Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법

이 분석의 전체적인 목표는 공초점 현미경을 통해 손상되지 않은 췌도에서 인슐린 과립의 엑소사이토시스를 실시간으로 시각화하는 것입니다. 이 방법은 당뇨병 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 제시할 것입니다. 예를 들어, 무엇이 인슐린 엑소사이토시스를 조절하는가와 같은 질문입니다.

과립 융합은 베타 세포의 생애에서 가장 중요한 단일 사건이기 때문에 이는 매우 결정적입니다. 이 기술의 주요 장점은 온전한 췌도(islet)를 사용할 수 있어, 세포가 원래의 환경에 있는 상태에서 융합 사건을 관찰할 수 있다는 점입니다. 저희 실험실의 박사 과정 학생인 Madina Mahkmutova가 이 기술을 시연할 예정입니다.

췌도 도착 즉시 50 mL falcon 튜브로 옮긴 후, 췌도 현탁액을 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리합니다. 튜브 바닥에 췌도가 모이면, 이를 2 mL의 CMRL 배양이 포함된 35 mm 비조직배양 처리 페트리 접시에 옮기고, 바이러스 감염 전 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 분리 후, 약 mouse pancreatic islet equivalents를 2 mL의 CMRL 배양액에 재현탁하여 35 mm 비조직배양 페트리 접시에 옮깁니다.

바이러스 감염 전, 조직을 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 바이러스 감염을 수행하려면, 2 mL의 CMRL 배양이 포함된 인간 또는 생쥐 췌도 세포가 담긴 각 35 mm 페트리 접시에 5~10 µL의 스톡 바이러스를 첨가합니다. 췌도 세포를 24시간 동안 배양한 후, 배지를 흡입하여 제거하고 바이러스가 없는 2 mL의 CMRL 배양액으로 교체합니다.

배지를 3일마다 교체하며 소도를 4~6일 동안 배양합니다. 여기에 나열된 시약들을 혼합하여 세포외 용액을 준비한 후, 완충액을 여과 멸균합니다. 50 mL의 세포외 용액에 2 M 포도당 스톡 75 µL를 첨가하여 최종 포도당 농도가 3 mM인 기초 포도당 배지를 만듭니다.

그런 다음 최종 포도당 농도가 16 millimolar인 고혈당 배지를 준비하려면, 50 milliliters의 세포 외 용액에 2 molar 포도당 스톡 400 microliters를 추가합니다. 추가적인 자극제와 3 millimolar 포도당을 포함하는 세포 외 용액을 희석합니다. 실험을 시작하기 전에 커버슬립을 1 mg/mL poly-d-lysine 용액 30 microliters로 전처리하고 1시간 동안 배양합니다.

그 다음 물을 사용하여 커버슬립을 충분히 헹굽니다. 실험 시작 최소 1시간 전에, 일부 췌도 그룹을 3mM 포도당이 포함된 세포외 용액이 담긴 35mm 페트리 접시로 옮깁니다. 나머지 췌도는 37°C, 5% CO₂ 조건에서 유지합니다.

실험 시작 30분 전에 실리콘 그리스를 사용하여 커버 슬립을 이미징 챔버에 밀봉하여 부착합니다. 그런 다음 이미징 챔버를 이미징 플랫폼에 고정합니다. 다음으로, 피펫을 사용하여 20~30개의 islet을 커버 슬립의 poly-d-lysine 처리 영역으로 옮기고, islet이 표면에 부착되도록 20분 동안 둡니다.

이 단계는 실험의 성공을 위해 매우 중요하며, 10 µL 미만의 버퍼에 약 20~30개의 islet을 수집하고 20분 동안 기다립니다. islet의 손상을 방지하기 위해 커버슬립이 완전히 마르지 않도록 하는 것이 중요합니다. islet이 커버슬립에 부착되는 동안, 물을 사용하여 관류 시스템을 철저히 세척하여 준비합니다.

그런 다음 이 표에 따라 각 용액을 서로 다른 채널에 추가합니다. 각 채널을 개별적으로 열고 용액을 몇 분 동안 흐르게 하여 시스템에서 모든 기포를 제거합니다. 흐름이 일정하고 튜빙에 누수가 없는지 확인하십시오.

다음으로, 단일 인라인 용액 가열기를 관류 배출 튜브에 연결하고 유출되는 버퍼의 온도를 37 °C로 조절합니다. 그런 다음, 흡입 펌프를 준비합니다. 튜브를 연결하고 펌프를 켜서 액체가 제대로 흡입되고 있는지 확인합니다.

islet이 놓인 이미징 플랫폼을 현미경 스테이지 위에 올리고, 관류 시스템 및 흡입 펌프에 연결합니다. 그런 다음, 3mM glucose가 포함된 세포외 용액으로 이미징 챔버를 조심스럽게 채웁니다. 공초점 이미징을 수행하려면 저배율로 현미경 시야에서 islet의 위치를 찾습니다.

췌도에 초점을 맞춘 후, 더 높은 배율의 대물렌즈로 전환하십시오. 획득 소프트웨어를 실행하고 상주 스캐닝 모드를 활성화하십시오. xyzt 이미징을 선택한 다음, 획득 설정을 구성하기 위해 아르곤 레이저를 켜고 30%로 설정한 후, 488 nanometer 레이저 라인을 선택하여 pHluorin 들뜸을 위해 레이저 출력을 약 50%로 조정하십시오.

EGFP 방출 스펙트럼을 가이드로 사용하여 505에서 555 nanometers 범위에서 방출광을 수집하십시오. 해상도는 512 by 512 pixels로 선택하십시오. live 버튼을 눌러 이미징을 시작하고 게인(gain) 레벨을 조정하십시오.

islet의 상단에 초점을 맞추고 begin을 선택하여 z-stack의 시작 지점을 설정한 다음, 초점을 맞출 수 있는 마지막 평면으로 이동하여 n을 선택하여 종료 지점을 설정합니다. z-stack 크기를 5 µm로 선택합니다. 각 z-stack 획득을 위한 시간 간격을 1.5에서 2초 정도로 설정하고, 연속 이미징을 위해 acquire until stopped 옵션을 선택합니다.

그런 다음, 시작 버튼을 눌러 이미징을 초기화합니다. 과립 엑소사이토시스를 유도하기 위한 자극 프로토콜은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 내장 스캐너를 사용하여 췌도(islet)의 공초점 이미지를 2초 미만의 타임랩스 기록으로 획득합니다.

또한, 이 기술은 막 전위 또는 세포질 유리 칼슘 염료와 같은 기능적 이미징용 염료와 결합할 수 있습니다. NP Y-pHluorin이 인슐린 과립 동역학을 모니터링하는 데 실제로 적합한 도구인지 확인하기 위해, 감염된 췌도에 NP Y-pHluorin을 위한 GFP 항체와 췌도 호르몬인 인슐린, 소마토스타틴 또는 글루카곤에 대한 항체로 면역 염색을 수행했습니다. NP Y-pHluorin을 발현하는 대부분의 세포는 인슐린 또한 발현하였으므로 베타 세포였습니다.

극소수의 글루카곤 양성 알파 세포 또는 소마토스타틴 양성 델타 세포만이 GFP로 표지되었습니다. 중요한 점은, 감염된 세포에서 NP Y 융합 단백질이 인슐린과 공국소화되었다는 것입니다. 이 그림은 pHluorin이 효과적인 pH 센서임을 보여줍니다.

50 millimolar 염화암모늄을 사용하여 세포 내 pH를 높인 결과, 세포 내 형광이 500% 이상 증가하였습니다. 융합 공극(fusion pore)이 열리며 세포막과 융합될 때 과립 내부의 pH가 증가하므로, KCl을 이용한 막 탈분극과 같이 인슐린 엑소사이토시스를 자극하는 조건에서 NPY-pHluorin을 함유한 과립이 관찰됩니다. NPY-pHluorin이 감염된 섬세포의 공초점 타임랩스 이미징을 통해, 온전한 섬세포 내 베타 세포에서 발생하는 개별 분비 사건을 시각화할 수 있습니다.

이러한 현상은 염화칼륨에 의한 직접적인 세포막 탈분극 또는 여러 다른 생리학적 자극에 반응하여 발생합니다. 기저 세포외 포도당 농도에서는 분비 활동이 거의 관찰되지 않습니다. 하지만 고농도 포도당 자극에 반응하여 과립과 세포막의 융합이 유도됩니다.

이 절차를 마친 후, 세포의 특정 영역에서 왜 과립 융합이 일어나는지와 같은 추가적인 의문에 답하기 위해 면역조직화학과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술이 개발된 이후, 인간 췌도 내 베타 세포 집단에서 인슐린 과립 분비의 시간적 패턴을 탐구하는 데 사용되어 왔습니다.