 립 exocytosis의 다양 한 속성을 공부를 사용할 수 있습니다. 융해 구성의 바이러스 배달 높은 transfection 효율을 보장 하 고 고립 된 섬에 뿐만 아니라 기본 베타 셀 또는 셀 라인에 작동 합니다. 이 방법은 exocytosis NPY 포함 된 소포와 다른 세포 유형에서 공부에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 exocytosis에 어떤 유전자 변형 마우스 모델 연구 특정 조건 (knockdowns, overexpression, 등)의 효과를 결합할 수 있습니다. 이 기술은 이전 인간의 독도15베타 세포 인구에서 인슐린과 립 분 비의 공간 및 시간 패턴을 특성화 하기 위해 사용 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>정립 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>TCS-SP5</td><td>포함 LAS AF, 이미지 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>이미징 챔버</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>이미징 챔버 플랫폼</td><td>Warner instruments</td><td>PH-1</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 유리 커버 슬립</td><td>Daiggerbrand</td><td>G15972H</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum 실리콘 그리스</td><td>시그마</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>다중 채널 관류 시스템</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>VC-8</td><td></td></tr><tr><td>단일 인라인 용액 히터</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>연동 흡입 펌프</td><td>Pharmacia</td><td>P-1</td><td></td></tr><tr><td>35mm 페트리 접시, 비조직 배양 처리된</td><td>VWR</td><td>10861-586</td><td></td></tr><tr><td>CMRL 매체, 글루타민 없음</td><td>ThermoFisher 11530037</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS, 열 비활성화</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 200 mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl 용액</td><td>Sigma</td><td>S5150</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl 용액</td><td>Sigma</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td>1 M CaCl2 solution</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2 solution</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES 용액</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>진공 필터</td><td>VWR</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신 하이드로브로마이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANNEP</td><td>ThermoFisher</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX)</td><td>시그마</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>포스콜린</td><td>시그마</td><td>F3917</td><td></td></tr></tbody></table>

confocal neuropeptide y-phluorin의 이미징: 그대로 murine 인간과 독도에 인슐린과 립 exocytosis를 시각화 하는 기법

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

인슐린 분 비 뿐만 질병에서 정상적인 생리 적인 조건 하에서 포도 당 항상성에서 중심 역할을 한다. 전기 생리학 또는 현미경 형광 기자 들의 표현에 결합 하거나 사용 하는 인슐린과 립 exocytosis 공부를 현재 접근. 그러나 이러한 기술의 대부분 클론 세포 라인에 대 한 최적화 되었습니다 또는 췌 장 독도 해리 요구. 대조적으로, 여기에 제시 된 방법 그대로 췌 장 독도에 인슐린과 립 exocytosis의 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 인코딩하는 pH에 민감한 녹색 형광 단백질 (GFP), pHluorin, neuropeptide Y (NPY)에 결합 된 아 데 노 바이러스와 격리 된 췌 장 독도의 바이러스 성 감염을 설명 합니다. 둘째, 우리는 confocal 이미징 독도의 5 일 후에 바이러스 성 감염 및 인슐린과 립 분 비를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 간단히, 감염 된 독도 이미징 챔버에 coverslip에 배치 되며 지속적으로 다양 한 자극을 포함 하는 extracellular 솔루션과 끼얹는다 되 하는 동안 똑바로 레이저 검사 confocal 현미경 아래 몇 군데. 공초점 이미지는 섬의 50 µ m에 걸친 빠른 공명 스캐너를 사용 하 여 시간 경과 녹음으로 획득 됩니다. 시간이 지남에 따라 인슐린과 립 원형질 막으로 융합을 다음 수 있습니다. 이 절차 또한 단일 실험에서 자극의 배터리를 테스트 가능, 마우스와 인간의 독도 이며 기능적인 화상 진 찰 (예를 들어, 막 잠재력 또는 cytosolic 칼슘 염료)에 대 한 다양 한 염료와 결합 될 수 있다.

기술의 전체 워크플로 그림 1에 표시 됩니다. 간단히, 마우스 또는 인간의 독도 수 NPY pHluorin 인코딩 하는 아 데 노 바이러스에 감염 되며 문화, confocal 현미경 아래에서 몇 일 후 몇 군데. 과 립 원형질 막 및 오픈 퓨즈, 형광 증가 관찰 고 측정할 수 있습니다 (그림 1). NPY pHluorin 실제로 인슐린과 립 역학을 모니터링 하는 데 적합 한 도구 인지 확인, 감염 된 독도 GFP와 다른 섬 호르몬 인슐린, somatostatin 또는 글 루카 곤에 대하여 항 체와 immunostained 했다. 대부분의 세포 표현 NPY-pHluorin (GFP 긍정적인) 베타 세포 했다 그들은 또한 인슐린을 표현 (~ 90%; 그림 2A, 2B). 몇 글 루카 곤...

우리는 pHluorin, pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용 하 여 그대로 독도에 인슐린 exocytosis의 시각화를 위한 프로토콜을 설명 합니다. 격리 된 독도 소포 화물 neuropeptide Y에 결합 하는 pHluorin를 인코딩 하는 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 인슐린과 립 퓨전 이벤트의 검출에 대 한 수 있습니다.

Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

이 분석의 전체적인 목표는 공초점 현미경을 통해 손상되지 않은 췌도에서 인슐린 과립의 엑소사이토시스를 실시간으로 시각화하는 것입니다. 이 방법은 당뇨병 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 제시할 것입니다. 예를 들어, 무엇이 인슐린 엑소사이토시스를 조절하는가와 같은 질문입니다.과립 융합은 베타 세포의 생애에서 가장 중요한 단일 사건이기 때문에 이는 매우 결정적입니다. 이 기술의 주요 장점은 온전한 췌도(islet)를 사용할 수 있어, 세포가 원래의 환경에 있는 상태에서 융합 사건을 관찰할 수 있다는 점입니다. 저희 실험실의 박사 과정 학생인 Madina Mahkmutova가 이 기술을 시연할 예정입니다.췌도 도착 즉시 50 mL falcon 튜브로 옮긴 후, 췌도 현탁액을 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리합니다. 튜브 바닥에 췌도가 모이면, 이를 2 mL의 CMRL 배양이 포함된 35 mm 비조직배양 처리 페트리 접시에 옮기고, 바이러스 감염 전 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 분리 후, 약 mouse pancreatic islet equivalents를 2 mL의 CMRL 배양액에 재현탁하여 35 mm 비조직배양 페트리 접시에 옮깁니다.바이러스 감염 전, 조직을 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 바이러스 감염을 수행하려면, 2 mL의 CMRL 배양이 포함된 인간 또는 생쥐 췌도 세포가 담긴 각 35 mm 페트리 접시에 5~10 µL의 스톡 바이러스를 첨가합니다. 췌도 세포를 24시간 동안 배양한 후, 배지를 흡입하여 제거하고 바이러스가 없는 2 mL의 CMRL 배양액으로 교체합니다.배지를 3일마다 교체하며 소도를 4~6일 동안 배양합니다. 여기에 나열된 시약들을 혼합하여 세포외 용액을 준비한 후, 완충액을 여과 멸균합니다. 50 mL의 세포외 용액에 2 M 포도당 스톡 75 µL를 첨가하여 최종 포도당 농도가 3 mM인 기초 포도당 배지를 만듭니다.그런 다음 최종 포도당 농도가 16 millimolar인 고혈당 배지를 준비하려면, 50 milliliters의 세포 외 용액에 2 molar 포도당 스톡 400 microliters를 추가합니다. 추가적인 자극제와 3 millimolar 포도당을 포함하는 세포 외 용액을 희석합니다. 실험을 시작하기 전에 커버슬립을 1 mg/mL poly-d-lysine 용액 30 microliters로 전처리하고 1시간

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 췌장섬 세포의 작은 하위 집단에서 세포질 칼슘 농도의 변화를 연구하기 위해 섬 세포를 실시간으로 이미징하는 기술을 설명합니다. 소세포 하위집단은 아드레날린(adrenaline) 및 그렐린(ghrelin)과 같은 마커 화합물에 대한 기능적 반응을 사용하여 확인할 수 있으며, 이는 섬세포의 특정 집단에서 세포질 칼슘의 변화를 유도합니다. 이것은 혈당과 섬 분비 출력 사이의 교차 담화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

췌장 세포의 칼슘 역학 이미징: 췌장 섬의 세포질 칼슘 농도의 실시간 변화를 연구하는 기술

의 intravital 현미경은 살아있는 동물의 다양한 생물학적 과정을 영상화 할 수있는 강력한 도구입니다. 이 문서에서는, 우리는 살아있는 생쥐의 침샘에서 이러한 분비 과립으로 세포 내 구조의 역학 이미징을위한 자세한 방법을 제시한다.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

이 프로토콜 설명 관찰 실시간 녹색 형광 단백질 (GFP)의 태그 인슐린 자극 및 인슐린-GLUT4에 CCR5의 생물학 역할의 특성에 따라 매매 하는 포도 당 운송업 자 4 (GLUT4) 단백질에 대 한 Deconvolution 현미경으로 통로 신호.

마우스 기본 Hypothalamic 뉴런 Deconvolution 현미경을 사용 하 여 매매 GLUT4 단백질의 라이브 이미지

여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

이 프로토콜은 1차 인간 아일렛 샘플로부터의 베타 세포에서 특히 미토파지 단백질 복합체 형성의 정량적 분석을 위한 방법을 간략하게 설명한다. 이 기술은 이렇게 귀중한 인간 췌장 베타 세포 견본에서 결정적인 한정된 생물학 물자에서 mitophagy의 분석을 허용합니다.

근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화

여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

이 연구는 암소 생리학 및 아슬레 면역 세포 상호 작용의 연구에 살아있는 췌장 조직 조각의 응용 프로그램을 제시한다.

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

이 프로토콜은 거의 생리학적 조건에서 세포 기능을 연구하기 위해 사망한 장기 기증자로부터 인간 췌장 절편을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 혁신적인 접근법은 정상 및 구조적으로 손상된 섬과 내분비 구획 간의 복잡한 상호 작용을 조사할 수 있게 합니다.

내분비 및 외분비 췌장 생리학을 연구하기 위해 인간 췌장 조직 절편 생성

우리는 쥐 맥락막신경총에서 인슐린 수용체 이성질체 IR-A 및 IR-B를 매핑하기 위해 Duplex in situ hybridization assay를 구축하여 기존 방법의 한계를 극복했습니다. 이 고해상도 접근법은 동형(isoform) 특이적 발현을 밝혀 뇌 인슐린 신호전달에 대한 새로운 통찰력과 신경 장애에 대한 잠재적인 동형(isoform) 표적 치료에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

RNA In Situ Hybridization Assay를 사용한 쥐 뇌의 인슐린 수용체 A 및 B의 정확한 시각화

학습하세요 콘포칼 현미경을 이용한 pHluorin 기법으로 췌도 섬에서 인슐린 과립 외배출을 실시간으로 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 당뇨병 연구에서 인슐린 분비 조절 메커니즘을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법

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